KIT DE TESTE DE ELISA PARA PSEUDOMONAS CF- IgG

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1 SSI PSEUDOMONAS-CF-IGG ELISA KIT For the quantitative measurement of the antibody level to P. aeruginosa in human serum samples for in vitro diagnostic use KIT DE TESTE DE ELISA PARA PSEUDOMONAS CF- IgG Para medição quantitativa do nível de anticorpos contra P. aeruginosa em amostras de soro humano para uso de diagnóstico in vitro Indicação O Pseudomonas CF-IgG ELISA Kit (kit de teste de ELISA para Pseudomonas CF- IgG) do SSI Diagnostica é de uso para diagnóstico in vitro e serve para medição quantitativa do nível de anticorpos para P. aeruginosa em amostras de soros humano pelo método de ensaioimuno enzimático (teste de ELISA). Descrição O Pseudomonas CF-IgG ELISA Kit contém: 1 microplaca para o teste de ELISA (Maxisorp ELISA plate NUMC )- conserve em temperatura ambiente 9 mg de antígenos liofilizados (Pooled Antigen) de sonicação dos sorotipos de O1 a O17 da P. aeruginosa - conserve em temperatura ambiente 1 frasquinho com antissoro humano padrão de pool (Pooled Standard Human Antiserum)- conserve em temperatura ambiente 0,5 ml de água destilada estéril (Sterile Distilled Water) - conserve em temperatura ambiente 12 ml de tampão de cobertura (Coating Buffer) - conserve em temperatura ambiente 250 ml de tampão de lavagem (Washing Buffer) - conserve em temperatura ambiente 250 ml de tampão de diluição (Dilution Buffer) - conserve em temperatura ambiente 0,1 ml de anticorpos conjugados Coelho Anti-humana IgG a HRP (Rabbit-Anti-Human IgG HRP) - conserve em temperatura de refrigeração de 2 C a 8 C 12 ml de ácido sulfúrico (2M), (Sulphuric Acid 2M) - conserve em temperatura ambiente 12 ml de Multi substrato TMB (TMB Plus Substrate) - conserve na temperatura de 2 C a 8 C Equipamento requerido, mas não fornecido: Leitor (espectrofotômetro) de ELISA com densidade ótica (DO) de 450nm Principio A distinção entre a infecção crônica e a intermitente colonização por P. aeruginosa pode ser verificada pela medição de anticorpos IgG contra P. aeruginosa. Durante uma infecção crônica há aumento pronunciado das respostas imunológicas com nível alto de anticorpos IgG, o que não ocorre com pacientes com infecção de intermitente colonização por P. aeruginosa. O nível de anticorpos em pacientes com infecção crônica está diretamente relacionado à severidade da infecção. O resultado do teste deve ser acompanhado por resultados de cultura de amostras para P. aeruginosa.

2 O Pseudomonas CF-IgG ELISA Kit é indicado para um tradicional teste de ELISA. Foram detectados mais 64 antígenos diferentes com o antissoro de pool do Pseudomonas CF-IgG ELISA Kit. Os resultados com o antissoro humano padrão no teste são usados para calcular a concentração de antissoro de amostras de pacientes. Limitação O nível de anticorpos não específicos devido às reações cruzadas entre a P. aeruginosa e outras espécies de bactérias são baixos e correlatados a taxonomia. Procedimento 1-A ordem das reações na microplaca de ELISA As amostras de soro padrão, de pacientes e os controles devem ser feitos em serie de duplicadas. Exemplo da ordem das amostras na microplaca: 1ªAMOSTRA PADRÃO DE SORO 1:200 2ªAMOSTRA PADRÃO DE SORO 1:400 3ªAMOSTRA PADRÃO DE SORO 1:800 4ªAMOSTRA PADRÃO DE SORO 1: ªAMOSTRA DE PACIENTE 2ªAMOSTRA DE PACIENTE Recomendamos fazer pelos menos 4 amostras de paciente ao mesmo tempo para um melhor aproveitamento do kit de teste de ELISA. 