EFEITO DO USO DE DIFERENTES ANTIBIÓTICOS NO CONTROLE BACTERIANO DO EJACULADO DO VARRÃO

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1 Ciência Animal, 11(1):33-38, 2001 EFEITO DO USO DE DIFERENTES ANTIBIÓTICOS NO CONTROLE BACTERIANO DO EJACULADO DO VARRÃO (The effect of different antibiotics on bacterial control of boar ejaculation) Ricardo TONIOLLI*, Robério Ferreira FIÚZA, Paola Capibaribe JATAHY, Daniel Queiroz BARROS & Breno Sampaio SANTOS Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen - FAVET/UECE RESUMO O uso de antimicrobianos nos meios diluidores com a finalidade de controlar o desenvolvimento bacteriano tem sido uma prática muito utilizada, possibilitando o aumento do tempo de estocagem do ejaculado. O sêmen de 4 varrões foi coletado fomando-se quatro lotes experimentais: 1) gentamicina; 2) neomicina; 3) penicilina/ estreptomicina; 4) Sem antibiótico. Todos os ejaculados foram diluídos em todos lotes e conservados a 17 o C por 8 dias, com análises nos dias D1 e D8. O sêmen puro foi diluído de 10-1 a 10-4 para posterior inoculação em placas de Petri estéreis com ágar nutriente. As placas foram inoculadas (0,1 ml) e incubadas a 37 º C durante 48 h. O resultado da contagem foi expresso em Unidade Formadora de Colônia. As análises das diferenças entre médias foram feitas pelo teste de Student. Os melhores resultados foram observados com a gentamicina (4,2 x 10 5 colônias/placa), durante todo o período de conservação do sêmen, demonstrando seu melhor poder antimicrobiano e diminuindo o número de colônias de bactérias (4,2 x 10 5 colônias/placa em D0 para 3,3 x 10 5 colônias/placa em D8). O lote sem antibiótico apresentou os resultados mais fracos, com um maior número de colônias de bactérias 10,4 x 10 5 (D1) e 11,0 x 10 5 (D8) colônias por placa. A combinação dos antibióticos penicilina e estreptomicina apresentou resultados semelhantes aos do lote controle (7,9 x 10 5 colônias/placa/d1 e 8,4 x 10 5 colônias/placa/d8). A neomicina demonstrou também ser um bom agente antimicrobiano para o sêmen de suíno, quando utilizado nas primeiras 24 h após a colheita. Os antibióticos neomocina e penicilina/ estreptomicina, não foram capazes de impedir o avanço do desenvolvimento bacteriano no sêmen diluído. Necessário se faz o uso de antibiótico no meio diluidor do sêmen suíno quando se pretende estocá-lo por alguns dias. PALAVRAS-CHAVE : antibióticos, controle bacteriano, sêmen suíno ABSTRACT The use of antibiotics in the means extender, with the purpose of bacterial development control, has been a very used practice, facilitating the increase of the conservation time of semen. The semen of 4 boars was collected to four experimental groups: 1) gentamicin; 2) neomicin; 3) penicilin/streptomicin; 4) without antibiotic. All ejaculates were diluted in all groups and conserved at 17 o C for 8 days, with analyses on D1 and D8. The raw semen was diluted until the proportion of 10-4 for posterior inoculation in sterile Petri dish with nutritious agar medium. The dishes were inoculated (0,1 ml) and incubated at 37ºC for 48 h. The results were expressed in Colony Formator Units. The analyses of the differences between means were made by the Student t-test. The best results, were observed with gentamicin (4.2 x 10 5 colonies/dish), during the conservation period of the semen, demonstrating its best power of the bacteria colony control (4.2 x 10 5 colonies/dish in D0 for 3.3 x 10 5 colonies/plates in D8). * Autor para correspondência Av. Paranjana, Fortaleza, CE toniolli@roadnet.com.br 33

