Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso

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1 Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso ESTUDO DA INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO NA ANÁLISE BIOQUÍMICA DA URINA Autora: Caroline Cunha Fontoura Orientador: Prof. MSc. Paulo Roberto Sabino Junior Brasília - DF 2014

2 CAROLINE CUNHA FONTOURA ESTUDO DA INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO NA ANÁLISE BIOQUÍMICA DA URINA Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. MSc. Paulo Roberto Sabino Junior Brasília 2014

3 Trabalho de Conclusão de Curso, de autoria de Caroline Cunha Fontoura, intitulado ESTUDO DA INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO NA ANÁLISE BIOQUÍMICA DA URINA, apresentado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 19 de novembro de 2014, defendido e aprovado pela banca examinadora abaixo assinada: Prof. MSc. Paulo Roberto Sabino Junior Orientador Farmácia - UCB Prof. Esp. Wislon Mendes Pereira Farmácia - UCB Prof.ª MSc. Yara de Fátima Hamu Biomedicina - UCB Brasília 2014

4 Dedico este trabalho, Aos meus pais, Fernando Antônio Lobato Fontoura e Maisa Cunha Pinto, que sempre me incentivaram na busca pelos meus sonhos, e aos professores da Universidade Católica de Brasília, por me darem o prazer do conhecimento.

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por estar sempre ao meu lado me abençoando em cada etapa da minha vida e me dando sabedoria para alcançar meus sonhos. Aos meus pais, Fernando e Maisa, que sempre se esforçaram para que eu conseguisse ter bons estudos, aos meus irmãos que estiveram sempre me dando carinho nos momentos mais difíceis, em especial minha irmã Fernanda que me orientou sobre algumas escolhas na Universidade Católica de Brasília. Ao meu cunhado Isiel por ter me apoiado nos estudos e aos meus sobrinhos maravilhosos, Luan e Gabriel, que sempre alegraram os meus momentos de volta a casa. Agradeço também aos técnicos Elias Rosa de Souza, Marcos Sodré dos Santos e Amanda Lúcia Gomes, da Universidade Católica de Brasília, por todo o trabalho, atenção e ajuda para realização da prática da pesquisa. Ao meu orientador, Paulo Roberto Sabino Junior, por ter dedicado tempo para me ensinar e orientar na elaboração deste trabalho. E à empresa Biosys, por disponibilizar as fitas reagentes para realização dos testes.

6 RESUMO Referência: FONTOURA, Caroline. Estudo da interferência do ácido ascórbico na análise bioquímica da urina folhas. Monografia (Biomedicina) Universidade Católica de Brasília, Taguatinga DF, A presença de ácido ascórbico (AA) em amostras biológicas tem sido responsável por resultados falsamente baixos, ou mesmo falso-negativos. Essa interferência in vitro ocorre devido à capacidade de redução desse ácido, o que permite uma interação com constituintes dos reagentes analíticos do parâmetro bioquímico inibindo as reações de oxirredução. Como a sua interferência pode ocultar de forma significativa algumas doenças, este trabalho buscou identificar quais concentrações são interferentes nas dosagens de alguns marcadores (sangue, glicose, bilirrubina e nitrito) e qual seria a possível solução para inibir essa interferência do AA sob esses marcadores. Foram feitos testes de positividade da fita reagente, teste de interferência do AA e teste de inibição do AA. Como os testes para a redução ou eliminação da ação do AA sobre as dosagens desses marcadores não tiveram os resultados esperados, sugere-se a realização de pesquisas com outros reagentes químicos, como a enzima ascorbato oxidase. Recomenda-se a adoção de observações sobre esta interferência nos laudos emitidos pelos laboratórios, adoção de tiras com indicador de presença de AA e a repetição do exame a critério médico em uma nova amostra de urina após o paciente suspender a ingestão de vitamina C por 48 horas. Palavras-chave: Ácido ascórbico. Interferências. Fita reagente. Exame físico-químico. Urinálise.

7 ABSTRACT The presence of ascorbic acid (AA) in biological samples has been responsible for falsely low results, or even false negatives. This interference in vitro is due to the ability to reduce this acid, which allows interaction with constituents of the biochemical parameter analytical reagents inhibiting the redox reaction. As the interference of AA can hide some diseases significantly, this study sought to identify which concentrations are interfering in the dosages of some markers (blood, glucose, bilirubin and nitrite) and what would be the possible solution to inhibit the interference of AA in these markers. Tests of positive reagent strip, interference test of AA and AA inhibition test were made. As the tests for the reduction or elimination of the action of AA on the dosages of these markers did not have the expected results, it is suggested to conduct research with other chemical reagents such as ascorbate oxidase enzyme. The adoption of observations about this interference in appraisal reports issued by the laboratories, adopting strips with presence indicator of AA and a repeat examination by medical criteria in a new urine sample after the patient discontinue the intake of vitamin C is recommended for 48 hours. Keywords: Ascorbic acid. Interference. Reagent strip. Physical and chemical examination. Urinalysis.

8 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Concentrações de glicose e de ácido ascórbico utilizadas nos testes de inibição do ácido ascórbico...23 Quadro 2 Concentrações de ácido bórico adicionadas a concentrações de ácido ascórbico...24 Quadro 3 Resultados das leituras das concentrações de glicose, hemoglobina, nitrito e bilirrubina realizadas em fita reagente de urina...25 Quadro 4 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de hemoglobina em fita reagente de urina...26 Quadro 5 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de glicose em fita reagente de urina...26 Quadro 6 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de nitrito em fita reagente de urina...26 Quadro 7 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de bilirrubina em fita reagente de urina...27

9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO HISTÓRIA DA URINÁLISE PROCEDIMENTO DO EXAME DA URINA FITA REATIVA ÁCIDO ASCÓRBICO PRINCÍPIOS DAS REAÇÕES Glicose Bilirrubina Sangue Nitrito IMPORTÂNCIA DO RESULTADO PARA OS DIVERSOS DIAGNÓSTICOS MATERIAIS E MÉTODOS TESTE DE POSITIVIDADE DA FITA REAGENTE TESTE DE INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO TESTE DE INIBIÇÃO DO ÁCIDO ASCÓRBICO Testes físicos: Testes químicos: RESULTADOS TESTE DE POSITIVIDADE DA FITA REAGENTE TESTE DE INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO TESTE DE INIBIÇÃO DO ÁCIDO ASCÓRBICO Testes físicos: Testes químicos: DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 32