2-Preparação de soluções diluídas: Solução A: Solução diluída de antígeno para cobertura da microplaca ELISA (é usada na 1ª etapa): Adicione 100 µl de água destilada estéril no frasquinho que contém 9 mg de antígenos da Pseudomonas (Pseudomonas-CF-IgF Antigen) e reconstitua o antígeno liofilizado obtendo assim uma solução de reconstituição de antígeno. Dilua a solução de reconstituição de antígeno com o tampão de cobertura no fator de 1:2000. Dilua apenas a quantidade necessária que deve ser usada no mesmo dia do teste. A solução de reconstituição de antígeno deve ser guardada em temperatura de congelamento a -20 C e pode ser descongelada e congelada novamente até 20 vezes. Solução B: Solução diluída de antissoro padrão humana (é usada na 3ª etapa): Adicione 100 µl de água destilada estéril no frasquinho contendo o antissoro padrão humano (Human Standard Antiserum) para dissolvê-lo. Dilua o antissoro dissolvido com o tampão de diluição nas proporções de 1:2000, 1:4000, 1:8000 e 1: Dilua apenas a quantidade necessária que deve ser usada no mesmo dia do teste. Guarde a solução de antissoro humano padrão congelada, essa solução pode ser congelada e descongelada várias vezes sem alterar sua atividade. Solução C: Solução diluída do antissoro de paciente (usa-se na 3ª etapa) Dilua o antissoro de paciente com o tampão de diluição (Dilution buffer) no fator de 1:100 (por exemplo: adicione 10 µl de antissoro de paciente em 990 µl de tampão de diluição). A solução C deve ser usada no mesmo dia do teste. Solução D: Solução diluída de anticorpo coelho anti-humano conjugado HRP (usa-se na 4ª etapa): O anticorpo conjugado Coelho anti-igg humano a HRP (Rabbit-Anti-Human IgG HRP) deve ser diluído com o tampão de diluição (Dilution Buffer) no fator de 1:20000 (por exemplo: 1 ul de Rabbit-Ani-Human IgG HRP é adicionado a 20mL de Dilution Buffer e misturado bem). Dilua apenas a quantidade necessária que deve ser usada no mesmo dia do teste.

3 3- ETAPAS DO TESTE DE ELISA: 1ª ETAPA Adicione 100 µl da solução A em cada poço da durante 1 hora na temperatura ambiente. Aspire e lave 3 vezes os poços (período de lavagem de 3 min. para cada lavagem) com 150 µl de Washing Buffer. 2ª ETAPA Adicione 100 µl do tampão de diluição (Dilution Buffer) em cada poço da na temperatura ambiente durante 1 hora ou na temperatura de 2 C a 8 C durante a noite. Aspire e lave 2 vezes os poços (período de lavagem de 3 min. para cada lavagem) com 150 µl do Washing Buffer. 3ª ETAPA Adicione 100 µl da Solução B em cada um dos 4 poços exclusivos para amostra de antissoro humano padrão. Adicione 100 µl da Solução C em cada um dos poços exclusivo para amostra de paciente. durante 1 hora na temperatura ambiente. Aspire e lave 3 vezes os poços da placa (período de lavagem de 3 min. para cada lavagem) com 150 µl do Washing Buffer. 4ª ETAPA Adicione 100 µl da Solução D (HRP) em cada poço da durante 1 hora em temperatura ambiente. Aspire e Lave 5 vezes os poços (período de lavagem de 3 min. para cada lavagem) com 150 µl do Washing Buffer. 5ª ETAPA Adicione 100 µl datmb Plus Substrate em cada poço da no escuro durante precisamente 15 minutos na temperatura ambiente. 6ª ETAPA Adicione 100 µl de 2M Sulphuric Acid em cada poço da Coloque a microplaca num leitor de ELISA (DO450 nm) e leia o resultado de absorbência da reação dentro de 10 minutos.