2 The group without antibiotic, presented the insipid results, with a larger number of bacteria colonies, 10.4 x10 5 (D1) and 11.0 x 10 5 (D8) colonies per dish. The combination of penicillin and estreptomicin presented similar results to the control group (7.9 x 10 5 colonies/dish/d1 and 8.4 x 10 5 colonies/dish/d8). Neomicin was also a good antimicrobian agent for the swine semen, when used in the first 24 h after the collection. Neomocin and penicilin/streptomicin, were not capable of obstructing the progress of bacterial development in the diluted semen. The use of the antibiotic in the diluion medium was necessary during conservation period of swine semen. KEY WORDS: antibiotics, bacterial control, swine semen INTRODUÇÃO O interesse crescente pela inseminação artificial tem levado os pesquisadores a estudarem técnicas que viabilizem a conservação de sêmen suíno por longos períodos sem comprometer, no entanto, a sua capacidade de fertilização (KEMP & SOEDE, 1997). A redução da motilidade e os danos no acrossoma da célula espermática podem ser observados, em decorrência do crescimento bacteriano, no meio diluidor do sêmen (ZAGORSKI et al., 1972). Por este motivo, o uso de antimicrobianos (ATMs) nos meios diluidores tem sido uma prática muito utilizada, possibilitando o aumento do tempo de estocagem do ejaculado (POOLPERM et al., 1998). Os ATMs são empregados no controle do desenvolvimento bacteriano no sêmen suíno durante o período de armazenamento in vitro (GOPALKRISHNAN et al., 1994), sendo a gentamicina um dos antibióticos mais utilizados para esta finalidade (SONE, 1982). O uso da inseminação artificial (IA) com sêmen resfriado na espécie suína, como uma biotécnica para aumentar a produtividade e a rentabilidade do rebanho, teve uma evolução lenta mas gradativa na última década (BORTOLOZZO & WENTZ, 1998), sendo este incremento, principalmente devido à expansão através dos programas internos ou fechados (SONE, 1982; BENNEMANN et al., 1997). A otimização do seu uso deve levar em consideração três principais fatores: a qualidade da dose de sêmen utilizada; a IA propriamente dita e o manejo pós-inseminação dado à fêmea (FLOWERS, 1996). Os fatores inerentes à tecnologia de sêmen empregada que influenciam na qualidade da dose inseminante, estão normalmente associados à colheita e manipulação do ejaculado e ao armazenamento da dose inseminante (BORTOLOZZO & WENTZ, 1997). A falta de higienização do macho na pré-colheita bem como o método de colheita utilizado, podem refletir na qualidade bacteriológica da dose inseminante produzida (ALTHOUSE et al., 1998). No entanto, a colheita de um ejaculado livre de contaminação na rotina das centrais é praticamente impossível (WALTZ et al., 1968). Vários autores têm demonstrado que a Escherichia coli e outras bactérias como o Streptococcus sp. afetam de forma significativa a qualidade espermática, principalmente no que se refere a sua motilidade (AUROUX et al., 1991; RIDEOUT et al., 1982; DIEMER et al., 1996; BENNEMANN et al., 1999). O decrescente desenvolvimento bacteriano durante o período de conservação do sêmen, pode estar relacionado a modificações do meio diluidor durante este período (CHANSILPA, 1987). SHELBY & FOLEY (1996), demonstraram que este fato pode ser também explicado por um possível efeito antimicrobiano exercido pelo plasma seminal. A presença de concentrações elevadas de bactérias no sêmen podem exercer um efeito tóxico sobre os espermatozóides e colocar em risco de contaminação as fêmeas inseminadas. Reduzindo-se estas concentrações, os antibióticos desempenham um importante papel na inseminação artificial, particularmente em suínos, devido ao prolongado tempo de estocagem necessário em temperaturas relativamente altas (GOFFAUX et al., 1990). Este trabalho teve por objetivo verificar a formação de colônias de bactérias nas doses de sêmen preparadas para inseminação artificial e o seu controle pelo uso de diferentes antibióticos presentes nos meios diluidores. 34

