MICROPROPAGAÇÃO DA AROEIRA (Myracrodruon urundeuva Fr. All) 1. MICROPROPAGATION OF Myracrodruon urundeuva Fr. All

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1 MICROPROPAGAÇÃO DA AROEIRA (Myracrodruon urundeuva Fr. All) 1 MIGUEL WANDERLEY DE ANDRADE 2 JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ 3 ARY SANTANA LACERDA 3 PEDRO RENATO A. DE MELO 4 RESUMO - A aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All) é uma Anacardiaceae lenhosa que tem sido usada de forma predatória pela qualidade de sua madeira e pelo uso medicinal de sua casca desprovida de súber, por meio da qual se fabrica antiinflamatório. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento in vitro e a micropropagação desta espécie. Sementes de aroeira foram desinfestadas e inoculadas em meio MS (Murashige e Skoog, 1962), sem reguladores de crescimento e as plântulas obtidas serviram como fonte de explantes. Os segmentos cotiledonar, internodal, nodal e apical foram inoculados em meio MS modificado e suplementado com combinações de BAP, ANA e cinetina (CIN). A multiplicação de brotações foi feita a partir de segmentos nodal e apical inoculados no mesmo meio adicionado de 0,0; 2,7; 4,5 e 6,7 µm de BAP, e para o enraizamento, utilizou-se ANA nas concentrações de 0,0; 2,7; 3,8; 4,8 e 6,5 µm. As combinações 54,0µM ANA + 35,0 ou 46,5µM CIN induziram e promoveram, nos segmentos cotiledonares, o desenvolvimento de calos em 62,5 e 36%, respectivamente, e nos internodais, as maiores porcentagens ocorreram nas combinações 27,0µM ANA + 22,0BAP e 54,0µM ANA + 56,0µM CIN, com 85 e 71,4%, respectivamente. Os segmentos nodal e apical tiveram 90% de regeneração e o maior comprimento da brotação (6,3 cm), no meio com 4,5 µm de BAP e 4,8 µm de ANA, promoveu 85,5% de plântulas enraizadas. Essas plantas foram aclimatadas, chegando a 80% de sobrevivência. Com base nesses resultados, a propagação in vitro da aroeira é possível e pode ainda dar suporte a outros projetos envolvendo outras técnicas de biotecnologia. TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Myracrodruon urundeuva Fr. All., micropropagação, plantas medicinais, aroeira. MICROPROPAGATION OF Myracrodruon urundeuva Fr. All ABSTRACT - Myracrodruon urundeuva (Anacardiaceae), is a wood plant popularly known as Aroeira, and it has been used in a predatory way because its high quality wood and the cortex is commonly used as an antiinflammatory, in the natural medicine. This research aimed at the in vitro stablishiment and micropropagation of this species. Seeds were fumigated and inoculated in Murashige e Skoog media, without growth regulators. Seedling obtained from those seeds were used as explants sources. Segments of the cotyledon, inter-node, nodal and apical portion were transferred to modified MS media, supplemented with different mixtures of BAP, NAA e quinetin (KIN). The multiplication was done with nodal and apical segments inoculated in the same modified media, supplemented with BAP (0,0; 2,7; 4,5 and 6,7 µm), and to the root formation used ANA INDEX TERMS: Myracrodruon urundeuva, micropropagation, medicinal plants. (0,0; 2,7; 3,8; 4,8 and 6,5 µm). The mixtures of NAA 54,0µM and KIN 35,0 or 46,5µM induced and promoted 62,5 e 36% callus development in the cotyledon segment, respectivaly and in the inter-node segment, the combinations NAA 27,0µM + BAP22,0µM and NAA 54,0µM + KIN 56,0µM, induced and promoted 85 and 71,4% callus development, respectivaly. Nodal and apical segments presented 90% of the regeneration and shoots with 6,3 cm when media with 4,5 µm BAP was used. The best root formation was obtained using media with 4,8 µm NAA, which promoted root formation in 85,5% of the seedlings. Those plants were acclimatized, with 80% survival plants. On the basis of the obtained results, the in vitro production of Myracrodruon urundeuva is possible and will suport projects with other biotecnology techniques. 1. Parte da dissertação apresentada à Universidade Federal do Ceará (UFC), pelo primeiro autor, para obtenção do título de Mestre em Agronomia, Área de concentração em Fitotecnia. 2. Engenheiro Agrônomo, Escola Agrotécnica Federal de Sousa-PB, EAFS. Caixa Postal 49, Sousa - PB, Professor Adjunto, Depto. Agronomia, UFU. Caixa Postal 593, Campus Umuarama, Uberlândia-MG, Estudante de Agronomia, UFC, bolsista de iniciação científica.