10 10 1 INTRODUÇÃO A dinâmica social contemporânea aponta para uma cultura da estética e da saúde física. Desde matérias em revistas e jornais, até propagandas veiculadas na internet, apontamse os benefícios da Vitamina C para retardar o envelhecimento, prevenir doenças e enriquecer a nutrição. Ao inserir as palavras uso da Vitamina C em sites de busca, surgem opções com indicação do uso na gestação, na pele, no cabelo, na indústria cosmética, para tratamento de flacidez e, o mais comum, em casos de gripe. O que indica que o uso do ácido ascórbico (AA) abrange tanto demandas do universo da estética quanto aquelas relacionadas à saúde. O acesso facilitado às informações que antes eram obtidas no contato com especialistas (médicos, nutricionistas, etc.), somado ao fato de ser uma substância de fácil obtenção, que não necessita de prescrição médica, gera uma apropriação de conhecimentos técnicos para fazer o indiscriminado, e por vezes excessivo, uso do AA. Este fenômeno do consumo elevado do AA pode ser percebido em diversos exames laboratoriais que identificaram a presença do AA nas mais diversas populações. A partir dessa leitura social e histórica importa saber que o AA é um forte agente redutor que pode gerar interferências nas reações químicas in vitro que por vezes passam despercebidas. Especificamente na urinálise, em algumas dosagens bioquímicas realizadas com fitas reagentes, o AA é responsável por resultados falsamente baixos, e às vezes, falsonegativos. Assim, a amostra de um paciente cujo marcador bioquímico resultaria em positivo, auxiliando em um diagnóstico, poderá ter seu resultado mascarado pela presença de AA gerando um diagnóstico equivocado. Desta forma é necessário alertar os profissionais de saúde sobre a interferência do AA sob alguns marcadores bioquímicos em fitas reagentes de urinálise, de modo a evitar diagnósticos incorretos, e mostrar a importância da existência de um marcador de AA nas fitas reagentes de urinálise, pois o mesmo possibilita uma tomada de ação neutralizante ou de redução das interferências nas análises. O presente trabalho teve como foco a análise físico-química, especificamente o uso da fita reagente, mostrando como ocorrem algumas reações e de que forma o AA poderia interferir nas mesmas, resultando em falha no diagnóstico. Além disso, este trabalho buscou alternativas de inibidores da ação do AA para eliminar a interferência desta substância nos testes bioquímicos de urina.

11 11 2 REFERENCIAL TEÓRICO Para fundamentar o trabalho contou-se com diversos autores que tratam desde a história da urinálise até uso das fitas reagentes e suas implicações nos exames de urina. 2.1 HISTÓRIA DA URINÁLISE A medicina laboratorial teve início com a análise da urina. Há séculos, já se utilizava a essa análise como meio de obter um diagnóstico. Vários registros que evidenciam esse estudo foram encontrados em desenhos nas cavernas, nos hieróglifos egípcios (exemplo: Edwin Smith Surgical Papyrus) e em quadros antigos. Observava-se nesses quadros a ilustração de médicos analisando amostras de urina que, mesmo não possuindo métodos sofisticados de exame, eram capazes de fazer observações básicas, como volume, cor, turvação, viscosidade, odor e, até mesmo, presença de açúcar quando formigas se aproximavam da urina, obtendo informações necessárias para um diagnóstico. Muitas vezes o diagnóstico era dado sem o médico olhar o paciente, sendo baseado somente nas informações desses exames (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). O mais interessante é que, mesmo não possuindo toda a metodologia sofisticada que temos hoje, os parâmetros que eram analisados há séculos ainda são utilizados para o diagnóstico nos dias atuais (FUNCHAL; MASCARENHAS; GUEDES, 2011). Não obstante, o exame de urina moderno se expandiu além dessas análises físicas, adicionando também a análise química e microscópica do sedimento urinário. Mas isso somente ocorreu a partir do século XVII, com a invenção do microscópio, que tornou possível a análise do sedimento urinário e a quantificação do exame microscópico do sedimento, desenvolvida por Thomas Addis (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Então, a partir do século XX, em decorrência do avanço do conhecimento científico e tecnológico, o exame de urina evoluiu e tornou-se uma ciência, conhecida hoje como urinálise (COLOMBELI; FALKENBERG, 2006). A urina é formada pelos rins a partir da filtração do sangue. Esse processo de filtração tem como objetivo manter o equilíbrio hidroeletrolítico do organismo, pois através do néfron, unidade funcional do rim, ocorre a eliminação de substâncias residuais e a reabsorção de substâncias importantes. Desta forma, dentro de cada néfron ocorre uma filtração de substâncias de baixo peso molecular e a formação do filtrado glomerular (constituído por água, glicose, sais, aminoácidos, uréia, cloreto e sódio). Em seguida, nos túbulos renais, ocorre a reabsorção das substâncias essenciais que retornam para a circulação sanguínea,

12 12 sendo, então, a urina constituída por substâncias que estão em excesso no organismo ou que são consideradas tóxicas. Em casos de distúrbio ou disfunção em algum órgão, a presença de determinadas substâncias na urina é que indicará a provável patologia (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Todavia, existem interferentes que podem impedir a leitura correta dos resultados quando eles mascaram a presença dessas substâncias indicadoras de patologias. Um grupo de interferentes com grande importância nas análises clínicas são os medicamentos que podem provocar resultados incorretos e, consequentemente, modificar o diagnóstico clínico laboratorial (MARTINELLO; SILVA, 2006). Diversos medicamentos exercem efeitos in vivo (na fisiologia do organismo), in vitro (no procedimento de análise), ou em ambos, devido à biotransformação hepática que gera metabólitos ativos responsáveis por interferir nos exames laboratoriais (BARROS; BARROS, 2010; FERREIRA et al., 2009). No que se refere ao exame físico-químico da urinálise, na qual se utiliza a fita reagente, percebe-se que o AA tem sido um importante interferente em vários marcadores bioquímicos, causando resultados falso-negativos (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). 2.2 PROCEDIMENTO DO EXAME DA URINA O exame laboratorial deve proporcionar resultados corretos de parâmetros, tanto normais, quanto patológicos. Assim, a análise da urina traz informações concisas, ao analista clínico, sobre prováveis patologias do trato urinário, permite uma avaliação da função renal e, inclusive, fornece indícios de doenças extra-renais (BARROS; BARROS, 2010; CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; COLOMBELI; FALKENBERG, 2006). Além disso, de acordo com a revisão feita por Strasinger (2009), o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) diz que o exame de urina não só auxilia no diagnóstico da doença, mas também na triagem de pacientes assintomáticos, no acompanhamento da evolução da doença e na avaliação da eficácia do tratamento (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Deste modo, devido à sua eficácia em diagnósticos, somada ao seu baixo custo, simplicidade e fácil obtenção da amostra, o exame de urina tornou-se um exame de rotina, respondendo bem à tendência da medicina preventiva atual: menores custos médicos (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009).