3 MATERIAL E MÉTODOS Colheita e ejaculados O sêmen de 4 varrões, com idade variando entre 12 e 48 meses, foi coletado uma vez por semana durante dez semanas, através da técnica da mão enluvada, em recipiente plástico (500 ml) protegido por copo térmico. Cada reprodutor foi avaliado conforme sua saúde e libido e após cada coleta, foi feita a medida de concentração, volume, total de espermatozóides e temperatura do sêmen para cada ejaculado de cada animal. Os machos foram alimentados com 2 kg de ração por dia (em dois arraçoamentos), receberam água ad libitum e foram soltos diariamente pelo período da manhã em piquetes de terra. Tratamentos experimentais Foram testados quatro tratamentos (lotes experimentais) com os diferentes antibióticos a serem usados. Diferentes antibióticos foram testados dentro dos diluidores de Beltsville (lotes 1 e 2) e água de coco (lote 3). Tratamento 1 - Gentamicina base (BTS-G) 1 ; Tratamento 2 - Sulfato de neomicina (BTS-N) 2 ; Tratamento 3 - Penicilina G benzatina/procaina/ potássica (1.000 UI/L) e sulfato estreptomicina (1 g/ L) (ACA); Tratamento 4 - Sem antibiótico (ACE - controle). Diluição, inoculação e contagem Cada ejaculado foi inicialmente fracionado em quatro alíquotas diluídas de acordo com os tratamentos estabelecidos para efeito da verificação dos níveis de contaminação e poder de controle anti-microbiano dos diferentes antibióticos presentes nos mesmos. As amostras foram conservadas durante oito dias em geladeira a 17 o C, sendo a contagem das colônias de bactérias feita após a diluição do sêmen, no primeiro (D1) e oitavo (D8) dias pós coleta. Foi feita uma pré-diluição do sêmen puro em tubos de ensaio até a proporção de 10-4 procedendose da seguinte forma: utilizou-se quatro tubos de ensaio contendo 9 ml de água destilada em cada. No primeiro 1 Diluidor BTS com gentamicina IMV do Brasil 2 Diluidor BTS com neomicina Minitub do Brasil tubo, colocou-se 1 ml de sêmen homogeinizando-se a amostra e em seguida, retirou-se 1 ml deste primeiro tubo colocando-o no segundo. Procedeu-se da mesma forma com o terceiro e quarto tubo. Desta quarta diluição retirou-se uma amostra para se proceder a inoculação em placas de Petri. Este procedimento foi repetido em todos os lotes do experimento. Em placas de Petri estéreis, foi colocado 10 ml de ágar nutriente, sendo conservadas em geladeira a 4 o C. Antes de cada inoculação as placas eram retiradas da geladeira e colocadas em estufa a 37 o C, com uma antecedência de 24 h a fim de evitar a permanência de umidade (água de condensação) no seu interior. Uma amostra de 0,1 ml de sêmen resultante da última diluição anteriormente descrita, foi inoculada nas placas. Realizou-se movimentos circulares nas placas com intuito de se obter uma homogeinização do inóculo sobre a superfície do ágar. As placas foram incubadas a 37 o C durante 48 h, após as quais foi procedida a contagem das colônias de bactérias. O resultado da contagem foi expresso em Unidade Formadora de Colônia (UFC) ou número de colônias/ml. A leitura foi feita diretamente sobre a placa de Petri, contando-se o número de colônias de cada uma considerando-se a maior diluição (10-4 ). Como o inóculo foi de 0,1 ml/ placa, adicionou-se o fator de inóculo no caso 1,0, obtendo assim os resultados expressos da seguinte forma: 10 4 x 10 1 = 10 5 UFC/mL de sêmen. Análise estatística Os resultados foram expressos pelas suas médias e desvios-padrão para cada tratamento analisado através do programa de estatística Statview 5.0, sendo a análise de variância entre médias avaliadas pelo teste de Student na qual o efeito antibiótico e a duração da conservação foram considerados fixos; enquanto que os das semanas de coleta e ejaculado (intra-semana) foram considerados aleatórios. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da ação dos diferentes antibióticos utilizados neste experimento podem ser vistos na Tab. 1, onde fica evidente a superioridade da gentamicina (4,2 x 10 5 UFC/mL) sobre os outros no controle da contaminação do ejaculado suíno durante todo o período de conservação do sêmen. Somente na análise 35