2 175 INTRODUÇÃO A aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All ) é uma Anacardiaceae de ocorrência natural desde o Ceará até a Argentina e o Paraguai, sendo encontrada em formações vegetais de caatinga, cerrado e floresta pluvial. É uma árvore caducifólia, cujo porte varia correspondentemente com a região onde é encontrada. A madeira é pardo-avermelhada, com sabor adstringente, muito dura e imputrescível, sendo preferida para utilização na indústria civil. A casca é subdividida em placas nos troncos mais velhos, sendo íntegra nas árvores jovens, encerrando 15% de tanino, usado na indústria de curtume. Além das utilizações citadas, a aroeira possui um crescente uso farmacológico, pois na sua entrecasca foram constados 7 componentes fitoquímicos, dos quais 2 chalconasdiméricas naturais, que possuem a propriedade de antiinflamatório e foram denominadas Urundeuveína A e B (Viana, Matos e Bandeira et al., 1995). Pelo uso intensivo, a aroeira acha-se na lista oficial de espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção, na categoria vulnerável, e nesse contexto, as técnicas de micropropagação são importantes ferramentas para preservação de plantas, além de dar suporte a projetos com outras técnicas de biotecnologia. Porém, as plantas lenhosas apresentam maiores dificuldades para o estabelecimento in vitro, principalmente por crescerem no campo por muitos anos e serem rotineiramente infectadas por microorganismos, interna e externamente, que são difíceis de controlar e a desinfecção pode trazer simultaneamente danos ou mesmo morte do tecido (Skirvin, 1981; Bonga, 1982). Pelo exposto, torna-se mais fácil trabalhar com plântulas já germinadas em condições assépticas. Outro problema ainda maior na iniciação de culturas lenhosas é a ocorrência de compostos fenólicos, que podem estar ligados a processos de regulação de crescimento, especialmente com as auxinas que, dependendo da concentração endógena no tecido, resulta na indução desses compostos (Thomas e Ravindra, 1997). Nas plantas lenhosas, principalmente, acumulam-se polifenóis e produtos de oxidação, como melanina, suberina, lignina, cutina e calose em torno da superfície excisada, os quais modificam a composição do meio de cultivo e a absorção de metabólitos. Este trabalho teve como objetivo testar concentrações de fitorreguladores, visando ao estudo morfogenético em explantes oriundos de sementes germinadas in vitro e estabelecer uma metodologia de micropropagação, o que possibilitará a multiplicação in vitro da aroeira. MATERIAL E MÉTODOS Os frutos-semente tiveram sua superfície limpa com água e algumas gotas de detergente e foram desinfestados com imersão em álcool 70% por 30 segundos, seguido de hipoclorito de sódio 1% por 10 minutos e lavados 3 vezes em água destilada. Em seguida, foram acondicionados sobre um papel-toalha levemente umedecido, em placas de Petri, previamente esterilizadas. As placas foram colocadas no escuro por 2 dias, período em que se iniciava a emissão da radícula e, então, as sementes, em câmara de fluxo laminar, foram transferidas individualmente para tubo de ensaio contendo o meio MS (Murashige e Skoog, 1962) com a metade da concentração dos sais, sem reguladores de crescimento, com 26 o C e 16 horas de luz. Após a germinação e desenvolvimento, as plântulas obtidas serviram como fonte de explantes, sendo os segmentos cotiledonar (5 x 5 mm), internodal (5 mm), nodal e apical (10 mm). Todos foram inoculados em meio MS modificado (Tabela 1), com a metade dos sais acrescida de reguladores de crescimento, conforme os seguintes tratamentos: 4,5µM BAP; 9,0µM BAP; 27µM ANA+11µM BAP; 27µM ANA+22µM BAP; 27µM ANA+23µM CIN; 27µM ANA+46µM CIN; 54µM ANA+35µM CIN; 54µM ANA+46µM CIN e 54µM ANA+56 µm CIN. Os explantes foram inoculados em posição horizontal sobre a superfície do meio. Cada tratamento constou de 4 repetições com 10 tubos por parcela. O material foi colocado em sala de crescimento, e aos 30 dias após a inoculação, foram avaliados a porcentagem de brotações, tamanho dos brotos, ocorrência ou não de enraizamento e a presença de calos. Para multiplicação in vitro, foi feito um experimento cujos explantes consistiram de segmentos nodais e apicais, com aproximadamente 1 a 1,5 cm de comprimento, provenientes das brotações obtidas em um tratamento determinado no experimento anterior. Os segmentos apicais foram mantidos com o par de folhas definitivas. Cada um dos segmentos foi imerso em água esterilizada por 1 hora e, em seguida, foi inoculado em meio MS com as modificações do experimento anterior, acrescido de BAP (0,0; 2,3; 4,5 e 6,7µM), formando um esquema fatorial 2 x 4, totalizando 8 tratamentos, com 4 repetições e 5 explantes por parcela. O material foi colocado em sala de crescimento nas mesmas condições do experimento anterior, porém no escuro durante os primeiros 4 dias. Aos 35 dias após a inoculação, foram avaliados a porcentagem de regeneração, o comprimento médio das brotações regeneradas e a ocorrência ou não de enraizamento.

