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1 ARS VETERINARIA, 17(2): , EFEITO DA UTILIZAÇÃO DE 2, 3 E 4 BILHÕES DE ESPERMATOZÓIDES NA DOSE INSEMINANTE SOBRE A TAXA DE RETORNO AO ESTRO, TAXA DE PARTO E O TAMANHO DAS LEITEGADAS DE FÊMEAS SUÍNAS (EFFECT OF ARTIFICIAL INSEMINATIONS WITH DOSES OF TWO, THREE OR FOUR BILLION SPERMS ON THE RETURN TO ESTRUS, FARROWING RATE AND LITTER SIZE OF SWINE) A. N. MARCHETTI 1, F. P. BORTOLOZZO 2, I. WENTZ 2, G. BORCHARDT NETO 3, E. WOLLMANN 4, C. P. DIAS 1, M. POZZOBON 1, L. FLORES 1, L. E. SILVA 5, P. LISBOA 5 RESUMO Este estudo teve como objetivos avaliar a taxa de retorno ao estro (TRE), a taxa de parto ajustada (TPA) e o tamanho das leitegadas (TL) de fêmeas suínas inseminadas com dois, três e quatro bilhões de espermatozóides na dose inseminante (sptz/di). Foram utilizados 561 animais da linhagem Camborouhg 22 distribuídos em diferentes ordens de parto (1 a 8). A detecção do estro foi realizada às 8:00, 16:00 e 24:00 h. A primeira inseminação artificial (IA) foi realizada 8-16 h após a detecção do início do estro, sendo as subseqüentes realizadas a cada 12 h. O momento da ovulação foi determinado por ultra-sonografia transcutânea nos mesmos horários da detecção do estro. Após o início do estro, as fêmeas foram alocadas nos tratamentos e inseminadas pelos funcionários da granja. Não houve diferença na TRE e TPA entre os tratamentos, p=0,92 e p=0,88, respectivamente. As fêmeas inseminadas com dois bilhões de sptz/di tiveram leitegadas semelhantes às do grupo inseminado com três bilhões de sptz/di (p=0,20) e 0,7 leitão a menos que o grupo em que foram utilizados 4 bilhões de sptz/di (p=0,02). Entre os grupos de três e quatro bilhões de sptz/di não houve diferença no tamanho das leitegadas (p=0,35). Concluiu-se que DIs com dois bilhões de sptz não alteram as taxas de parto e retorno ao estro e produzem leitegadas menores comparadas às doses de quatro bilhões de sptz. PALAVRAS-CHAVE: Reprodução, suíno, dose inseminante, número de espermatozóides, desempenho reprodutivo. SUMMARY This experiment aimed at to avaluated the use of insemination doses (ID) with two, three and four billion sperms on return to estrus rate (RER), adjusted farrowing rate (AFR) and litter size (LS). A number of 561 Camborough 22 females were used, ranging from one to eight farrowings. The oestrus diagnosis was performed at 8 a.m., 16 p.m. and 24 p.m. with the aid of a teaser boar. The first AI was performed 8-16 h after the onset of oestrus, and subsequent AI were repeated every 12 hours. Ovulation was determined by trans-cutaneous ultrasound at the same hours of oestrus control. From the onset of oestrus, females were allocated to treatments and inseminated by the farm employees. No differences 1 Médico veterinário, aluno de pós-graduação da Faculdade de Veterinária UFRGS- Porto Alegre - RS 2 Doutor, Professor Adjunto, Faculdade de Veterinária UFRGS- Porto Alegre - RS 3 Professor Dr., Unicruz Cruz Alta- RS 4 Médico Veterinário, Perdigão Agroindustrial 5 Aluno do curso de Veterinária da Faculdade de Veterinária - UFRGS

2 108 ARS VETERINARIA, 17(2): , were found in in RER (p>0.92) and AFR (p>0.88) among different treatments. When LS was evaluated, ID with two million sperms presented similar results as three billion ID (p>0.20), which was comparable to four billion ID (p>0.35). Two billion sperms ID caused a reduction of 0.7 piglet as compared to four billion ID (p<0.05). We concluded that AI with ID of two billion does not increase RER and does not reduce AFR, and produces lower LS as compared to ID with four billion sperms. KEY-WORDS: Reproduction, swine, insemination dose, number of sperms, reproductive performance. INTRODUÇÃO Como a utilização da inseminação artificial (IA) é crescente em todo o mundo, surgem questionamentos quanto à otimização de cada macho nos programas de IA. Segundo CASTAGNA et al. (1999), um macho produz, em média, DIs ao ano. RUTTEN et al. (2000) avaliaram a produção de DIs em sete CIAs e observaram uma produção