13 13 O exame urinário de rotina consiste em uma avaliação qualitativa e semi-quantitativa da urina que envolve três etapas: exame macroscópico, exame físico-químico e exame microscópico. Em cada uma destas etapas, podemos verificar a existência de alterações que indiquem disfunções no organismo (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012). O primeiro a ser feito é o exame macroscópico. Neste, o profissional avalia a coloração e o aspecto da urina. A urina pode apresentar desde a coloração amarelo pálido (indicando Diabetes mellitus), amarelo citrino (normal) ou até cores mais escuras como âmbar, vermelha ou verde que podem indicar, respectivamente, presença de bilirrubina, sangramentos do trato urinário ou infecções bacterianas. Já o aspecto da urina pode ser límpido, opalescente, turvo e até mesmo leitoso (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Logo após o exame macroscópico, é feito o exame físico-químico, que será elucidado no próximo parágrafo, seguido do exame microscópico da urina: a sedimentoscopia. Para essa última etapa é necessário centrifugar a amostra em um tubo cônico e desprezar o sobrenadante de forma que permaneça uma quantidade uniforme de urina e de sedimento, sendo mais frequente volumes de 0,5 e 1,0ml, para então realizar a ressuspensão. Só então se pode analisar o sedimento ao microscópio, uma vez que a concentração do sedimento aumenta a probabilidade de detecção de elementos que estejam presentes em menor quantidade na urina (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Na realização do exame físico-químico se utiliza tiras reagentes. Para tal procedimento é necessário que a urina esteja homogeneizada, sem conservantes, não tenha sido centrifugada e esteja em temperatura ambiente para evitar interferências nas reações enzimáticas da fita reagente. Essas tiras detectam constituintes bioquímicos da urina como glicose, sangue, bilirrubina, nitrito, corpos cetônicos, proteínas, leucócitos, urobilinogênio, além de marcadores físicos como o ph e a densidade. Cabe observar que outros fatores podem interferir na avaliação desses analitos bioquímicos, causando falsos diagnósticos (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). 2.3 FITA REATIVA O exame de urina é útil na identificação de várias doenças, sejam elas sistêmicas ou metabólicas, isso porque é possível contatar variações na urina que evidenciam essas doenças antes mesmo de se observar alteração no sangue (STRASINGER; DI LORENZO, 2009).

14 14 Para a realização da análise físico-química tem-se utilizado, nos laboratórios, a fita reagente. Elas tornam a determinação mais rápida e consistem em um método simples e de baixo custo (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; COLOMBELI; FALKENBERG, 2006). As fitas reagentes são tiras plásticas nas quais estão afixados pedaços de papel absorvente e neles estão impregnadas substâncias químicas. Esses pedaços de papel formam as áreas reagentes que, ao entrarem em contato com a amostra, alteram sua coloração. Assim, o resultado é interpretado a partir da comparação de coloração contida na fita reagente e na tabela cromática do fabricante da fita. A partir do resultado é possível ter indicações de diversas patologias (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). As tiras reagentes permitem realizar a análise bioquímica da urina, detectando os seguintes analitos (com pequenas variações entre fabricantes): densidade, ph, proteína, urobilinogênio, corpos cetônicos, leucócitos, sangue/hemoglobina, nitrito, glicose e bilirrubina, mas, por se tratar de reação química, a presença de determinadas substâncias na amostra (metabólitos de drogas e de alguns alimentos) pode interferir na reação, produzindo resultados falsos. Dentre os parâmetros analisados nas tiras, sabe-se que os quatro últimos citados acima sofrem interferência na presença de AA (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; COLOMBELI; FALKENBERG, 2006). 2.4 ÁCIDO ASCÓRBICO Assim como em outros exames clínico-laboratoriais, na urinálise existem diversos interferentes que dificultam a análise e alteram resultados. Estes interferentes podem ser desde um armazenamento da urina em recipiente inadequado, ou até mesmo o uso de medicamentos que reagem in vivo, in vitro, ou ambos. Dentre os medicamentos que causam interferência, destacou-se neste trabalho o AA, responsável por falsos valores em teste laboratorial in vitro (MARTINELLO; SILVA, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Vitamina C é um termo bastante usado para referenciar o AA e o ácido deidroascórbico que são as formas reduzida e oxidada, respectivamente, da vitamina C (BOHNDIEK et al., 2011). O AA é um antioxidante hidrossolúvel com importante atuação em diversas funções biológicas. Dentre estas, ele pode atuar como cofator de inúmeras enzimas envolvidas em reações biológicas, como exemplo, sendo cofator das enzimas lisil e prolilhidroxilase,