4 Cálculos dos Resultados Os valores de absorbância encontrada nas diluições das amostras de antissoro humano padrão servem para construir uma curva padrão. Veja na tabela abaixo um exemplo ilustrado dos valores calculados. As amostras de antissoro humano padrão de fator 1:1000 equivale a 100 unidades de ELISA (unidades internacionais). Os valores calculados em unidades de ELISA correspondentes as diluições de 1:2000 a 1:16000, os quais são mostrados a seguir: Fator de diluição das amostras de antissoro humano padrão Unidades de ELISA Valor de DO 450 1: ,00 2,34 1: ,00 1,71 1: ,50 1,13 1: ,25 0,71 Faça uma curva padrão como esta mostrada abaixo com os valores de DO 450 como uma função de unidade de ELISA (o eixo X deve ser logarítmico). A linha de regressão dos pontos deve ser linear e a equação deve ser mostrada. Exemplo de Curva Padrão Valor de DO 450 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y=0,7892ln(x) - 0, Unidade de ELISA 100 Os valores de DO 450 das amostras de paciente devem ser convertidos para as unidades (unid.) de ELISA usando a equação da curva padrão. VALOR DE DO 450 = 0,7892 Ln (unidade de ELISA)- 0,7942 Unidade de ELISA = exp.[(valor de DO ,7942)/ 0,7892] Como as amostras de paciente foram diluídas 10 vezes menos que as amostras de antissoro humano padrão, os resultados da unidade de ELISA devem ser divididos consequentemente por 10. Paciente Valor de DO 450 das amostras de pacientes Unidades de ELISA Unidade de ELISA /10 1 2,60 73,96 7, ,53 5,35 0, ,96 32,78 3, ,89 8,45 0,845 Se as amostras de paciente foram diluídas mais que o fator de 1:100 para montar a curva padrão a unidade de ELISA tem que ser então dividida por 1000/o novo fator de diluição para que o resultado seja correto[ por exemplo: se a amostra é diluída na proporção de 1:300, então o resultado é encontrado dividindo a unidade de ELISA por 3,33 ( = 1000/300)]. O valor do resultado de ponte de corte (cut-off) para uma unidade positiva de ELISA/10 é de 2,96 (veja a explicação a seguir), isso significa que os pacientes de números 1 e 3 são positivos e os pacientes de número 2 e 4 sãos negativos. Interpretação dos resultados Os valores normais em unidade ELISA (unidade internacional) para pessoas não infectadas com o P. aeruginosa IgG são >0,66 e < 1,64 ( (significa desvio padrão de +/- 2 vezes). O limite normal máximo (de 95%) é consequentemente 2,30, o que é um aumento significante de título comparado ao controle normal que é > 2,30.

5 Os valores normais em unidade de ELISA de pacientes não infectados por P. aeruginosa CF são > 0,57 e <2,39 (significa desvio padrão de +/- 2 vezes). O limite máximo normal (de 95%) é consequentemente 2,96, o que é um aumento significante de título comparado com pacientes não infectados com P. aeruginosa CF onde o valor é = ou > 2, 96. A diferença entre pessoas não infectadas e pacientes não infectados por P. aeruginosa CF se deve por exemplo as reações cruzadas de anticorpos induzidos por infecções de H. influenzae. Cultura positiva para P. aeruginosa Cultura negativa para P. aeruginosa Unidade IgG de ELISA > 2,96 A B Unidade IgG de ELISA = ou < 2,96 C D Grupo A: Provavelmente infecção crônica por P. aeruginosa Uma cultura positiva a P. aeruginosa acompanhada pelo aumento de titulo de IgG acima do limite máximo normal de pacientes não infectados por P. aeruginosa CF ( >2,96) indica infecção crônica por P. aeuginosa especialmente se a cepa (estirpe) é mucoide. Grupo B: Provavelmente infecção não crônica por P. aeruginosa, mas requer culturas repetidas Culturas negativas a P. aeruginosa e crescentes títulos de IgG ( >2.96) requerem culturas repetidas para descartar a possibilidade de infecção crônica. Títulos de IgG decrescem lentamente apenas quando há erradicação da P. aeruginosa. Grupo C: Provavelmente colonização intermitente da P. aeruginosa Culturas positivas a P. aeruginosa acompanhadas de aumento de títulos de IgG, mesmo sendo abaixo do limite máximo normal para pacientes não infectados com P. aeruginosa CF (=/<2.96) é uma indicação de uma infecção crônica iniciada agora ou que se iniciará no próximo ano, onde a titulação baixa estável indica colonização intermitente. Grupo D: Provavelmente nenhuma colonização por P. aeruginosa ou infecção crônica Usando uma serie de medições de títulos IgG durante um período de tempo, os pacientes deve mostrar um aumento de títulos mesmo abaixo do limite máximo normal (= ou <2.96), o que requer julgamentos individuais de médicos clinicos levando em consideração os resultados repetidos de culturas para P. aeruginosa. Referencia bibliográfica: 1. Høiby, N., Collins, M.T., Espersen, F., Hertz, J.B., Hoff, G.E.,Schiøtz, P.O.: Taxonomic application of crossed immunoelectrophoresis.internat. J. Syst. Bacteriol. 