anual média de DIs por macho. Estimando-se que um macho em regime de dupla coleta semanal produza cerca de 20 DIs com três bilhões de espermatozóides (sptz) por ejaculado, seriam produzidas aproximadamente DIs anuais por macho. A redução do número de sptz para dois bilhões representaria um incremento na produção de DIs de até 50%, permitindo que um maior número de fêmeas sejam inseminadas. Dentro do mesmo raciocínio, haveria uma redução do número de machos necessários nas CIAs, levando à redução de custos na aquisição, mão-de-obra e manutenção desses animais no plantel. Pesquisas recentes demonstram que a utilização de doses inseminantes (DIs) com 1,5 ; 2; 2,5 e 3 bilhões de sptz apresentam resultados semelhantes no desempenho reprodutivo das fêmeas (PARK et al., 1999). No entanto, grande parte dos produtores brasileiros reluta em reduzir o número de espermatozóides na dose de sêmen. O objetivo deste trabalho foi quantificar e avaliar os resultados reprodutivos, ou seja, taxa de retorno ao estro, taxa de parto ajustada e tamanho das leitegadas, obtidos na IA utilizando-se DI contendo dois, três e quatro bilhões de espermatozóides. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado em uma unidade produtora de leitões, com aproximadamente matrizes, localizada no meio oeste do Estado de Santa Catarina, durante os meses de janeiro a abril de Foram utilizadas 561 fêmeas híbridas, Camborough 22. Após o desmame, as fêmeas foram alojadas em gaiolas individuais, e o controle de estro realizado às 8:00 h, 16:00 h e 24:00 h com o auxílio de um macho sexualmente maduro. Foram incluídas no experimento as fêmeas que apresentaram reflexo de tolerância ao homem na presença do macho (RTM) a partir do segundo diagnóstico de estro pós-desmame e fêmeas com intervalo desmame-estro (IDE) de até sete dias. O início do estro foi considerado no turno em que a fêmea apresentou RTM, diminuindo-se 4 h, e o final, como o último turno em que a fêmea apresentou RTM, mais 4 h. Após o início do estro as fêmeas foram categorizadas de acordo com ordem de parto, média de leitões nascidos nos partos anteriores e intervalo desmame-estro, sendo então divididas em três tratamentos: IA com dois bilhões de espermatozóides na dose inseminante (sptz/di); IA com três bilhões de sptz/di e IA com quatro bilhões de sptz/di. As fêmeas foram inseminadas no turno seguinte ao início do estro, sendo as IAs subseqüentes realizadas a cada turno, em intervalos de 8-16 h. As DIs foram preparadas a partir de um pool de ejaculados, e de um mesmo pool eram preparadas DIs com dois, três e quatro bilhões de espermatozóides. O diluente utilizado foi o BTS, e o volume de cada DI foi de aproximadamente 95 ml. A determinação do momento da ovulação (MO) foi feita por ultra-sonografia transcutânea, realizada às 8:00 h, 16:00 h e 24:00 h, a partir do turno seguinte ao início do estro. O MO foi considerado como a primeira imagem ultra-sonográfica que não apresentava folículos pré-ovulatórios, descontando-se 4 h. A confirmação foi feita por meio de um novo exame, 8 h após. A medida da temperatura retal dos animais foi realizada nos mesmos horários da ultra-sonografia. A partir do 18 O dia após a IA, foi realizado o controle de retorno ao estro, uma vez ao dia, com o auxílio de um macho sexualmente maduro e realização da pressão lombar. Para os cálculos da taxa de retorno ao estro e taxa de parto ajustada (retiradas do cálculo as fêmeas descartadas, mortas e que abortaram) utilizou-se o procedimento FREQ, do pacote estatístico do SAS , sendo empregado o teste do Qui-quadrado. No modelo estatístico empregado para o número de leitões nascidos totais foram empregadas como covariáveis a média de leitões produzidos nos partos anteriores (p<0,001) e a duração da lactação (p=0,02). Para a comparação entre as médias foi utilizado o procedimento GLM do pacote estatístico do SAS (1996), empregandose a opção LSMEANS. As variáveis, assim como suas interações que apresentaram p>0,20, foram retiradas, uma a uma, da análise.