3 176 TABELA 1 - Composição do meio MS e modificações utilizadas. Componentes Meio MS Modificações (mg/l) (mg/l) Macronutrientes: NH 4 NO KNO CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 7H 2 O KH 2 PO ,7 Micronutrientes: H 3 BO 3 6,2 MnSO 4 H 2 O 16,9 ZnSO 4 7H 2 O 8,6 KI 0,83 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,25 CuSO 4 5H 2 O 0,025 CoCl 2 6H 2 O 0,025 FeEDTA: Na 2 EDTA.2H 2 O 37,3 12,4 FeSO 4.7H 2 O 27,8 9,3 Glicina 2,0 Ácido Nicotínico 0,5 Piridoxina. HCl 0,5 Tiamina. HCl 0,1 Mio-Inositol 100 Sacarose Agar 4.500

4 177 O enraizamento in vitro foi testado a partir das brotações obtidas do experimento de multiplicação, que foram inoculadas no meio MS modificado, acrescido de ANA nas concentrações de (0,0; 3,8; 4,8 e 6,4 µm). Os explantes para multiplicação e enraizamento foram mantidos no escuro, nos 4 primeiros dias, após a inoculação em sala de crescimento. Todos os meios utilizados neste trabalho tiveram o ph ajustado para 5,9 e foram adicionados de 5 g/l de ágar antes de serem autoclavados. A aclimatação iniciou-se com a retirada das plântulas dos tubos de ensaio, e a remoção dos resíduos do meio de cultura foi feita pela lavagem com água destilada; logo após, foi feito o plantio em copos plásticos (200 ml) contendo substrato comercial Plantimax, fechados com saco de polietileno transparente e colocados em sombrite (50 %) à temperatura ambiente. Quando atingiam o tamanho de 15 cm, foram transferidos para saco plástico de polietileno com capacidade para 3 litros, com um substrato constituído de composto orgânico, terriço e areia, na proporção de 1:1:1. RESULTADOS E DISCUSSÃO A desinfestação das sementes apresentou 57,5% de germinação e nenhum tipo de contaminante. Esse resultado pode ser considerado satisfatório, pois em condições de laboratório, Carvalho (1994) alcançou 65% de germinação de sementes de aroeira que não passaram por qualquer tratamento envolvendo álcool e hipoclorito, que geralmente acarretam a diminuição da percentagem de germinação. O início da germinação se deu aos 2 dias após o acondicionamento na placa de Petri e o estágio de plântulas foi alcançado ao final da primeira semana após a inoculação in vitro, e aos 15 dias já havia ocorrido a emissão dos folíolos iniciais. As modificações no meio MS foram feitas de maneira a ajustar os macronutrientes e o FeEDTA, visando a evitar oxidação dos explantes. Os segmentos internodal e cotiledonar apresentaram, em praticamente todas as combinações de ANA com BAP ou CIN, a formação de calos, principalmente para o segmento internodal nos tratamentos com altas concentrações de BAP (11 e 22 µm) e Cinetina (56 µm), tendo 71, 85 e 71,4% de formação de calos, respectivamente. Para cotilédones, as maiores porcentagens de calos ocorreram nas combinações de ANA (27µM)+ BAP (11µM) e ANA (54µM)+KIN (35.0 µm) com 77 e 62,5% de calos formados, respectivamente. Não houve qualquer formação de brotos nesses explantes (Tabela 2). É comum a formação de calos nesses explantes e em meios com altas doses de reguladores de crescimento (Gratapaglia e Machado, 1990). Com relação às combinações de ANA com CIN e BAP, os segmentos nodal e apical tiveram pouca formação de brotos, pois os explantes tornavam-se necróticos e morriam. Essa pequena regeneração ocorreu em função da alta relação entre auxina e citocinina, o que normalmente leva à maior formação de raízes em detrimento à formação de parte aérea, o que pode ser verificado nas combinações 54 µm ANA + 35 ou 56 µm CIN e 27 µm ANA + 46 µm KIN, nas quais ocorreram o enraizamento. Por outro lado, no tratamento com 4,5 µm de BAP, os segmentos nodal e apical tiveram em média 90% de regeneração direta, sendo uma brotação por explante, de tamanho médio de 1,3 cm. Esse tratamento passou a ser o utilizado para o estabelecimento in vitro do material a partir de segmentos nodal e