BIOENSAIO COM ARTEMIA SALINA PARA DETECÇÃO DE TOXINAS EM ALIMENTOS VEGETAIS

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1 BIOENSAIO COM ARTEMIA SALINA PARA DETECÇÃO DE TOXINAS EM ALIMENTOS VEGETAIS ARMANDO GARCIA RODRIGUEZ, OLÍVIA MENDES TEIXEIRA, FERNANDA GOMES SALLES, JAQUELINNE PIRES VITAL, DENISE SILVA PEIXOTO Resumo: foi desenvolvido um método alternativo para a detecção de ácido cianídrico em mandioca e sementes de frutas, e glicoalcalóides em batatas O efeito dose-resposta foi testado em cultivos de Artemia salina e o valor de LD 50 foi calculado. O bioensaio mostrou uma elevada precisão e sensibilidade na determinação de ácido cianídrico e glicoalcalóides, além de ser uma técnica simples, rápida e econômica. Palavras-chave: toxicidade, alimentos, bioensaio Apresença de compostos tóxicos naturais em alguns alimentos vegetais é um fato relativamente comum que evidencia a necessidade de se dispor de técnicas analíticas eficientes na detecção de tais substâncias, garantindo assim a qualidade dos produtos e a saúde dos consumidores. Dentre as toxinas naturais mais freqüentemente encontradas nos alimentos vegetais destacam os glicosídios cianogênicos, e os glicoalcalóides. Os glicosídios cianogênicos são compostos precursores do ácido cianídrico (HCN), altamente tóxico, presentes na mandioca e no caroço de frutas como pêssego, ameixas, ce- 795

2 796 rejas e outras (ARAÚJO, 2004). Quando a mandioca é descascada e cortada em pedaços, ou quando o caroço de uma fruta e danificado ou quebrado, os glicosídios cianogênicos entram em contato com duas enzimas (b-glicosidase e hidroxinitrilo liase) liberadas após a ruptura das células, que catalizam a reação de formação do HCN. Por isso, após o descasque, é conveniente colocar os pedaços de mandioca na água durante um intervalo de tempo para que aconteça a reação de degradação enzimática dos glicosídios cianogênicos e o HCN liberado seja solubilizado na água e portanto, eliminado do alimento. No caso das frutas, o perigo de intoxicação não é devido à ingestão das frutas frescas, onde o caroço geralmente fica intacto, e sim pelo processamento industrial (por exemplo, a fabricação de vinhos e licores) em que, durante o despolpe, o caroço pode resultar danificado e o suco ou o produto final podem conter quantidades significativas de HCN (FERNANDEZ; NOVELLI, 1997). A quantidade de HCN produzida depende da variedade do vegetal. A dose letal para seres humanos é de 0,5 3,5mg/Kg de peso. Por exemplo, g de mandioca podem produzir até mg de HCN, valor próximo à dose letal para um indivíduo. Intoxicações agudas pela ingestão de mandioca parecem ser freqüêntes, frente à ampla utilização desse tubérculo na alimentação do brasileiro em geral. Não é raro ouvir-se relatos de intoxicações letais por cianeto, veiculado pela mandioca. Infelizmente, não se dispõe de dados a respeito de tal incidência (MÍDIO; MARTINS, 2000). Os glicoalcalóides são substâncias naturais com ação neurotóxica, presentes em diversos alimentos de origem vegetal. No grupo dos glicoalcalóides destacam a a-solanina e a a- chaconina, produzidas pelos tecidos dos vegetais da família das solanáceas, principalmente batata, tomate e berinjela (ARAÚ- JO, 2004). Esses compostos são potentes inibidores da acetilcolinesterase na junção neuromuscular. A inibição dessa enzima provoca um acúmulo da acetilcolina liberada pelas células nervosas, produzindo, assim, desordens intestinais e neurológicas tais como tremores, espasmos musculares e, nos casos mais graves, até a morte do indivíduo (FERNÁNDEZ; NOVELLI, 1997). Nas batatas, os glicoalcalóides encontram-se localizados principalmente nas partes mais próximas à casca e nos brotos e a sua concentração aumenta significativamente nas