3 ARS VETERINARIA, 17(2): , RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 mostra a taxa de retorno ao estro (TRE) dos animais avaliados e a taxa de parto ajustada (TPA) dos diferentes tratamentos. Não houve diferença entre os tratamentos. Não houve diferença no tamanho das leitegadas (TL) entre IAs com dois e três bilhões de sptz (p=0,20), assim como entre três e quatro bilhões (p=0,35). Entretanto, as fêmeas submetidas a IAs com dois bilhões de sptz apresentaram uma redução de 0,7 leitão em relação a quatro bilhões de sptz (p=0,02). Quando avaliada a distribuição das leitegadas (Figura 2) em pequenas (até sete leitões), médias (entre oito e 12 leitões) e grandes (mais que 13 leitões), observou-se que havia 11% a menos de leitegadas grandes e 11% a mais de leitegadas médias nas fêmeas inseminadas com 2 x 10 9 sptz (p=0,15). Diversos estudos foram desenvolvidos buscando formas de otimizar os custos de cobertura sem quedas no desempenho reprodutivo dos rebanhos. Entre eles, podem ser citados a redução do número de sptz na DI, concomitantemente com o intervalo entre IA e ovulação (IAOV), freqüência das IAs e o efeito do período de armazenamento in vitro das DIs. Cabe lembrar que neste estudo foi avaliada a TPA, ou seja, foram retiradas as fêmeas mortas, as que abortaram e as que foram descartadas por fatores não reprodutivos, uma vez que esses não estão associados aos tratamentos aplicados. Com isso, a TPA e a TRE foram semelhantes entre os três grupos, motivo pelo qual optou-se por discutir somente a TPA. Os resultados obtidos indicaram não haver diferenças na TPA quando utilizadas DIs com 2, 3 e 4 x 10 9 sptz (p=0,88). Entretanto, WEITZE (1991), ao inseminar fêmeas com 1,5 x 10 9 sptz e 2,5 x 10 9 sptz, observou uma taxa de parto inferior nas fêmeas inseminadas com menor número de sptz. Contudo, o período de armazenamento das DIs foi de três a cinco dias, período no qual ocorrem quedas na qualidade das DIs, principalmente quanto a motilidade e integridade do acrossoma (WABERSKI et al., 1994). Embora o autor não tenha avaliado o envelhecimento in vivo, uma hipótese a ser levantada seria que as DIs que continham 1,5 x 10 9 sptz tivessem uma menor população de sptz, nos ovidutos, aptos à fecundação, devido ao envelhecimento in vitro, somado ao tempo que permaneceram no trato genital feminino, interferindo na TPA e no TL. Segundo WEITZE (1991), existem diferenças entre machos quanto à capacidade de conservação in vitro dos sptz, o que indica a necessidade de diferenciação dos ejaculados no momento do preparo e armazenamento das DIs. O autor sugere que esse efeito poderia ser diminuído com o aumento do número de sptz/di, e que apenas determinados machos seriam utilizados para a produção de DIs destinadas a armazenamento superior a 48 h. Esta diferença entre os machos citada pelo autor, caso tenha ocorrido no presente estudo, foi semelhante para os três tratamentos, uma vez que as DIs foram confeccionadas a partir de um pool de ejaculados, e esse foi fracionado entre os diferentes tratamentos. WABERSKI et al. (1994) relataram que leitoas inseminadas imediatamente após a ovulação com DIs de 2 x 10 9 sptz armazenadas por um período acima de 48 h tiveram uma redução de 8% na taxa de prenhez, embora não assegurada em um nível de significância de 5%, provavelmente pelo reduzido número de animais. A queda na taxa de prenhez foi assegurada quando utilizadas DIs armazenadas por mais de 96 h (p<0,05). Com relação à taxa de fecundação, os resultados indicaram uma redução de 10% quando utilizado sêmen armazenado por mais de 24 h (p<0,05). Isso também foi observado