4 de D1 as diferenças encontradas em relação aos resultados com o uso da neomicina (5,2 x 10 5 UFC/mL) no meio diluidor, não foram estatisticamente significativas (P>0,05). Segundo SONE (1982) e SONE et al. (1992), a gentamicina é um dos ATMs mais utilizados para o controle do desenvolvimento microbiano com marcada ação antibacteriana. Durante todo o período de conservação do sêmen em geladeira a 17 o C, a gentamicina fez prevalecer seu melhor poder anti-microbiano diminuíndo o número de colônias de bactérias da amostra, reduzindo dos 4,2 x 10 5 UFC/mL em D1, para 3,3 x 10 5 UFC/mL em D8. Apenas no lote contendo este antibiótico houve decréscimo do número de colônias; os demais apresentaram uma elevação após o oitavo dia de conservação. A gentamicina, dentre os antimicrobianos testados, mostrou-se mais adequado às condições de conservação prolongada dos espermatozóides do varrão (MARTIN-RILLO et al., 1984). Este melhor controle do desenvolvimento bacteriano pela gentamicina poderá prolongar o período de conservação do sêmen, uma vez que haverá uma menor competição pelo oxigênio presente no meio diluidor. Entretanto, alguns autores afirmam que a gentamicina tem efeito negativo sobre a motilidade espermática apesar de não apresentar efeito deletério sobre a integridade do acrossoma. Desta forma, o uso deste antibiótico no meio diluidor do sêmen suíno deve ser melhor avaliado afirmam (REIS et al., 1999; GOPALKRISHNAN et al., 1994; KEMP & SOEDE, 1997). Como esperado, o meio diluidor sem antibiótico, lote controle, apresentou os piores resultados, com uma maior contaminação 10,4 x 10 5 e 11,0 x 10 5 UFC/mL, nos dois dias de análise (D1 e D8), respectivamente. Estes resultados demonstraram a necessidade dos ATMs presentes no meio diluidor e a impossibilidade de se colher um ejaculado livre de contaminação, conforme afirmação de WALTZ et al. (1968), entretanto na observação de REIS et al. (1999), é desnecessária a adição de antibióticos na dose inseminante quando a colheita e processamento do ejaculado forem feitos em condições higiênicas apropriadas, levando-se também em consideração o período de estocagem do sêmen. SONE (1982), afirmou ser possível uma redução na contagem de bactérias do sêmen através do impedimento da contaminação do mesmo com secreções prepuciais ou ainda pela lavagem destas secreções antes da coleta. Curiosamente, dentre os lotes contendo ATM na composição dos diluidores, o que combinou a penicilina com a estreptomicina, apresentou os piores resultados (7,9 x10 5 UFC/mL em D1 e 8,4 x10 5 UFC/ ml em D8), os quais não diferiram estatisticamente do lote controle (P>0,05). Por outro lado, as diferenças em relação aos demais lotes dos experimento (1 e 2) foram sempre significativas, durante todo o período de conservação do sêmen. GOFFAUX et al. (1990), obtiveram resultados semelhantes com um efeito mais favorável da gentamicina em relação à penicilina/ estreptomicina, qualquer que fosse o período de conservação do sêmen. Esta conjugação de antibióticos mostrou-se incompetente no controle da contaminação bacteriana da dose inseminante. Apesar do uso corriqueiro desta composição de ATMs, Tabela 1. Quantidade de Unidades Formadoras de Colônias (x10 5 UFC/mL) no sêmen diluído do varrão, tratado por diferentes antibióticos em diferentes períodos de conservação. Tratamentos Lotes Dias de conservação D 1 D 8 Gentamicina 1 4,2 ± 2,8 a 3,3 ± 2,3 a Neomicina 2 5,2 ± 3,5 a 5,8 ± 3,1 b Penicilina estreptomicina 3 7,9 ± 3,3 b 8,4 ± 4,1 c Sem antibiótico 4 10,4 ± 5,1 b 11,0 ± 4,8 c 36