3 batatas armazenadas na presença de luz e a temperaturas entre 8 e 15 C. O teor de glicoalcalóides nas batatas varia de 2 a 15mg/ g, podendo atingir concentrações ainda maiores, de até mg/ g. A concentração letal para seres humanos é de 45mg/ g e o limite permitido para a comercialização é de 20mg/ g de alimento (MIDIO; MARTINS, 2000). Da mesma forma que outras toxinas naturais presentes nos alimentos, os glicosídios cianogênicos, e os glicoalcalóides são detectados e quantificados mediante técnicas analíticas de separação, como a cromatografia de camada fina, cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), imunoensaio e ensaios enzimáticos, nem sempre disponíveis em laboratórios e centros de pesquisa de menor porte. Já que essas toxinas afetam seres vivos, o uso das técnicas de bioensaio apresentam-se como uma alternativa viável, rápida e econômica. O método de bioensaio mais usado no mundo inteiro para detecção de toxinas alimentares, é o bioensaio com camundongos, baseado na injeção intraperitoneal de extratos, preparados a partir de amostras de alimentos e a observação dos sintomas da intoxicação, assim como o tempo de morte do animal, proporcional à concentração de toxina no extrato (AOAC, 1990). Além de ser um método muito impreciso, com diversas fontes de variabilidade que podem levar a falsos positivos e negativos, com seus conseqüentes erros na interpretação dos dados, esta técnica apresenta problemas éticos, devido ao elevado número de animais que é necessário sacrificar e que devem ser mantidos em condições adequadas nos biotérios. Por tudo isso, outros ensaios biológicos envolvendo culturas de células e organismos inferiores têm sido desenvolvidos visando substituir as técnicas com ratos e camundongos por novos métodos mais rápidos, simples, sensíveis e precisos. A técnica de bioensaio que utiliza o microcrustáceo Artemia salina tem superado amplamente o método com camundongos, em termos de sensibilidade, precisão e simplicidade. É muito usada em testes de ecotoxicologia, para a avaliação da toxicidade de efluentes e poluentes ambientais (PETERS et al., 1997) e mais recentemente foi comprovada também sua efetividade na detecção de toxinas produzidas por cianobactérias (GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2004). 797

4 798 O presente trabalho teve como objetivos: Montar e testar a eficiência de um método alternativo de bioensaio com o micro-crustáceo Artemia salina para a detecção rápida e eficiente de ácido cianídrico e glicoalcalóides em amostras de alimentos vegetais. Avaliar a toxicidade por cianeto e glicoalcalóides em vegetais consumidos na cidade de Goiânia, assim como em alguns dos seus derivados industrializados. Caracterizar parâmetros toxicológicos a partir da elaboração de curvas dose resposta. MATERIAIS E MÉTODOS Bioensaio com Artemia Salina A eclosão dos ovos de Artemia salina foi realizada em uma solução de sal marinho 3,5%, sob iluminação e aeração constante, durante 48 horas. Após esse tempo, os nauplios eclodidos foram separados com pipetas Pasteur e transferidos para tubos de ensaio, contendo 1mL de solução de sal marinho, na quantidade de 10 exemplares por tubo. Nesses tubos foram posteriormente testados e avaliados os extratos obtidos das amostras de alimentos vegetais (GARCIA-RODRIGUEZ et al., 2004). Preparação das Amostras A efetividade do bioensaio com Artemia salina foi estudada mediante a avaliação do efeito tóxico dos extratos obtidos de amostras de mandioca e sementes de pêssego, ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga (para a detecção de ácido cianídrico), e batata in natura e derivados industrializados de batata (para a detecção de glicoalcalóides). As amostras foram coletadas em diferentes centros comerciais escolhidos aleatoriamente, registrando sempre a origem das mesmas e a data da colheita. Ácido cianídrico em mandioca: amostras de mandioca de g, previamente descascadas, foram cortadas em pedaços pequenos com uma faca de aço inoxidável e imediatamente submersos em ml de água destilada a temperatura ambiente, para evitar a inativação das enzimas responsáveis pela degradação dos glicosídios cianogênicos e facilitar a dissolução do HCN