por MERCAT et al. (1999), que avaliaram fêmeas inseminadas com DIs de 1,8 e 2,4 x 10 9 sptz e relataram que a taxa de parto diminuiu em 6% quando o sêmen foi usado no quarto dia de armazenamento, independentemente do número de células espermáticas (p<0,05). Segundo os autores, não há diferença na taxa de prenhez em relação ao número de sptz na DI (p>0,05). PARK et al. (1999) observaram não haver diferença na taxa de parto entre fêmeas inseminadas com DIs contendo 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 x 10 9 sptz. Contudo, nos experimentos de MERCAT et al. (1999) e PARK et Figura 1 - Taxa de retorno ao estro (TRE), taxa de parto ajustada (TPA) e número de leitões nascidos totais ± erro padrão (NT ± EP) nos tratamentos. Tratamentos n TRE (%) (p=0,92) TPA(%) (p=0,88) NT ± EP Probabilidade (2) (3) 2 bilhões 188 5,85 93,79 11,04 ± 0,22 (1) 0,20 0,02 3 bilhões 181 4,97 94,92 11,44 ± 0,22 (2) -- 0,35 4 bilhões 192 5,73 93,95 11,73 ± 0,21 (3) 0,35 --

4 110 ARS VETERINARIA, 17(2): , Figura 2 - Percentual de leitegadas pequenas (<8), médias (entre 8 e 12) e grandes (>12) de acordo com os tratamentos. al. (1999), o número de sptz corresponde aos sptz móveis na DI, e se for estimada uma motilidade mínima de 70%, as DIs possuiriam aproximadamente 20 a 30% a mais de sptz. Portanto, ao serem comparados aqueles resultados aos do presente estudo, cabe lembrar que neste foi utilizado o número de sptz totais nas DIs. NISSEN et al. (1997), ao inseminarem pluríparas com DIs de 2 x 10 9 sptz armazenadas por 36 h, em diferentes intervalos entre inseminação e ovulação (IAOV), observaram que as mais altas taxas de parto foram obtidas quando a IA ocorreu entre 28 h antes e até 4 h após a ovulação, sem terem sido verificadas diferenças dentro desse período (p>0,05). Quando o IAOV foi maior que 29 h antes ou 4 h após a ovulação, a taxa de parto foi reduzida em 30% (p<0,05). Entretanto, deve ser salientado que esses autores utilizaram somente 91 fêmeas, distribuídas em cinco grupos. Ao comparar os resultados acima descritos com os do presente estudo, no que se refere ao tempo de armazenamento in vitro das DIs, deve ser ressaltado que, devido ao delineamento experimental empregado, esse período foi sempre inferior a 48 h. Da mesma forma, o envelhecimento in vivo dos sptz não foi superior a 24 h, uma vez que as fêmeas foram submetidas a múltiplas inseminações com intervalos de 8-16 h, fazendo com que as IAs fossem efetuadas no intervalo considerado ótimo, ou seja, até 24 h antes da ovulação. Com relação ao tamanho das leitegadas, as fêmeas que foram inseminadas com 3 e 4 x 10 9 sptz apresentaram leitegadas semelhantes (p>0,05), concordando com estudos anteriores. BAKER et al. (1968) observaram que fêmeas submetidas a IAs com 5 e 10 x 10 9 sptz apresentaram semelhantes números de sptz presentes no oviduto (p>0,05), sendo superiores às DIs com 1 x 10 9 sptz (p<0,05). STEVERINK et al. (1997) relataram não haver diferenças nas taxas de fecundação e percentual de embriões normais ao compararem DIs de 3 e 6 x 10 9 sptz (p<0,05), com IAOV de até 36 h. No entanto, no presente trabalho as fêmeas que receberam IAs com 2 x 10 9 sptz tiveram leitegadas semelhantes às que receberam DIs com 3 x 10 9 sptz (p>0,05) e 0,7 leitão a menos do que as fêmeas que foram inseminadas com 4 x 10 9 sptz, (p<0,05) (Figura 1). Diferenças entre TL conforme o número de sptz foram sugeridas quando avaliados por outros pesquisadores. WEITZE (1991) observou que fêmeas inseminadas com 1,5 x 10 9 sptz tiveram até 2,3 leitões a menos que as inseminadas com 2,5 x 10 9 sptz. Entretanto, nesse experimento, as