apical. (Tabela 2). Em relação ao experimento de multiplicação, o desenvolvimento dos segmentos nodal e apical, independente da concentração de BAP, teve início a partir do 4 o dia após a inoculação e não diferiram significativamente entre eles com relação às porcentagens de desenvolvimento, sendo 97 e 99% de explantes desenvolvidos em brotação única, nos segmentos nodal e apical, respectivamente. Esse desenvolvimento dos segmentos nodal e apical está ligado ao fato de os mesmos terem pontos de crescimento ativo, gemas e ápice caulinar. Segundo Hussey (1986), explantes desse tipo normalmente apresentam boa regeneração. Aos 35 dias, também não houve diferença significativa entre os segmentos inoculados, para o comprimento da brotação obtida, mas houve efeito significativo da concentração de BAP no meio, para essa característica (Tabela 3), sendo que o comprimento da brotação aumentou conforme elevaram-se os níveis de BAP, tendo um comportamento linear conforme a Figura 1. Mas, no tratamento com 4,5 um, alcançou-se a maior média (6,3 cm). A partir dessa concentração de BAP, observou-se uma tendência de queda no comprimento da parte aérea obtida, sendo 5,8 cm na concentração de 6,7 um de BAP. A tendência de diminuição do comprimento da brotação, após 4,5 um de BAP, pode estar ligada ao fato de que as citocininas estimulam a maior produção de partes aéreas até uma determinada concentração, o que varia de acordo com a espécie, e a partir desta, ocorre um efeito tóxico, que se caracteriza, entre outros, pela falta de alongamento das culturas (Gratapaglia e Machado, 1998). O tratamento em questão, 4,5 um de BAP, passou a ser o utilizado para a multiplicação e posterior enraizamento das plantas obtidas. Em cada brotação obteve-se de 3 a 6 segmentos nodais, além do apical.

5 178 TABELA 2 - Respostas de explantes de aroeira em diferentes combinações de reguladores de crescimento, Fortaleza, UFC, Tratamento Cotiledonar Internodal Explante/resposta Nodal e Apical Brotação Enraizamento µm % calos % calos % regeneração (mm) % 4,5 BAP ,0 BAP ANA+11 BAP ANA+22 BAP ANA+23 KIN 12, ANA+46 KIN 12, ANA+35 KIN 62, ANA+46 KIN ANA+56 KIN 12,5 71, ,2 Tabela 3 - Quadro de análise de variância para comprimento da parte aérea aos 35 dias de explantes de aroeira em diferentes concentrações de BAP, Fortaleza, UFC, Causas de variação GL Quadrados médios e significância Comprimento da parte aérea aos 35 dias Explante Bap * Explante X BAP Resíduo CV(%) 35.3 Média 5.1 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade

6 179 Comprimento da brotação (cm) ,3 4,5 6,7 BAP (um) Y=0,3727X + 3,8611 R 2 **=76,4 FIGURA 1 - Efeito de diferentes concentrações de BAP para comprimento da parte aérea de explantes de aroeira cultivados in vitro aos 35 dias, considerando dados em conjunto dos segmentos nodal e apical, Fortaleza, UFC, Os segmentos nodais, de maneira geral, apresentaram maiores níveis de oxidação, principalmente no meio contendo 6,6 µm de BAP. A oxidação basal do explante é um ponto que deve ser observado, pois causa dano, fazendo com que a planta não absorva os nutrientes do meio, sobretudo os reguladores de crescimento. Vieitez (1980) relata as dificuldades em propagar explantes nodais, devido à oxidação que ocorre nesses segmentos. Outra constatação neste experimento de multiplicação foi a presença de raízes em 70 e 10% dos segmentos apical e nodal, respectivamente, inoculados no tratamento com 0,0 µm de BAP. O maior enraizamento no segmento apical ocorreu provavelmente pela presença de folhas neste explante, e estas são promotoras do enraizamento, pois auxinas, carboidratos e outros fatores são translocados do ápice para a base do explante (Breen e Muraoka, 1974). Com relação ao experimento de enraizamento, verificou-se que o melhor desenvolvimento radicular ocorreu no meio com 4,8 µm de ANA, chegando a 85,5% de plântulas