5 produzido. As amostras foram filtradas com filtro Millipore de 0,45?m e congeladas até o momento dos testes. Ácido cianídrico em sementes de frutas: a polpa das frutas foi descartada e os caroços triturados com um martelo. g das castanhas obtidas do interior dos caroços, foram colocadas em ml de água destilada a temperatura ambiente, para evitar a inativação das enzimas responsáveis pela degradação dos glicosídios cianogênicos e facilitar a dissolução do HCN produzido. As amostras foram filtradas com filtro Millipore de 0,45?m e congeladas até o momento dos testes. Glicoalcalóides em batata: os extratos foram preparados seguindo a metodologia descrita por Araújo (2004), baseada na extração seletiva das toxinas, segundo a sua solubilidade. g de polpa de batata ou 50g de casca foram submetidas à extração com uma mistura de metanol-clorofórmio (2:1) em um liquidificador e filtradas com papel-filtro Whatman No.1. Seguidamente o extrato será concentrado em evaporador rotatório, tratado consecutivamente com HCl e NH 4 OH e centrifugado a 4 C. O precipitado dissolvido em água destilada, foi utilizado nos testes de toxicidade. Testes de Toxicidade Após a comprovação do efeito tóxico em testes preliminares (adição do extrato nas culturas de Artemia salina e observação da mortalidade das mesmas), os extratos concentrados obtidos serão adicionados, por triplicata, nos tubos de ensaio contendo os nauplios de Artemia salina, em concentrações decrescentes (três tubos para cada concentração) com vistas à elaboração das curvas de toxicidade e o cálculo da dose letal (DL, DL 50 ) (GARCIA- RODRIGUEZ et al., 2004). Análise e Interpretação dos Dados Vinte e quatro horas após a aplicação dos extratos, o número de exemplares de Artemia salina vivos e mortos ou imobilizados, foi contado e a sobrevivência calculada: M(%) = Número de organismos vivos x Número total de organismos no tubo (10) 799

6 Para cada concentração de extrato testada, foi calculado o valor médio da mortalidade e do desvio padrão. Com esses dados foram construídas as curvas de toxicidade (Mortalidade vs. Concentração do extrato). O valor de DL (dose ou concentração que provoca a morte de todos os exemplares no tubo) e DL 50 (dose ou concentração que provoca a morte de 50% dos animais testados) foi calculado mediante o ajuste logarítmico das curvas de toxicidade, utilizando o programa Origin 5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO Detecção da Toxicidade por Ácido Cianídrico O efeito tóxico sobre os cultivos de Artemia salina foi analisado em extratos aquosos obtidos a partir de polpa de mandioca e sementes de pêssego, ameixa, cereja, jabuticaba, manga e abacate. A figura 1 mostra uma curva de toxicidade obtida com extrato de polpa de mandioca e a comparação da mesma curva com o efeito dose resposta obtido após o tratamento dos cultivos com cianeto de potássio, como padrão. A Sobrevivência (%) Concentração do extrato (mg) 0

7 B Sobrevivência (%) ,01 0, Cianeto Concentração (m g/m L) Mandioca Figura 1: Efeito Dose-Resposta do Extrato de Polpa de Mandioca (A) e Superposição da Curva do Extrato Tóxico e do Padrão de Cianeto de Potássio Puro (B) Como pode ser observado, o comportamento sigmóide das curvas de toxicidade permite o ajuste logarítmico das mesmas, facilitando o cálculo da dose letal 50% (DL 50 ), tanto do extrato tóxico quanto do padrão da toxina. O valor DL 50 expressa a concentração do extrato ou do padrão, necessária para provocar a morte de 50% dos exemplares de Artemia salina presentes em um cultivo. Portanto, para diferentes toxinas, quanto menor o valor de DL 50 encontrado, maior será o efeito tóxico da substância correspondente. Para uma mesma toxina, um valor menor de DL 50 representa uma concentração maior da mesma na amostra analisada. Obtendo os valores de DL 50 do padrão (cianeto puro) e de um extrato vegetal, ou seja, a quantidade de padrão e de extrato com o mesmo efeito tóxico no cultivo, foi possível calcular a concentração de cianeto no extrato, expressada como miligramas de toxina por gramas de amostra mediante a relação: [cianeto] = DL 50 (padrão) / DL 50 (extrato) x Outro aspecto importante a ressaltar é o fato das declividades de ambas as curvas serem semelhantes, o que sugere que o efeito 1

8 tóxico encontrado nas amostras de mandioca é efetivamente devido à presença de ácido cianídrico. Os valores de DL 50 e concentração de cianeto calculada são mostrados na Tabela 1. Um comportamento semelhante das curvas de toxicidade foi observado nos cultivos tratados com os extratos das amostras de sementes de pêssego, ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga, analisadas pelo mesmo método. A figura 2 mostra a curva de toxicidade obtida com o extrato de semente de pêssego e a comparação da mesma com a curva de toxicidade do cianeto puro. Como as curvas de toxicidade obtidas com as amostras de semente de ameixa, cereja, jabuticaba, abacate e manga apresentaram um comportamento muito semelhante ao da curva mostrada para o pêssego, assim como declividades próximas à da curva de cianeto puro, os gráficos correspondentes às mesmas não são mostrados no presente trabalho. Os valores de DL 50 e concentração de cianeto para todas as amostras analisadas são mostrados na tabela 1. A Sobrevivencia (%) Concentraçao do extrato (mg) 2