15 15 essenciais na biossíntese de colágeno; cofator da enzima dopamina β-hidroxilase que converte neurotransmissor dopamina a norepinefrina; e na absorção do ferro dietético pelo trato gastrintestinal devido redução da forma férrica a ferrosa (BOHNDIEK et al., 2011; CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; FUCHS; WANNMACHER, 2010; GOLAN et al., 2011; MANELA-AZULAY et al., 2003; SEVERO, 2012). Apesar dessa atuação significativa em várias reações do metabolismo humano, a vitamina C não pode ser sintetizada pelo organismo humano devido uma mutação na codificação do gene responsável pela enzima L-gulono-1,4-lactona desidrogenase, envolvida na biossíntese de AA. Assim, esse gene não é transcrito, ainda que presente no genoma (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; ZAMUDIO, 2007). Desta forma, é necessário suprirmos a deficiência endógena através do consumo de alimentos; porém, por possuir propriedades antioxidantes, os suplementos de vitamina C têm sido consumidos demasiadamente (COSTA; MENDES; SUMITA, 2012; MARTINELLO; SILVA, 2006). Uma das causas desse consumo abusivo está relacionada à busca da prevenção do envelhecimento. Pois, por ter propriedades antioxidantes, a vitamina C impede algumas oxidações químicas formadoras de radicais livres. Tais radicais livres seriam responsáveis por acelerar o processo de envelhecimento através da morte celular causada pelo estresse oxidativo (peroxidação de ácidos graxos da bicamada lipídica) (HIRATA; SATO; SANTOS, 2004). O AA é absorvido facilmente por nosso organismo pelo trato intestinal, mais especificamente no jejuno e no íleo. Em 24 horas o intestino é capaz de absorver aproximadamente 1.200mg de AA que se distribui para todo o organismo a fim de exercer suas funções biológicas. Uma ingestão média 45 a 75mg/dia de AA gera uma reserva de aproximadamente mg em um adulto sadio e quando a ingestão é maior que 220mg/dia, a reserva eleva para a 2.800mg podendo chegar até mg se a ingestão ultrapassar 1g/dia de AA (ARANHA et al., 2000; MARTINELLO; SILVA, 2006). Quando a ingestão é feita em quantidades fisiológicas, a eliminação ocorre por biotransformação seguida de excreção na urina por se tratar de uma substância hidrossolúvel. Nesse caso, a eliminação ocorre tanto na forma inalterada (ativa) como também na forma oxidada, que são seus metabólitos, como exemplo o ácido deidroascórbico. Já a ingestão de doses elevadas faz com que os níveis máximos de reserva nos tecidos sejam alcançados e o excesso seja diretamente excretado pela urina na forma ativa. A reabsorção de AA nos túbulos

16 16 renais é de 97 a 99,5%, isso quando a sua presença no sangue, ascorbemia, está em uma concentração menor que 0,8mg/dl. Quando o limiar de 1,8mg/min é ultrapassado (aproximadamente 1,5mg/dl), a reabsorção reduz de forma significativa (ARANHA et al., 2000; FUCHS; WANNMACHER, 2010). O excesso de ingestão de AA muitas vezes pode ser observado através de exames laboratoriais, em particular, no exame urinário, no qual o AA tem sido um agravante para os analistas clínicos na etapa da análise físico-química que utiliza a fita reagente (COSTA; MENDES; SUMITA, 2012; MARTINELLO; SILVA, 2006). A presença de AA em amostras biológicas tem sido responsável por resultados falsamente baixos, ou mesmo falso-negativos. Essa interferência in vitro deve-se ao fato de esse ácido possuir capacidade expressiva de redução, o que permite interagir com constituintes dos reagentes analíticos do parâmetro bioquímico inibindo as reações de oxirredução (COSTA; MENDES; SUMITA, 2012; MARTINELLO; SILVA, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). O resultado da oxidação in vitro do AA gera o radical ascorbila e o ácido desidroascórbico (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007). Devido a existência desses produtos de oxidação, Martilello e Silva (2006) investigaram o efeito do ácido desidroascórbico ao adicionar concentrações crescentes ao soro e realizar as dosagens bioquímicas. Porém, os resultados demonstraram que o mesmo não interferiu nas reações (MARTINELLO e SILVA, 2006). Cada comprimido de AA possui 500 mg dessa composição e a posologia do mesmo é de 1 comprimido ao dia para adultos ou crianças maiores de 12 anos, sendo que, em casos carenciais, podem ser administrados até 2 comprimidos ao dia (VITAMINA C, 2013). Segundo a Recommended Dietary Allowance, recomendações dietéticas desenvolvidas para americanos e canadenses, o consumo de vitamina C para crianças de 4 a 8 anos deve ser de 25 mg/dia, para mulheres de 19 a 70 anos, 75mg/dia e para homens de 19 a 70 anos, 90mg/dia. Já Manela-Azulay (2003) avalia que, para manter o estado de saturação da vitamina C, recomenda-se doses de 100mg/dia (INSTITUTE OF MEDICINE, 2013; MANELA- AZULAY et al., 2003; MARCHIONI; SLATER; FISBERG, 2004). Em um estudo citado por Costa et al. (2012), se identificou que uma dose oral de 250 mg de vitamina C determina, na urina, uma concentração média de 31mg/dl de AA, enquanto uma dose de 500mg elevaria essa concentração para 62mg/dl. Como a inibição é diretamente proporcional à concentração de AA presente na amostra, se o indivíduo consumir em excesso,

17 17 consequentemente a interferência no exame urinário será mais evidente (COSTA; MENDES; SUMITA, 2012). A interferência do AA na fita reagente pode ser observada em alguns marcadores bioquímicos: glicose, bilirrubina, nitrito e sangue/hemoglobina (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). 2.5 PRINCÍPIOS DAS REAÇÕES Os marcadores bioquímicos (glicose, bilirrubina, sangue e nitrito) que sofrem interferência do AA, reagem, cada um, de acordo com os princípios abaixo apresentados: Glicose Baseia-se na ação da glicose-oxidase para catalisar a reação entre a glicose e o oxigênio presente no meio ambiente, produzindo, desta forma, ácido glicônico e peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). Em uma segunda etapa, a enzima peroxidase catalisa a reação entre um cromógeno (iodeto de potássio ou tetrametilbenzidina) e o peróxido, produzido anteriormente, para a formação de um complexo oxidado colorido que revela a glicosúria. Nessa detecção de glicose o AA, devido suas propriedades antioxidantes, pode inibir a reação de oxidação do cromógeno e gerar leituras falso-negativas (COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; COSTA; MENDES; SUMITA, 2012; PEREIRA; NETO, 2013). Segundo Cezar et al. (2012), as marcas de fitas reagentes Bioeasy, Labor import, Prodimol e Cortez citam a presença de grande quantidade de AA como um importante causador de resultados falso-negativos (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012). Cada fita terá uma sensibilidade específica para a interferência da vitamina C, mas segundo a bula da Mission (2010), os resultados podem ser alterados a partir de concentrações 10mg/dl de AA (MISSION, 2010), já a Uri-Teste 11 cita que a presença de pequena quantidade como 5mg/dl de AA já pode alterar o resultado caso haja uma concentração baixa de glicose na urina (URI- TEST 11, 2002).

