Lílian Figueiredo Moreira

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1 Lílian Figueiredo Moreira Tropismo tecidual dos genótipos principais de Trypanosoma cruzi em camundongos BALB/c com infecções mistas, não tratados e tratados na fase aguda da infecção, avaliados pela técnica de LSSP-PCR. OURO PRETO, MG 2009

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Tropismo tecidual dos genótipos principais de Trypanosoma cruzi em camundongos BALB/c com infecções mistas, não tratados e tratados na fase aguda da infecção, avaliados pela técnica de LSSP-PCR. Autora: Lílian Figueiredo Moreira Orientadora: Prof a. Dr a. Marta de Lana Co-Orientadora: Prof a Dr a. Helen Rodrigues Martins Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre; área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. OURO PRETO, MG 2009

3 M838t Moreira, Lilian Figueiredo Tropismo tecidual dos genótipos principais de Trypanosoma cruzi em camundongos BALB/c com infecções mistas, não tratados e tratados na fase aguda da infecção, avaliados pela técnica de LSSP-PCR [manuscrito] / Lilian Figueiredo Moreira f.: grafs.; tabs. Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana. Co-orientadora: Profª. Drª. Helen Rodrigues Martins Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. 1. Trypanosoma cruzi - Teses. 2. Genótipos - Teses. 3. Infecção - Teses. 4. Benzonidazol - Teses. 5. Tecidos (Anatomia e fisiologia) - Cultura e meios de cultura - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. CDU: :663.1 Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

4 "Aquele que não tem um objetivo, raramente sente prazer em qualquer empreendimento." Giacomo Leopardi iii

5 Dedicatória Dedicatória Aos meus pais Célia e Antônio, à minha irmã Sônia, à minha avó Nhanhá e tias Verinha, Ritinha e Nenem por toda dedicação, amor, confiança e por sempre apoiarem as minhas decisões... Ao Djalma, pelo amor, companheirismo, estímulo e por nunca ter faltado nos momentos em que eu mais precisei... iv

6 Agradecimentos Agradecimentos Àqueles que diretamente contribuíram para a realização desse trabalho... A Deus, por sempre fazer o melhor em minha vida...por todas as minhas conquistas e por colocar no meu caminho pessoas tão especiais... À professora Marta de Lana, por me acolher tão bem no laboratório de doença de Chagas e por ter acreditado em mim para a realização desse trabalho. Agradeço pelo seu otimismo em sua orientação e pelos ensinamentos transmitidos. Só tenho a agradecer as verdadeiras demonstrações de carinho... À Helen Rodrigues Martins, agradeço pela grande co-orientação desse trabalho. Devo a você grande parte do meu aprendizado sobre a doença de Chagas. Você me ensinou a dar os primeiros passos e hoje posso compartilhar aqui muito daquilo que aprendi a seu lado...muito obrigada! Aos professores do Laboratório de doença de Chagas Maria Terezinha Bahia, André Talvani e Evandro Marques de Menezes Machado pela amizade e por ter esclarecido tantas dúvidas... À Cláudia Martins Carneiro, pelo auxílio na realização das necropsias, por toda atenção dada sempre que precisei e por ver as coisas sempre de uma maneira tão simples... À Andréa Mara Macedo, por ter aberto as portas do seu laboratório para que eu pudesse aprender as metodologias necessárias na execução desse trabalho. Ao Claudiney, por ter me ensinado, com toda a paciência, a técnica de LSSP-PCR utilizada nesse estudo. Obrigada pela atenção! Aos professores Luís Carlos Crocco Afonso, Renata Guerra de Sá, Ieso de Miranda Castro, Alexandre Reis e Simone Rezende, por sempre disponibilizarem seus v