37: ; Pedersen, S.S., Espersen, F., Høiby, N.: Diagnosis of chronic Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis by enzymelinked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 25: ; Pressler, T., Pedersen, S.S., Espersen, F., Høiby, N., Koch, C.: IgG subclass antibodies to Pseudomonas aeruginosa in sera from patients with chronic Ps. aeruginosa infection investigated by ELISA. Clin. exp. Immunol. 81: ; Valerius, N.H., Koch, C. & Høiby, N.: Prevention of chronic colonization with Pseudomonas aeruginosa in patients with Cystic Fibrosis by early treatment with Ciprofloxacin and inhalation with Colistin. Lancet 338: (1991):725-26; Frederiksen, B., Lanng, S., Koch, C., Høiby, N.: Improved survival in the Danish cystic fibrosis centre - results of aggressive treatment.pediatr. Pulmonol. 21: , Frederiksen, Koch, C. & Høiby, N.: Antibiotic treatment at time of initial colonization with Pseudomonas aeruginosa postpones chronic infection and prevents deterioration in pulmonary function in patients with cystic fibrosis. Pediatr. Pulmonol. 23: , Frederiksen, B., Koch, C., Høiby, N.: Changing epidemiology of Pseudomonas aeruginosa infection in Danish cystic fibrosis patients ( ). Pediatr. Pulmonol. 28:159-66; Döring, G., Høiby, N. for the consensus study group: Early intervention and prevention of lung disease in cystic fibrois: a European consensus. J. Cystic Fibrosis 3:67-91; Høiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T.: Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J. Cystic Fibrosis 4:49-54; ) Pressler, T., Karpati, F., Granström, M., Knudsen, P.K., Lindblad, A., Hjelte, L., Olesen, H.V., Meyer, P., Høiby, N. & The Scandinavian CF,Study Consortium: Diagnostic significance of measurements of specific IgG antibodies to Pseudomonas aeruginosa by three different serological methods. J. Cystic Fibrosis 8:37-42; 2009.

6 Serviço de Suporte Soros que apresentam resultados inexplicáveis nos testes devem ser enviados para análise no Laboratório de Referencia na Dinamarca juntamente com as informações sobre as condições (status) bacteriológica do paciente sobre absorção possível de reações cruzadas de anticorpos. O laboratório de Referencia pertence ao departamento de microbiologia clinica e o centro dinamarquês de CF no Rigshospitalet - Universidade de Copenhague. Para informações adicionais escreva para: hoiby@hoibyiniels.dk Armazenamento e Prazo de Validade O antissoro padrão humano (Human Standard Antiserum) do Pseudomonas-CF-IgG kit ELISA depois de aberto deve ser guardado na temperatura de -20 C. Os produtos: Rabbit-Anti-Human IgG HRP e o TMB Plus Standard devem ser guardados a 2 C a 8 C. Os outros produtos do kit (Pseudomonas-CF-IgG ELISA kit) exceto os mencionados anteriormente, podem ser conservados na temperatura ambiente. A data de validade dos produtos esta impressa na sua embalagem. A solução de antígeno (Antigen Stock Solution) do Pseudomonas-CF-IgG ELISA Kit deve ser descongelada na temperatura ambiente para uso e logo depois congelada novamente, essa processo de congelamento e descongelamento pode ser executado pelo menos 20 vezes sem que a solução se altere (ou seja haja mudança de atividade). O Human Standard Antiserum do Pseudomonas-CF-IgG ELISA kit pode ser congelado e descongelado para o uso repetitivamente sem alterar mudanças de atividades. Certificado de Qualidade Os nossos produtos têm alta qualidade, eles são certificados de acordo com DS/EN ISO e DS/EN 9001, têm o certificado dinamarquês de qualidade para dispositivos médicos (DGM) e o rótulo de qualidade da União Europeia (CE). Informação e Solicitação dos Produtos Para solicitar os nossos produtos contate por gentileza um dos nossos distribuidores no seu país ou visite o nosso web site: shop.ssi.dk. Para informações adicionais, por favor, nos contate: Statens Serum Institut SSI Diagnostica Herredsvejen Hillerød Dinamarca T F ssidiagnostica@ssi.dk shop.ssi.dk w 1 a Edicão Agosto Based on April