18 Bilirrubina Para este parâmetro utiliza-se a reação de azo-junção, ou seja, reação entre a bilirrubina e um sal de diazônio (o 2,4-dicloroanilina diazônio ou o 2,6-diclorobenzenodiazônio-tetrafluoroborato) em meio ácido produzindo uma coloração que será posteriormente interpretada. Mesmo com métodos muito sensíveis, a bilirrubina não é detectável, desse modo, até quantias de traços de bilirrubina já indicam alguma disfunção e exigem uma investigação mais apurada já que indica uma condição patológica subjacente (COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; MISSION, 2010; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Nesse contexto, em uma amostra de urina em que há presença de bilirrubina, o AA poderia interferir na reação acima citada ao se combinar com o sal diazônio, o que impediria a reação do mesmo com a bilirrubina, resultando em falso-negativo e, consequentemente, impediria que o analista clínico liberasse um laudo correto, não informando a presença da bilirrubinúria. Essa interferência ocorre, segundo Strasinger (2009), quando há uma concentração superior a 25mg/dl de AA (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Os fabricantes Labtest, Sensitive, Cortez, Biocolor e Labor import mencionam em suas bulas a interferência do AA como causador de resultados falso-negativos por inibir o teste (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012) Sangue Na detecção de hemoglobina/sangue, a fita reagente utiliza a atividade pseudoperoxidativa da hemoglobina. Essa catalisa a reação de oxidação entre o peróxido de hidrogênio e o cromógeno (tetrametilbenzidina). O resultado é a formação de um cromógeno oxidado de coloração verde azulada (COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). O fabricante Cortez declara que altas concentrações de AA causam resultados falsonegativos, impedindo a ação do peróxido e, então, a reação oxidativa, inibindo a formação da cor. O fabricante Standard menciona que essa interferência ocorre a partir de concentrações superiores a 50mg/dl de AA (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009), porém se a concentração de sangue for baixa, a presença de apenas 5mg/dl já pode alterar o resultado (URI-TEST 11, 2002).

19 19 Segundo Strasinger (2009), o fabricante Multistix utilliza um peróxido menos sensível a ação redutora do AA, já o fabricante Chemstrip recobre a área reagente com iodato para que oxide o AA e o mesmo não altere a reação (STRASINGER; DI LORENZO, 2009) Nitrito O teste bioquímico da prova do nitrito tem como fundamento a capacidade das bactérias gram-negativas reduzirem nitrato (componente normal na urina) a nitrito. Em meio ácido, o nitrito reage com uma amina aromática (sulfanilamida ou ácido p-arsanílico) para formar um sal diazônio. Em seguida, este último reage com 3-hidróxi-1,2,3,4-tetraidrobenzil- (H)-quinolina produzindo a coloração que será interpretada. A positividade deste marcador indica, indiretamente, a presença dessas bactérias gram-negativas, havendo, possivelmente, uma infecção no organismo do paciente. Porém, a presença do AA pode interferir na reação do diazo. Desta forma, a sensibilidade do resultado de uma amostra com grau de infecção elevada poderia ser alterada, com um falso-negativo (COLOMBELI; FALKENBERG, 2006; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Os fabricantes Standard, Sensitive, Bioeasy, Labtest e Labor import falam que altas concentrações de AA podem ocasionar resultados falsamente negativos (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012). A bula da Mission (2010) diz que essa interferência já pode ser observada em valores de AA acima de 30mg/dl em urina contendo menos que 0,05mg/dl de íons de nitrito (MISSION, 2010). 2.6 IMPORTÂNCIA DO RESULTADO PARA OS DIVERSOS DIAGNÓSTICOS Diante de tantas patologias que podem ser correlacionadas a analitos dosados na análise físico-química da urina, percebe-se a importância de seguir protocolos para evitar diagnósticos equivocados (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012). Devido ao baixo custo, simplicidade, praticidade e rapidez de execução, para o exame físico-químico da urina, utilizam-se as fitas reagentes. Estas, por sua vez, detectam presença de analitos que serão interpretados pelo médico para, então, somado a outras informações, obter o diagnóstico do paciente (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012). A fita reagente de urina realiza uma dosagem semi-quantitativa da glicose. Essa dosagem pode ser utilizada para o diagnóstico e acompanhamento de Diabetes mellitus,

20 20 contudo, não é de grande importância no controle da glicemia, uma vez que, para detectar glicosúria, a concentração sérica de glicose já deve estar superior ao limiar renal (180mg/dl), em casos de função renal normal. Todavia, a detecção de glicosúria na amostra de um paciente com glicemia normal indica distúrbios na reabsorção tubular, já que quase toda a glicose filtrada pelo glomérulo renal deve ser reabsorvida pelos túbulos proximais (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; PEREIRA; NETO, 2013; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Outros distúrbios podem estar relacionados a doenças como hipertiroidismo, pancreatite, acromegalia, infecções graves quando há uso de corticosteróides, feocromocitoma e outras. Isso por que vários hormônios que estão elevados nesses distúrbios (tiroxina, glucagon, hormônio do crescimento, cortisol e adrenalina) agem em oposição à insulina, o que eleva glicose sérica e causa glicosúria (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; FUNCHAL; MASCARENHAS; GUEDES, 2011; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Já a dosagem de bilirrubina na urina é um importante indicador de diagnóstico de obstrução do ducto biliar, cirrose e hepatites. Além disso, a detecção de ausência ou presença de bilirrubina na urina possibilita a identificação e diferenciação das causas de icterícia clínica. Um exemplo é em casos de hemólise acentuada e casos de obstrução biliar. No primeiro eleva-se a bilirrubina indireta que é insolúvel, ou seja, não aparece na urina por não ser excretava pelos rins. Já no segundo, a obstrução impede que a bilirrubina direta siga ao intestino para ser biotransformada, desta forma, por ser solúvel, ela é filtrada pelos rins e aparece na urina (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; FUNCHAL; MASCARENHAS; GUEDES, 2011; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). A hematúria, que é a detecção de hemácias na urina, está relacionada a distúrbios renais ou geniturinários, tais como: traumatismo, cálculo renal, tumor, pielonefrite, doença glomerular e exposição a substâncias tóxicas. Mas também pode ser devido a causas não patológicas como menstruação e exercício físico intenso. Já a hemoglobinúria, presença de hemoglobina livre na urina, pode ser detectada quando ocorre lise de hemácias com consequente filtração pelo glomérulo. Essa ocorre principalmente em casos de infecção, queimadura grave, exercício físico intenso, anemias hemolíticas e reações transfusionais, em que a quantidade de hemoglobina ultrapassa a capacidade de formação do complexo hemoglobina-haptoglobina, que impediria a filtração da hemoglobina pelos glomérulos renais (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009).