DIs foram utilizadas três dias após o processamento. Esse fato provavelmente explica as pequenas leitegadas obtidas pelo autor, entre 8,9 e 10,3 leitões em ambos os tratamentos. WABERSKI et al. (1994), usando DIs com 2 x 10 9 sptz armazenadas por até 120 h em diferentes IAOV, observaram que as taxas de fecundação foram semelhantes em leitoas inseminadas entre 0 e 24 h antes da ovulação (p>0,05), quando utilizadas DIs com até 48 h. Ao utilizarem DIs com maior tempo de armazenamento, os resultados foram inferiores, principalmente quando o IAOV foi superior a 24 h (p<0,05). Contudo, o número total de animais avaliados foi de 82, o que faz com que esses valores sejam analisados com cautela. No estudo de SOEDE et al. (1995), as DIs utilizadas continham 3 x 10 9 sptz, e o percentual de embriões normais variou entre 93 e 95%, para inseminações entre 0 e 24 h antes da ovulação (p>0,05), sugerindo que a redução do número de sptz seja prejudicial ao desempenho reprodutivo, mesmo quando efetuada dentro desse período. Entretanto, NISSEN et al. (1997) utilizaram DIs com 2 x 10 9 sptz armazenadas por 36 h e observaram leitegadas semelhantes quando a IA foi feita entre 28 h antes e 4 h após a ovulação (p<0,05), variando entre 13 e 14,9 leitões, o que indica que DIs elaboradas com 2 x 10 9 sptz podem produzir leitegadas numerosas. No presente estudo, devido ao delineamento experimental utilizado, as diferenças observadas no TL possivelmente não estão associadas ao envelhecimento tanto in vitro como in vivo dos sptz. STEVERINK et al. (1997) observaram não haver diferenças no percentual de embriões normais entre DIs com 1, 3 e 6 x 10 9 sptz, mas as DIs com 1 x 10 9 sptz tiveram

5 ARS VETERINARIA, 17(2): , um percentual menor, entre 11 e 26%, de fêmeas com mais de 90% de embriões normais, em diferentes IAOV. Esses resultados concordam em parte com os do presente estudo, uma vez que, quando avaliada a distribuição das leitegadas em pequenas (até sete leitões), médias (entre oito e 12 leitões) e grandes (mais que 12 leitões), havia 11% a menos de leitegadas grandes e 11% a mais de leitegadas médias nas fêmeas inseminadas com 2 x 10 9 sptz (p=0,15) (Figura 2). MERCAT et al. (1999) relataram não haver diferença no TL entre fêmeas inseminadas com 1,8 ou 2,4 x 10 9 sptz/di. Chama a atenção que os autores não observaram diferenças nas leitegadas com relação ao armazenamento das DIs, de um e quatro dias, discordando dos trabalhos anteriormente citados. Resultados semelhantes foram obtidos por PARK et al. (1999), que obtiveram leitegadas semelhantes quando utilizadas DIs com 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 x 10 9 sptz. Pelo que foi descrito acima, os resultados obtidos no presente estudo concordam com a literatura, segundo o qual redução do número de sptz na DI para 2 x 10 9 não traz prejuízo à taxa de parto. Uma razão para justificar as taxas de parto obtidas seria que, para ocorrer o reconhecimento e a manutenção da gestação, são necessários cinco embriões, para que haja uma síntese suficiente de estrógenos, evitando a luteólise e a retomada do ciclo estral (POLGE et al., 1966). Uma vez a prenhez estabelecida e supondo que a fêmea chegue ao parto, é possível que o efeito da redução do número de sptz interfira no tamanho da leitegada, devido a falhas na fecundação, sem afetar, no entanto, a taxa de parto. Por não terem sido verificadas diferenças no TL entre DIs com 2 e 3 x 10 9 sptz, assim como 3 e 4 x 10 9 sptz, e ter sido observada uma redução no TL apenas entre DIs com 2 e 4 x 10 9 sptz, pode ser sugerido que a redução do número de sptz/di deve