9 B Sobrevivência (%) ,01 0, Cianeto Concentração (m g/m L) Pêssego Figura 2: Curva de Toxicidade do Extrato de Semente de Pêssego (A) e Comparação com a Curva Dose-Resposta do Cianeto de Potássio (B) A presença de cianeto na maioria das amostras de alimentos vegetais estudadas não é surpreendente, desde que a mesma já foi descrita em trabalhos anteriores (FERNANDEZ, NOVELLI, 1997; ARAÚJO, 2004). A novidade apresentada no presente trabalho é a comprovação da eficiência do bioensaio com Artemia salina na detecção dessa toxina, mostrando uma elevada sensibilidade e precisão. Tabela 1: Valores de DL 50 e Concentração de Cianeto para todas as Amostras Analisadas Amostra DL 50 (mg/ml) Concentração de cianeto (mg/ g) Cianeto de potássio (padrão) 0,03 - Mandioca (polpa) 45,1 97,0 Pêssego (semente) 13,03 338,0 Ameixa (semente) 6,2 710,0 Cereja (semente) 12,9 233,0 Jabuticaba (semente) 10,0 4,0 Abacate (semente) 19,1 230,0 Manga (semente) 38,9 113,0 3

10 Detecção da Toxicidade por Glicoalcalóides A presença de glicoalcalóides foi testada em amostras de casca e polpa de batata in natura e também em produtos industrializados como batata frita e batata congelada para fritar. A figura 3 mostra as curvas de toxicidade obtidas após o tratamento dos cultivos de Artemia salina com extratos de casca de batata, polpa de batata e batata frita industrializada (tipo chips). O extrato obtido a partir da amostra de batata congelada não provocou nenhum tipo de toxicidade nos cultivos de Artemia salina que apresentaram uma sobrevivência de em concentrações de extrato de até 4 g/ml. A Sobrevivência (%) 20 B Sobrevivência (%) 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0, 0,45 Concentração do extrato (g/ml) ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Concentração do Extrato (g/ml) 4

11 C Sobrevivência (%) Concentração do Extrato (g/ml) Figura 3: Curvas de Toxicidade Obtidas com os Extratos de Casca de Batata (A), Polpa de Batata (B) e Batata Frita Industrializada (C) Todas as curvas apresentaram o comportamento típico das curvas dose resposta, o que permitiu o ajuste logarítmico das mesmas e o cálculo do valor de DL 50 para cada extrato, mostrados na tabela 2. Tabela 2: Valores de DL 50 para as Amostras de Batata Analisadas Amostra DL 50 (mg/ml) Casca de batata (in natura) 0,11 Polpa de batata (in natura) 3,45 Batata frita (chips) 6,4 É importante ressaltar que o valor de DL 50 encontrado no extrato de casca de batata foi aproximadamente trinta vezes menor do que o valor correspondente ao extrato de polpa in natura. Segundo dados bibliográficos (ARAÚJO, 2004) % do teor total de glicoalcalóides nas batatas encontra-se localizado na casca, enquanto apenas 20% podem estar presentes na polpa. Esse fato confirma a eficiência e confiabilidade do método de bioensaio com Artemia salina. Nos extratos de batata frita a toxicidade foi ainda menor (valor de DL 50 maior), provavelmente porque, como acontece com a maioria dos produtos industrializados de batata, as fatias não são constituídas de batata natural e sim de polpa tratada mediante processo de extrusão que elimina parte do teor de água, podendo 5