21 21 O resultado positivo para o marcador de nitrito é importante para o diagnóstico sugestivo de infecção urinária, pois as bactérias gram-negativas principais causadoras de infecção no trato urinário estarão presentes na urina e essas são capazes de reduzir o nitrato em nitrito, positivando o teste. Além disso, serve como método de triagem, já que diferencia uma infecção causada por bactérias gram-negativas e por gram-positivas (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009). O teste de nitrito possibilita detectar cistite, muitas vezes assintomática; pielonefrite, que, se não tratada, pode causar lesão ao tecido renal e até evoluir para septicemia; e também pode ser útil na avaliação da terapêutica utilizada (STRASINGER; DI LORENZO, 2009). Desta forma, é perceptível a importância de se obter resultados fidedignos para tais marcadores, uma vez que estes influenciam diretamente na conduta do médico para com o paciente. Assim, ressalta-se a importância da presença de um marcador de ácido ascórbico nas fitas reagentes, pois sua detecção serve como alerta de possíveis incorreções nas determinações de glicose, sangue, bilirrubina e nitrito, uma vez que o mesmo interfere nessas dosagens (CEZAR; SANTOS; FUNCHAL, 2012; STRASINGER; DI LORENZO, 2009).

22 22 3 MATERIAIS E MÉTODOS Foram realizadas análises em amostras de urina sintética preparadas com adição de bilirrubina, nitrito de sódio, glicose e hemoglobina em concentrações conhecidas, testadas sem adição de AA e, posteriormente, acrescidas de concentrações determinadas desse ácido. Preparou-se diferentes diluições de cada soluto e, com cada diluição, testou-se as seguintes concentrações de AA: 25, 50 e 100mg/dl. Por fim, testou-se diferentes agentes neutralizantes de AA. Todas as análises ocorreram no Laboratório Escola e Laboratório de Microbiologia na Universidade Católica de Brasília. 3.1 TESTE DE POSITIVIDADE DA FITA REAGENTE Inicialmente foi feito o teste de positividade da fita reagente de urina, antes da adição de AA, para comprovar a reatividade de cada soluto nas diluições preparadas e verificar se as concentrações utilizadas correspondiam aos valores indicados pela fita. Utilizando água destilada em ph de 5,5 a 6,0 e uma densidade acima de 1000, para simular as condições de ph e densidade comuns da urina, adicionaram-se apenas as substâncias que seriam avaliadas. As concentrações para cada parâmetro foram: Hemoglobina: concentrações de 0,015, 0,150 e 0,75mg/dl Glicose: concentrações de 100, 250, 500, 1000 e 2000mg/dl Nitrito: concentrações de 0,05, 0,5 e 1,0mg/dl Bilirrubina: concentrações de 0,5, 1,0 e 3,0mg/dl Para preparação das soluções-problema, utilizou-se os seguintes sais/soluções-base: Glicose utilizou-se alpha-d-glucose anhydorus da marca Synth; Hemoglobina utilizou-se o kit Labtest Padrão de hemoglobina; Nitrito utilizou-se o reagente nitrito de sódio da Synth e para bilirrubina utilizou-se o kit Labtest Padrão de bilirrubina. Transferiu-se 10ml de cada concentração para tubos de ensaio e procedeu-se com a leitura através da fita reagente de urina.

23 TESTE DE INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO Após o teste de positividade da fita reagente, realizou-se o teste de interferência do AA com o reagente L-Ascorbic Acid da Sigma-Aldrich. Com esse teste buscou-se verificar quais as concentrações de AA são interferentes em cada soluto, em suas diversas concentrações. A partir de uma solução de AA a 500mg/dl foram preparadas as seguintes soluções: 30, 50 e 100mg/dl. Então, para cada concentração de um determinado parâmetro, utilizou-se as diferentes concentrações de AA citadas acima. Desta forma, verificou-se quais concentrações do AA acarretam resultados falso-negativos. 3.3 TESTE DE INIBIÇÃO DO ÁCIDO ASCÓRBICO A partir dos testes anteriores foram selecionadas as concentrações ideais de glicose e de AA para estudo das possíveis ações neutralizantes, como mostra a quadro abaixo. Os testes para inibição da interferência do AA foram divididos em testes físicos e testes químicos, relatados a seguir. Quadro 1 Concentrações de glicose e de ácido ascórbico utilizadas nos testes de inibição do ácido ascórbico. Concentração de glicose (mg/dl) Concentração de AA (mg/dl) Testes físicos: a) Aeração: Teste realizado utilizando-se o vortex. Os tubos contendo concentrações de 100, 250 e 500mg/dl de glicose, tanto a 50mg/dl, quanto a 100mg/dl de AA, foram agitados por 10, 20 e 30 minutos no vortex e verificada, nesses mesmos intervalos, uma possível redução da interferência do AA, totalizando 1 hora. Em seguida, a verificação se deu em intervalos de 30 minutos, totalizando 2 horas. Essas observações foram feitas com a utilização de tiras reagentes. b) Luz UV: Teste com luz ultravioleta (radiação UV) em câmara de fluxo laminar.