7 Agradecimentos equipamentos e reagentes tão necessários na execução desse projeto e pela disponibilidade em me atender. À professora Simone Resende por sua gentileza em fornecer alguns animais utilizados nesse projeto. À Vanja, pela amizade e presteza durante todos esses anos. Os conhecimentos adquiridos com você foram primordiais no meu crescimento e execução desse trabalho. Você é uma pessoa maravilhosa! À Jack, uma irmã que Deus me deu para caminhar junto a mim nessa etapa tão importante de nossas vidas...te agradeço por toda ajuda cedida todas as vezes que eu precisei... com você aprendi e dividi tantos momentos... foram tantas risadas, choros, apertos e cansaço...agradeço pela sincera amizade compartilhada durante todos esses anos de convivência...você é uma pessoa maravilhosa e fez toda a diferença...obrigada por tudo! Ao Maykon, pela grande amizade e por toda ajuda cedida na realização desse trabalho. Sem você a concretização desse sonho seria bem mais difícil...obrigada por tornar o ambiente de trabalho mais agradável...meus sinceros agradecimentos... À Míriam, pessoa maravilhosa e sempre prestativa. Obrigada por ter me esclarecido tantas dúvidas durante o mestrado. Agradeço também pela verdadeira amizade oferecida e por todos os conselhos dados quando eu mais precisei... Aos amigos do Laboratório de doença de Chagas Maykon, Lívia, Auffy, Dani, Vitor, Lucas, Renata Branquinho, Gláucia, Alexandre Rotondo, Lílian Melo, Guilherme, André Gravel, Régia, Rafael, Tassiane, Ivo, Vivian, Fabiane, Maíra, Magna e Isabel pela maravilhosa convivência, amizade e ajuda durante todos esses anos... Agradeço também àqueles que não estão mais no Laboratório, pelos ensinamentos transmitidos e momentos maravilhosos vividos juntos: Geo, Arnaldo, Claudinha, Rodrigão, Jaila, Marcela, Lílian Santos, Daniela Santos, Rafaela, Jamile, Dani Sorriso, vi

8 Agradecimentos Stêfany e em especial ao Ricardo, Lorena e Fábio que me ensinaram muito durante a minha iniciação científica. Aos amigos do LIP, Míriam, Rodrigo, Eduardo, Tiago, Roberta, Pedro, Amanda, Pauline, Leandro e Marco pelos momentos de descontração e disponibilidade em ajudar...muito obrigada! Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Patologia pelo material cedido e ajuda sempre que precisei. Aos meus amigos da turma de mestrado: Jack, Lílian, Larissa, Melina, Lorena, Tiago, João, Emanuel e Míriam pela agradável convivência durante as disciplinas... À Ana Salomé, pessoa maravilhosa e sempre de bom humor, agradeço pelo cuidado com o material utilizado na realização desse trabalho. Aos bioteristas, em especial à Cristina pelo cuidado com os animais. À Érika pela agradável convivência e pela atenção dada em todos os momentos. À Cida pela disponibilidade em resolver todos os problemas... Ao biotério da UFMG por ter cedido os animais utilizados nesse trabalho. À UFOP, pelo ensino de qualidade e possibilidade em realizar esse trabalho. À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado. Às agências financiadoras: FAPEMIG e CNPQ. vii

9 Agradecimentos Agradeço também à algumas pessoas que indiretamente contribuíram para a realização desse sonho... Às minhas companheiras de república: Jack, Marisa, Mari, Débis e Taís por todos esses anos de convivência, companheirismo, cumplicidade e amizade sincera... vocês foram pessoas fundamentais durante todos esses anos, tornando os meus dias sempre mais agradáveis e me fazendo muito mais feliz! Meus sinceros e eternos agradecimentos... Ao Sr. Deusdedit e família e à Lúcia por todo carinho, atenção e ajuda prestada durante todos esses anos de moradia em Ouro Preto. Muito obrigada! Aos meus adoráveis e eternos amigos Geo, Arnaldo, Maykon, Marcela, Claudinha, Lívia, Rúbia, Carol e Douglas. A amizade de vocês foi fundamental para vencer mais essa etapa...foram tantos os momentos vividos juntos...quantas risadas e choros compartilhados... À minha querida família, em especial aos meus pais, avó, irmã e às minhas tias Verinha, Ritinha e Nenem por todo carinho e amor e por acreditarem em mim e nunca pouparem esforços em tornar mais esse sonho realidade... amo vocês! Ao Djalma, meu amor, por sempre apoiar as minhas decisões e por me estimular a fazer sempre o melhor... você mais do que ninguém sabe o significado desta conquista, pois esteve ao meu lado de forma incondicional. Só tenho a agradecer tanto amor e carinho... A todos vocês, meus sinceros agradecimentos... Lili viii