12 também reduzir o teor de glicoalcalóides da polpa. É provável que por esse mesmo motivo, não tenha sido encontrada toxicidade nas amostras de batata congelada para fritar. Embora não tenha sido possível utilizar padrões de glicoalcalóides puros para comparar a sua toxicidade com a das amostras de batata e calcular a concentração de toxina nas mesmas, a semelhança entre as declividades das curvas obtidas, mostrada na figura 4, evidencia a presença da mesma toxina nos três extratos. Todavia, a seletividade do método de extração utilizado na preparação dos extratos sugere que o efeito tóxico detectado nas amostras de batata seja devido à presença de glicoalcalóides. 6 Sobrevivência (%) ,01 0, Concentração do extrato (g/ml) Casca Polpa Frita Figura 4: Comparação da Declividade das Curvas Dose Respostas Obtidas com Casca de Batata, Polpa de Batata e Batata Frita Industrializada CONCLUSÃO O cultivo de Artemia salina mostrou-se adequado como método de bioensaio na caracterização da toxicidade por ácido cianídrico, e glicoalcalóides, apresentando elevada precisão e sensibilidade, além de ser uma técnica rápida, simples e econômica. As curvas de toxicidade obtidas apresentaram o comportamento sigmóide típico das curvas dose resposta, permitindo o ajuste das mesmas e o cálculo dos valores de dose letal 50% (DL 50 ) para os diferentes extratos vegetais testados.

13 Na detecção de ácido cianídrico, a declividade das curvas obtidas com os extratos vegetais foi semelhante à declividade da curva correspondente ao padrão de cianeto de potássio puro, sugerindo que a toxicidade detectada nas amostras é devida à presença de cianeto, e permitindo a identificação e quantificação da toxina no alimento. Apesar da falta de padrões para glicoalcalóides, as curvas de toxicidade obtidas com os diferentes extratos de batata apresentaram declividades semelhantes à das curvas do produto industrializado, sugerindo a presença da mesma toxina em todas as amostras. A seletividade do método de extração utilizado permite supor a presença de glicoalcalóides na batata. Referências AOAC: Paralytic Shellfish Poison. Biological method. Final action. In: HELLRICH, K. (Ed.), Official Methods of Analysis. Association of Official Chemists, sec ed. Virginia: Arlington, ARAÚJO, J. M. A. Química de alimentos: teoria e prática. Viçosa: Ed. da UFV, FERNÁNDEZ, M.T.; NOVELLI, A. Bioquímica de los alimentos. Dissertação (Master en Biotecnología Alimentaria) Universidad de Oviedo, Espanha GARCIA-RODRIGUEZ et al. Toxicidade por Microcystis sp. em Goiás: Estudo dos efeitos tóxicos em camundongos e Artemias salinas. Estudos, Goiânia, v. 31, n. 9, p , MIDIO, A. F.; MARTINS, D. I. Toxicologia de alimentos. São Paulo: Varela, PETERS, E. C. et al. Ecotoxicology of tropical marine ecosystems. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 16, n. 1, p.12-, Abstract: an alternative bioassay method using the microcrustacean Artemia salina was developed to detect cyanic acid in cassava and fruit seeds, and glicoalcaloids in potatoes. Doseresponse effect was tested in Artemia salina cultures and LD 50 value was calculated. This bioassay technique showed a very high precision and sensitivity when detecting cyanic acid and glicoalcaloids. It is also a very simple, rapid and economic method. Keywords: toxicity, food, bioassay 7

14 Agradecimentos Ao CNPq, pela concessão das bolsas às alunas de iniciação científica que participaram deste trabalho. Todos os reagentes e materiais de laboratório foram adquiridos com recursos da Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC GO), aprovados pela Prope. Os resultados apresentados neste trabalho fazem parte dos projetos de pesquisa Aplicação das técnicas de bioensaio na determinação de compostos tóxicos naturais em alimentos de origem vegetal e Avaliação da toxicidade por alcalóides em alimentos vegetais mediante bioensaio com Artemia salina, cadastrados na Prope, que contaram com a participação das seguinteas bolsistas de iniciação científica e alunas do curso de Engenharia de Alimentos da PUC GO: Olívia Mendes Teixeira, Fernanda Gomes Salles, Jackeline Pires Vital e Denise Silva Peixoto, todas com bolsa PIBIC-CNPq, sob a orientação do Prof. Dr. Armando Garcia Rodriguez, da Coordenação de Química do Departamento de Matemática e Física (MAF). 8 ARMANDO GARCIA RODRIGUEZ Doutor em Ciências Biológicas pela Universidade de Oviedo (Espanha). Professor no Departamento de Matemática e Física da PUC GO. Membro do Núcleo de Pesquisa em Química (NPQ) da PUC GO. armando@ucg.br OLÍVIA MENDES TEIXEIRA FERNANDA GOMES SALLES JACKELINE PIRES VITAL DENISE SILVA PEIXOTO Bolsistas de iniciação científica (PIBIC). Alunas de Engenharia de Alimentos da PUC GO.