24 24 Na câmara de fluxo laminar os tubos com as concentrações de 100, 250 e 500mg/dl de glicose, a 50 e 100mg/dl de AA, foram expostos à luz UV utilizando-se os mesmos intervalos e avaliações feitos no teste de aeração. c) Exposição natural ao ar: Em frasco de coleta de urina contendo água destilada. Acrescentou-se AA para obter as concentrações de 50mg/dl e de 100mg/dl. As amostras ficaram expostas a condições ambientes, com a tampa aberta, durante um período de 30 minutos a 2 horas, procedendo-se com a dosagem através da fita reagente em intervalos de 30 em 30 minutos Testes químicos: Para as concentrações de glicose a 100, 250 e 500mg/dl adicionadas às concentrações de AA de 50 e 100mg/dl, realizou-se o teste com os agentes neutralizantes relatados abaixo: a) Nitrito: Os testes foram realizados com nitrito a 10%, adicionado gota a gota (50µl), em cada frasco, até atingir 1ml. Para cada adição de 50 µl de nitrito, realizava-se a homogeneização e verificava-se a possível ação do nitrito sob o AA utilizando a fita reagente. b) Cloreto férrico: Para esse teste utilizou-se solução de cloreto férrico a 10%. Essa solução foi adicionada nos frascos, gota a gota, totalizando 1ml. A cada adição do agente neutralizante realizava-se a dosagem com a fita reagente. c) Ácido bórico (AB): Como a solução de AB a 10% é uma solução supersaturada, ou seja, não é totalmente solúvel em água ficando parte do material ressuspendido, optou-se por testar a 5%. Para esse teste separou-se dois grupos com tubos contendo soluções de AA a 50 e a 100mg/dl. Nos dois grupos adicionou-se, respectivamente, 100µl, 500µl e 1ml de ácido bórico a 5%. Como demonstrado no quadro abaixo. As dosagens foram realizadas, após 30 minutos, com utilização de fita reagente, para verificar a ação do AB sob o AA. Quadro 2 Concentrações de ácido bórico adicionadas a concentrações de ácido ascórbico. 1º Grupo 2º Grupo 50mg/dl de AA + 100µl de AB 100mg/dl de AA + 100µl de AB 50mg/dl de AA + 500µl de AB 100mg/dl de AA + 500µl de AB 50mg/dl de AA + 1ml de AB 100mg/dl de AA + 1ml de AB

25 25 4 RESULTADOS A partir dos testes realizados evidenciou-se, com o uso da fita reagente, que o AA é um importante interferente na análise da urina. Entretanto não foi possível encontrar alternativa de inibidores da ação do AA, conforme detalhamento a seguir: 4.1 TESTE DE POSITIVIDADE DA FITA REAGENTE No teste de positividade da fita reagente, os resultados estavam de acordo com a concentração preparada. Abaixo se observa as concentrações dos solutos e os resultados obtidos a partir da leitura da fita reagente. Quadro 3 Resultados das leituras das concentrações de glicose, hemoglobina, nitrito e bilirrubina realizadas em fita reagente de urina. SOLUTOS Glicose Hemoglobina Nitrito Bilirrubina CONCENTRAÇÕES (mg/dl) LEITURA DA FITA (Resultados) (±) (+) (++) (+++) (++++) 0,015 0,150 0,75 (±) (++) (+++) 0,05 0,5 1,0 Positivo rosa claro Positivo rosa Positivo - rosa escuro 0,5 1,0 3,0 (+) (++) (+++) 4.2 TESTE DE INTERFERÊNCIA DO ÁCIDO ASCÓRBICO Já o teste de interferência do AA, nas concentrações de 30, 50 e 100mg/dl tiveram os seguintes resultados para cada parâmetro: a) Hemoglobina: concentrações de 0,015, 0,150 e 0,75mg/dl. O AA a 30mg/dl não interferiu na dosagem das diferentes concentrações de hemoglobina. Enquanto a concentração de hemoglobina a 0,75mg/dl não sofreu

26 26 interferência em nenhuma concentração do AA. Quanto às concentrações de 50 e 100mg/dl de AA houve igualdade de interferência conforme quadro a seguir: Quadro 4 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de hemoglobina em fita reagente de urina. Concentração de Resultado da fita reagente Hemoglobina 0,015mg/dl Negativo 0,15mg/dl + b) Glicose: concentrações de 100, 250, 500, 1000 e 2000mg/dl. O AA, em nenhuma concentração testada, interferiu na dosagem de glicose 1000mg/dl. O AA a 30mg/dl não interferiu nem mesmo na dosagem da menor concentração de glicose (100mg/dl). Houve interferência nas concentrações conforme quadro abaixo: Quadro 5 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de glicose em fita reagente de urina. Concentrações de AA 50mg/dl Concentrações de Glicose 100mg/dl 250mg/dl 500mg/dl Intervalo entre ± e Intervalo entre + e Sem negativo ± interferência ± 100mg/dl Negativo. Intervalo entre ± e negativo c) Nitrito: concentrações de 0,05, 0,5 e 1,0mg/dl Nitrito a 0,05mg/dl sofreu interferência de todas concentrações de AA resultando em falso negativo. Nas demais concentrações observaram-se os resultados seguintes: Quadro 6 - Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de nitrito em fita reagente de urina. Concentrações Concentrações de Nitrito de AA 0,5mg/dl 1,0mg/dl 30mg/dl Positivo rosa claro Positivo rosa 50mg/dl Positivo rosa muito claro Positivo rosa claro 100mg/dl Positivo rosa muito claro Positivo rosa muito claro d) Bilirrubina: concentrações de 0,5, 1,0 e 3,0mg/dl O AA a 50 e 100mg/dl resultou em falso negativo para todas as concentrações de bilirrubina testadas. Já a interferência do AA a 30mg/dl pode ser demonstrada no quadro a seguir:

27 27 Quadro 7 Resultado da interferência do ácido ascórbico na leitura de bilirrubina em fita reagente de urina. Concentrações Concentrações de Bilirrubina de AA 0,5mg/dl 1,0mg/dl 3,0mg/dl 30mg/dl Negativo Negativo TESTE DE INIBIÇÃO DO ÁCIDO ASCÓRBICO Os testes com o uso de agentes neutralizantes da ação do AA foram realizados em concentrações determinadas de AA e em concentrações determinadas de glicose com AA Testes físicos: a) Aeração: Nos intervalos da primeira hora não houve redução de AA. Após 1h30min verificou-se que houve uma leve redução da interferência do AA, porém ainda não era significativa. Somente após 2 horas foi possível observar reduções conforme segue: as concentrações de AA reduziram de 50mg/dl para negativo e de 100mg/dl para ++; enquanto as concentrações de glicose resultaram em ±, + e ++. b) Luz UV: Nos primeiros intervalos não houve redução de AA e nem da sua respectiva interferência sobre a dosagem de glicose. Em 1h30min verificou-se uma redução de AA de 50mg/dl para ++ e de 100mg/dl para +++. Nesse momento os valores de glicose detectados na primeira redução de AA foram ±, + e ++; e na segunda, foram: intervalo entre ± e negativo, intervalo entre + e ±, ++. Somente após 2 horas verificou-se redução total da ação do AA sobre o marcador de glicose. Nesse momento, os valores de glicose eram de ±, + e ++. c) Exposição natural ao ar: Nos intervalos da primeira hora não se verificou redução de AA. A partir de 1h30min os frascos contendo concentrações de 50 e 100mg/dl de AA tiveram os respectivos resultados: ++ e +++. Após 2 horas apresentaram os resultados de negativo e Testes químicos: a) Nitrito: A adição de 50µl de nitrito a 10% não alterou a dosagem de AA. Após adicionar 100µl já foi possível observar um resultado falso positivo para o marcador de nitrito, porém, sem que ocorresse alteração de AA e de sua ação sob