enraizadas, com raízes de até 17 mm de comprimento médio; as concentrações de 2,7 e 3,8 µm promoveram 57% de enraizamento, sendo que os piores resultados ocorreram nos demais tratamentos, na ausência de ANA e na maior concentração desse regulador (6,5 µm), que tiveram um desenvolvimento de raízes de 35 e 28,5%, respectivamente (Tabela 4). O menor enraizamento na ausência de ANA deve estar ligado à necessidade de auxina exógena para estimular a rizogênese, o que, segundo Gratapaglia e Machado (1998), é comum em partes aéreas provenientes da multiplicação. Pelo fato de a maior concentração de ANA (6,5 µm) ter promovido o pior enraizamento, esses mesmos autores afirmam que quando a concentração de auxina no meio é excessiva, ocorre uma formação de calo na base do explante, comprometendo a rizogênese e o crescimento da parte aérea. A aclimatação das plantas em uma primeira etapa obteve apenas 30% de sobrevivência das plantas, até o plantio em vaso. A alta perda de plantas teve como causa mais provável o alto índice de podridão do colo e conseqüente morte das plantas, o que indicou que o substrato não estava devidamente esterilizado, o que, aliado à alta umidade no ambiente do saco plástico, levou a tal situação. Outro grupo de 15 plantas foi aclimatado, tendo índice de 80% de sobrevivência, já que, desta vez, o substrato provavelmente estava isento de patógenos. Outro cuidado foi a retirada do saco plástico aos 10 dias e não mais aos 15 dias após o transplantio.

7 180 TABELA 4 - Efeito do regulador de crescimento (ANA) sobre a porcentagem de enraizamento e comprimento das raízes de explantes de aroeira cultivados in vitro, Fortaleza, UFC, ANA µm Enraizamento (%) Comprimento raiz(mm) 0, , , ,8 85,5 17 6,5 28,5 14 CONCLUSÕES a) Explantes de segmentos nodal e apical foram regenerados e desenvolveram-se em única brotação; b) BAP na concentração de 4,5µM proporcionou um maior tamanho de brotação; c) ANA na concentração de 4,8 µm foi o melhor tratamento para enraizamento das brotações in vitro ; d) A aclimatação de plantas de aroeira obtidas in vitro foi possível, tornando viável a micropropagação dessa espécie. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BONGA, J. M. Tissue culture techniques. In: BONGA, J. M., DURZAN, D. J. Tissue culture in forestry. The Hague: Nijhoff,, p BREEN, P. J., MURAOKA, T. Effect of leaves and carbohydrate content and movement of 14 C - assimilate in plum cuttings. Journal of American Society for Horticulture Science, Alexandria, v.99, n.4, p , July CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: EMBRAPA/CNPF, p. GRATTAPAGLIA, D., MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C., CALDAS, L. S. Técnicas e aplicações da cultura de tecidos em plantas. Brasília: ABCTP/EMBRAPA/CNPH, p GRATTAPAGLIA, D., MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C., CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA/CBAB, p HUSSEY, G. Vegetative propagation of plants by tissue culture. Plant Cell Culture Technology. Oxford. v. 23, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tobaco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v.15, p , SKIRVIN, R. M. Frut. crops. In: CONGER, B.V. Cloning agricultural plants via in vitro techniques. Boca Raton: CRC Press, p THOMAS, P., RAVINDRA, M. B. Shoot tip culture in mango: influence of medium, genotype, explant factors, season and decontamination treatments on phenolic exudation, explant survival and axemic culture establishment. Journal of Horticulturte Science, Bangalore, v.72, n.5, p , Sept VIANA, G. S. B., MATOS, J. A., BANDEIRA, M. A. M., RAO, V. S. N. Aroeira-do-sertão: estudo botânico, farmacognóstico, químico e farmacológico. Fortaleza: UFC, p. VIEITEZ, A. M., VIEITEZ, E. Plantlet formation from embryonic tissue of chestnut grown in vitro. Physiologia plantarum, Copenhagen, v. 50, n.2, p , Oct