O MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA COMO AUXILIAR NA IDENTIFICAÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS

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1 O MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA COMO AUXILIAR NA IDENTIFICAÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS Adilson Macedo (1) Graduado em Biologia pela Universidade de Mogi das Cruzes UMC, Especialista em Tecnologias Ambientais pela Faculdade de Tecnologia São Paulo FATEC-SP. Biólogo da Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo SABESP. Ligia Marino Especialista em Gestão Ambiental pela Faculdade de Saúde Pública da USP. Bióloga do Departamento de Controle da Qualidade, Encarregada do Laboratório de Microbiologia da Divisão de Laboratório Central de Controle da SABESP. Endereço (1) : Rua Waldemar Cusma, 701 Jardim Aeródromo Internacional Suzano - SP - CEP: Brasil - Tel: +55 (11) / admacedo@sabesp.com.br RESUMO Em virtude das características da água bruta, pode-se ter maior ou menor presença de indivíduos que podem ser identificados num primeiro momento como cianobactérias. Para que não ocorram falsos resultados superestimados em quantidade de células de cianobactérias, além do estudo das características morfológicas, podemos utilizar a epifluorescência para complementar o monitoramento. O presente trabalho tem por objetivo apresentar o microscópio de epifluorescência como auxiliar na identificação de cianobactérias e a possibilidade de comparar com os demais grupos de bactérias, principalmente nos trabalhos de rotina e de grande demanda de análises. Para tanto, foram utilizadas várias fotomicrografias de comparação entre bactérias e cianobactérias, devido a ausência ou presença da clorofila as cianobactérias e outras algas são visualizadas na cor vermelha e os demais indivíduos ficam ausentes nestas imagens. PALAVRAS-CHAVE: Microscópio, epifluorescência, Identificação, Cianobactérias, Monitoramento ambiental. INTRODUÇÃO As florações de cianobactérias alteram o equilíbrio ecológico do ambiente aquático, podem produzir toxinas, prejudicar as estações de tratamento de água e causar gosto e odor desagradáveis. O monitoramento destes microrganismos é essencial para detectar esse crescimento e avaliar a evolução dos indivíduos. Nos programas de monitoramento das cianobactérias para águas de abastecimento, normalmente é exigida apenas a contagem do número de células que são as unidades produtoras de toxina. Porém é importante a identificação dos organismos dominantes, pelo menos até nível genérico, para saber se já são conhecidos seus efeitos tóxicos, já que diferentes gêneros e espécies produzem diferentes toxinas (SANT ANNA, et al., 2006). Em função da exigência da legislação no monitoramento e quantificação de cianobactérias, faz-se necessário a capacitação técnica dos profissionais e também a utilização de técnicas que auxiliem no controle e na identificação destes microrganismos. A utilização do microscópio é amplamente disseminada no ensino e pesquisa, possibilita uma variedade de técnicas de observação. 1

2 O dispositivo de epifluorescência é um recurso importante para diferenciar as cianobactérias dos demais grupos de bactérias morfologicamente semelhantes (SANT ANNA, et al., 2006). Quando a autofluorescência da clorofila não pode ser observada, este organismo é identificado como um indivíduo heterotrófico (CARON, 1983). MATERIAL E MÉTODOS As amostras foram analisadas in vivo, sem a adição de fixador, já que esta prática poderia promover alterações morfológicas e estruturais nos indivíduos, prejudicando desta maneira a incidência da fluorescência. Foram visualizadas em microscópio invertido de epifluorescência com lâmpada de mercúrio de alta pressão (HBO-50), equipado com conjunto de filtros ópticos específicos para a autofluorescência da clorofila, em aumentos variados (400x ou 1000x), este último com óleo de imersão. Não foi utilizado nenhum tipo de reagente para promover a excitação do pigmento. Para a captura das imagens foi utilizada uma câmera digital, acoplada ao microscópio e analisada através de um software específico que possibilita entre outros recursos, incluir a escala micrométrica. RESULTADOS OBTIDOS A técnica de diferenciação através da microscopia de epifluorescência possibilita evidenciar a presença e ausência do pigmento nos microrganismos analisados. Desta forma, em trabalhos de rotina de identificação e quantificação de cianobactérias torna-se útil esta técnica. As figuras de 1 a 4 demonstram cianobactérias filamentosas e cocóides que apresentam incidência da fluorescência e coloração avermelhada, caracterizando desta maneira, a presença de clorofila. Contudo, as figuras de 5 a 8 demonstram indivíduos que não apresentaram a incidência da fluorescência, caracterizando desta maneira a ausência da clorofila. Verifica-se também nestas figuras a coloração de outras algas. Figura 1: Tricomas de cianobactérias da Ordem Oscillatoriales, à esquerda indica indivíduo normal e à direita apresenta coloração devido à presença de clorofila. 2

3 Figura 2: Tricomas de cianobactérias do gênero Anabaena, à esquerda indica indivíduo normal e à direita apresenta coloração devido à presença de clorofila. Figura 3: Cianobactérias cocóides da Ordem Chroococcales, à esquerda indica indivíduo normal e à direita apresenta coloração devido à presença de clorofila. Figura 4: Cianobactérias cocóides da Ordem Chroococcales, à esquerda indica indivíduo normal e à direita apresenta coloração devido à presença de clorofila. 3

4 Figura 5: Indivíduo filamentoso, à esquerda indica indivíduo normal e à direita não apresenta Figura 6: Indivíduo filamentoso, à esquerda indica indivíduo normal e à direita não apresenta Figura 7: Indivíduo cocóide, à esquerda indica indivíduo normal e à direita não apresenta 4

5 Figura 8: Indivíduo cocóide, à esquerda indica indivíduo normal e à direita não apresenta CONCLUSÕES O microscópio de epifluorescência pode ser usado como auxiliar nos procedimentos que envolvem a mensuração e identificação de cianobactérias, principalmente na comparação entre os demais grupos de bactérias com a mesma morfologia. Nas fotomicrografias são apresentadas bactérias filamentosas que poderiam ser identificadas erroneamente como cianobactérias da Ordem Oscillatoriales e bactérias cocóides que poderiam ser identificadas como pertencentes da Ordem Chroococcales, provocando desta maneira uma superestimação da quantidade de células. Em programas de monitoramento que demonstrem a presença destes microrganismos e que exista a dúvida quanto a correta identificação, o microscópio de epifluorescência pode ser uma ferramenta útil neste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. A.P.H.A., American Public Health Association. Standard methods for the examination of water and wastewater, 20 ed., Washington-EUA, APHA/WEF/AWWA, CARON, D.A. Tecnhique for enumeration of heterotrophic and phototrophic nanoplankton, usin epifluorescence microscopy, and comparasion with other procedures. American Society for Microbiology, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 46, n.2, p , Aug SANT`ANNA, C. L.; AZEVEDO, M.T. de P.; AGUJARO, L.F.; CARVALHO, M. do C.; CARVALHO, L.R. de; SOUZA, R.C.R. de. Manual ilustrado para identificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentais brasileiras, Interciência, Rio de Janeiro; Sociedade Brasileira de Ficologia SBFic, Universitat de Barcelona. Métodos en Biología Celular - Colección de imágenes obtenidas mediante microscopia de fluorescencia. Disponível em: recursos/ coleccion_imagenes_fluorescencia.htm. Acesso em Out