28 28 a dosagem de glicose. Mesmo após adicionar 1ml desse agente neutralizante, não houve alteração nos valores de AA e nem mesmo sua interferência sob a dosagem de glicose. b) Cloreto férrico: Após adicionar 200µl de cloreto férrico a 10% já era possível observar um resultado falso positivo para o marcador de sangue (+), sem haver neutralização da interferência do AA. Mesmo após adicionar 1ml de cloreto férrico, não foi possível observar redução de AA e sua respectiva interferência sob o marcador de glicose. Além disso, a positividade equivocada do marcador de hemoglobina já estava tendo como resultado ++. c) Ácido bórico: Utilizando solução de ácido bórico a 5%, observou-se que, após 30 minutos, as concentrações de AA permaneceram as mesmas (50 e 100mg/dl) nos 2 grupos testados.

29 29 5 DISCUSSÃO No primeiro teste realizado, teste de positividade da fita reagente, verificou-se que as concentrações testadas correspondiam aos resultados descritos na fita reagente. Desse modo, foi possível prosseguir com os testes seguintes. Na segunda etapa, teste de interferência do AA, observou-se que o mesmo interferiu de forma diferente de acordo com as concentrações dos marcadores avaliados. Não se observou interferência do AA a 30mg/dl sobre a reação da hemoglobina, confirmando a informação apresentada pelo fabricante da fita reagente (Uriscan). As interferências verificadas a partir de 50mg/dl de AA na dosagem de hemoglobina e a não observação de interferência quando a concentração de hemoglobina era alta na amostra (0,75mg/dl) foram condizentes com as informações encontradas na bula da fita reagente (Uriscan), que relata interferência do AA para baixos valores de sangue na urina. Além disso, essa interferência está de acordo com o relato do autor Strasinger (2009), que fala sobre a associação do AA com os resultados falso-negativos na reação para sangue. Para o marcador de glicose a interferência do AA depende da quantidade do açúcar. Nos testes realizados, a interferência ocorreu a partir de uma concentração de 50mg/dl de AA. Esses dados confirmam estudos feitos por Costa et al. (2012) e também vai de acordo com o autor Strasinger (2009), que fala sobre o AA causar resultado falso-negativo. A informação do fabricante da fita reagente (Uriscan) relata não somente a possibilidade de um falso-negativo, mas também cita que a partir de 50mg/dl já é observado interferência do AA em amostras com baixo nível de glicose. Segundo a bula da Mission (2010), os resultados na dosagem de glicose podem ser alterados a partir de concentrações de 10mg/dl de AA (MISSION, 2010), já a Uri-Teste 11 cita o valor de 5mg/dl de AA caso a amostra tenha concentração baixa de glicose (URI-TEST 11, 2002). Costa et al. (2012) refere em seu estudo que níveis de AA na concentração de 20mg/dl não evidenciariam qualquer grau de interferência nos resultados da glicose, como de fato foi constatado, a partir do momento em que a concentração de 30mg/dl de AA não causou qualquer interferência possível de ser identificada. Concentrações muito elevadas de glicose, 1000mg/dl, fazem com que a interferência, se houver, não seja notada. Se essa concentração de glicose for 500mg/dl e a concentração de AA for 50mg/dl também não é observado nenhuma interferência no resultado. Contudo, o autor Colombeli (2006) relata em seu estudo que resultados falso-negativos são improváveis

30 30 em uma concentração de glicose 100mg/dl, mesmo na presença de elevada concentração de ácido ascórbico. Para o marcador de nitrito, como o resultado na fita só é liberado como negativo ou positivo, o que determinou uma maior ou menor interferência do AA foi a intensidade da cor da almofada de reação, não possibilitando determinar as concentrações aproximadas. Para valores baixos de nitrito (0,05mg/dl), qualquer concentração de AA foi capaz de causar falso-negativo. Esse resultado contradiz a informação da bula (Uriscan) que relata haver interferência em baixo nível de nitrito (<0,03mg/dL) na presença de AA > 25mg/dl, porém causando resultado falso-positivo. Strasinger (2009) e Cezar et al. (2012) dizem que altas concentrações de AA resultam em falso-negativos para o marcador de nitrito. Nos testes realizados foi possível verificar essa interferência pela redução da intensidade da cor da almofada de reação. A bula da Mission (2010) já cita valores, identificando que é possível observar interferência em valores de AA > 30mg/dl em amostra contendo menos que 0,05mg/dl de íons de nitrito. Para o marcador de bilirrubina verificou-se que a presença de AA a uma concentração a partir de 30mg/dl já causa resultados falso-negativos na maioria das concentrações testadas de bilirrubina, exceto para a maior concentração desse marcador (3,0mg/dl), em que a presença de 30mg/dl de AA apenas identifica como sendo um valor abaixo do que de fato está presente na amostra. Segundo Strasinger (2009), o AA a uma concentração >25mg/dl já é capaz de reduzir a sensibilidade do teste. A partir da verificação da interferência do AA sob esses marcadores, decidiu-se realizar testes de inibição do mesmo utilizando alguns métodos físicos e alguns reagentes químicos. Para essa etapa, os testes foram feitos com concentrações de glicose e AA e outros somente com o AA, com o intuito de verificar a redução da ação do AA. A partir dos testes físicos relatados no tópico para inibição do AA, verificou-se que há necessidade de um tempo muito longo para conseguir inibir o mesmo, o que acarretaria em alteração na dosagem de outros parâmetros. Nos testes com agentes neutralizantes químicos, apesar do tempo limite (2h) e volume limite (1mL), não foi possível reduzir a concentração de AA, ou mesmo inibir a ação do mesmo sobre um marcador. Além disso, observou-se resultados falso-positivos para marcador de hemoglobina e de nitrito ao usar os reagentes cloreto férrico e nitrito respectivamente.