ser avaliada de maneira criteriosa em cada unidade de produção. O aspecto mais importante a ser considerado é o custo por fêmea coberta, principalmente em relação ao número de machos doadores de sêmen. Considerando que um macho tenha potencial para produzir aproximadamente DIs/ano, com intervalos entre coleta de três a quatro dias com DIs de 3 a 4 x 10 9 sptz, a mudança para 2 x 10 9 sptz representa um aumento de 50 a 100% no potencial de DIs a ser produzido, elevando a proporção machos/fêmeas do plantel. Entretanto, outros pontos devem ser relevantes para a redução do número de sptz nas DIs, como um IAOV inferior a 24 h e, conseqüentemente, a freqüência das IAs, assim como o uso das DIs em curtos períodos de armazenamento, uma vez que estão diretamente associados ao número de sptz e à viabilidade das DIs. CONCLUSÃO Nas condições em que foi desenvolvido este experimento, concluiu-se que a redução do número de espermatozóides na dose inseminante não altera as taxas de parto e retorno ao estro. Entretanto, doses com dois bilhões de espermatozóides levam a uma diminuição no tamanho das leitegadas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAKER, R. D., DZIUK, P. J., NORTON, H. W. Effect of volume of semen, number of sperm and drugs on transport of sperm in artificialy inseminated gilts. Journal of Animal Science v.27, p CASTAGNA, C. D., DIAS, C. P., REIS, G. R., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I. Viabilidade econômica de centrais de inseminação artificial para suínos. I. Custos de implantação. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS. 9. Belo Horizonte- MG Anais... p MERCAT, M. J., FLOCH, M., PELLOIS, H., RUNAVOT, J. P. Reduction on sperm cell number per insemination dose. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION. 4. Beltsville, Maryland-USA Abstracts... p.33. NISSEN, A.K., SOEDE, N.M., HYTTEL, P., SCHMIDT, M.; D HOORE, L. The influence of time of insemination relative to time of ovulation on farrowing frequency and litter size in sows, as investigated by ultrasonography. Theriogenology v.47, p , PARK, C. S., KIM, I. C., SON, D. S. Study on the optimal concentration of motile sperm per dose in the artificial insemination with liquid boar semen. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION. 4. Beltsville, Maryland- USA Abstracts... p.34. POLGE, C., ROWSON, L. E. A., CHANG, M. C. The effect of reducing the number of embryos during early stages of gestacion on the maintence of pregnancy in the pig. Journal of Reproduction and Fertility. v.12, p RUTTEN, S. C., MORRISON, R. B., REICKS, D. Boar stud production analysis. Swine Health and Production v.8, n.1, p.11-4, SAS Institute (Cary NC) SAS user s guide: Statistics, version 6, 11 ed., Cary, v.2, 1686 p SOEDE, N. M., WETZELS, C. C. H., ZONDAG, W., HAZELEGER, W., KEMP, B. Effects of time of insemination relative to ovulation, as determined by

6 112 ARS VETERINARIA, 17(2): , ultrasonography, on fertilization rate and accessory sperm count in sows. Journal of Reproduction and Fertility. v.104, p , STEVERINK, D. W. B., SOEDE, N. M., BOUWMAN, E. G., KEMP, B. Influence of insemination-ovulation interval and sperm cell dose on fertilization in sows. Journal of Reproduction and Fertility. v.111, p , WABERSKI, D., WEITZE, K. F., LIETMANN, C., LUBBERT zur LAGE W., BORTOLOZZO, F. P., WILLEM, T., PETZOLD, R. The initial fertilizing capacity of longterm-stored liquid boar semen following pre- and postovulatory insemination. Theriogenology. v.41, p , WEITZE, K.F. Long-term storage of extended boar semen. Reproduction in Domestic Animals. Berlin Supplement 1. p