5 PAQUIGNON et al. (1987); SONE (1982) e SONE et al. (1992), demonstraram a fraca atividade antimicrobiana da penicilina/estreptomicina sobre os germes habitualmente isolados do sêmen do varrão. Assim sendo, ela não deverá ser indicada, principalmente quando se necessitar uma conservação do sêmen por um período maior de tempo uma vez que os tipos de bactérias presentes no ejaculado se mostraram resistentes a estes antibióticos. Após oitos dias de conservação, as amostras de sêmen com penicilina/estreptomicina (8,4 x 10 5 UFC/mL) apresentaram uma contaminação 2,5 vezes maior do que aquela obtida com a gentamicina (3,3 x 10 5 UFC/ ml) (P < 0,05). Por outro lado, a neomicina demonstrou também ser um bom agente anti-microbiano para o sêmen suíno, principalmente par curtos períodos de conservação. Quando o período de conservação não ultrapassou as 24 h após a colheita, a neomicina teve uma ação eficaz neste controle tão boa quanto a da gentamicina (P> 0,05). Desta forma as granjas suinícolas que utilizam inseminação artificial com doses de sêmen preparadas de coletas para utilização imediata, poderão também utilizar a neomicina no meio diluidor como ATM. Neste caso, mesmo não havendo conservação das doses, a adição do antibiótico no diluidor seria recomendável, uma vez que segundo GOFFAUX et al. (1990) este material sendo depositado no útero das fêmeas com altas concentrações de bactérias, poderá trazer problemas de ordem infecciosa com queda nos resultados de fertilidade (SONE, 1982). Este aumento do número de colônias de bactérias no meio diluidor contendo o sêmen durante o período de estocagem, variou de 0,5 a 0,6 x 10 5 UFC/mL entre o início e o final da conservação. Esta variação foi pequena e estatisticamente não houve diferença entre os resultados dos dois momentos analisados (D0 e D8) (P>0,05). É interessante ressaltar que o lote onde não havia sido adicionado nenhum antibiótico também comportou-se da mesma forma ou seja, o número de colônias de bactérias passou de 10,4 x 10 5 UFC/mL em D0 para 11,0 x 10 5 UFC/mL em D8, uma diferença de 0,6 x 10 5 UFC/mL. Estes resultados demonstraram que apesar das diferenças entre os níveis de contaminação, nos lotes 2, 3 e 4, o pequeno aumento da contaminação não pôde ser evitado, evidenciando a possibilidade de uma ação mais imediata do antibiótico (em D1) sobre as cepas bacterianas mais sensíveis, persistindo as mais resistentes que se multiplicaram, aumentando desta forma o número de colônias nas amostras testadas. POOLPERM at al. (1998), demonstraram a necessidade dos ATMs nos diluentes para controlar o desenvolvimento bacteriano e aumentar o tempo de estocagem do sêmen suíno conservado entre 15 e 18 o C. Dentro deste mesmo raciocínio, a gentamicina apresentou a despeito dos outros antibióticos, um efeito antibacteriano residual durante o período de conservação, o que poderá aumentar o tempo de utilização do sêmen na presença deste antibiótico. Aparentemente, estes resultados demonstraram que os antibióticos neomocina e particularmente a conjugação penicilina/estreptomicina, não foram capazes de impedir, apesar de pequeno, o avanço do desenvolvimento bacteriano no sêmen diluído durante o período de conservação. Enquanto que a gentamicina baixou estes níveis de contaminação em 0,9 UFC/mL sendo a maior diferença, no caso para menos, dentre os diferentes antibióticos durante o mesmo período. Segundo SONE (1982), o uso de novos antibióticos poderá prevenir a prolifereção de bactérias patogênicas resistentes aos já utilizados rotineiramente entretanto, eles são normalmente muito caros para o uso diário em diluidores de sêmen. O melhor ATM será então aquele que puder reunir em um só momento o melhor poder antimicrobiano com o menor custo. CONCLUSÕES Substâncias antimicrobianas devem ser adicionadas aos meios diluidores do sêmen do varrão, particularmente quando o mesmo deverá ser conservado por alguns dias em geladeira. Apesar da grande gama de antibióticos, estudos adicionais são necessários, devido as diferentes sensibilidades dos agentes patógenos, para se determinar um antibiótico que permita um melhor equilíbrio entre o seu efeito antimicrobiano e o seu efeito tóxico para as células espermáticas. 37

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