10 Resumo A correlação entre a genética do T. cruzi e as formas clínicas da doença de Chagas não está bem estabelecida. Apesar da relação parasito x hospedeiro ser complexa e multifatorial, uma das razões para essa falta de correlação pode ser a freqüente ocorrência de infecções mistas na natureza. Nesse sentido, o principal objetivo desse estudo foi avaliar, por meio da técnica de LSSP-PCR, o impacto de infecções mistas no tropismo tecidual de clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais 19, 20, 39 e 32 na fase crônica da infecção. Para tal, foram avaliados seis tecidos (coração, músculo esquelético, cólon, baço, bexiga e cérebro) de quatro camundongos BALB/c fêmeas com infecção mista por clones de T. cruzi de cada genótipo principal. Os animais foram inoculados, via IP, com tripomastigotas sanguíneos de cada clone, combinados aos pares, totalizando 24 misturas distintas. Esses camundongos foram divididos em dois grupos: não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol (BZ) e avaliados comparativamente às respectivas infecções monoclonais ( tripomastigotas sanguíneos). A técnica de PCR detectou o kdna dos oito clones de T. cruzi em todos os seis tecidos avaliados de animais INT. Após o tratamento houve redução na positividade da PCR especialmente nos animais infectados com clones dos genótipos 32 e 39 em comparação com aqueles infectados com os genótipos 19 e 20. Não foi observada uma associação entre a distância filogenética dos clones e o tropismo tecidual do kdna do T. cruzi. Entretanto, clones dos genótipos 19 e 20 foram os únicos que apresentaram, durante a fase crônica, positividade na PCR no cérebro e maior positividade na bexiga. A comparação entre a distribuição tecidual do kdna de clones do T. cruzi em camundongos com infecção mista e monoclonal revelou que na maioria das misturas estudadas, exceto Cuica cl1 + SO3 cl5 (20+39) houve alteração do tropismo tecidual do kdna nos animais INT e IT. A maioria dos tecidos de animais com infecção mista (INT e IT) apresentou PCR negativa, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal. Entretanto, a PCR foi positiva em animais infectados com 18/24 misturas. A identificação dos clones presentes nesses tecidos por LSSP-PCR revelou resultados esperados, considerando as infecções monoclonais, na maioria das misturas. Curiosamente, o perfil genético dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com as misturas OPS21 cl11 + P209 cl1 e OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 e tratados demonstrou a presença do clone OPS21 cl1, 100% susceptível ao BZ. Outro resultado interessante foi obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 (39+32) tratados com BZ, que revelou um perfil indeterminado não compatível com o esperado para os clones originais utilizados na inoculação. A caracterização por LSSP-PCR e microssatélites dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com as misturas que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao BZ revelou resultados semelhantes e esperados, considerando as infecções monoclonais, na maioria das misturas. Além disso, a técnica de LSSP-PCR revelou alteração no tropismo tecidual do kdna dos clones nesses mesmos animais, sugestiva de interação entre os parasitos componentes da mistura. A técnica de LSSP-PCR apresentou maior sensibilidade quando comparada à de microssatélites, sendo capaz de detectar uma maior porcentagem de ambos os clones nos tecidos de animais INT. A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de animais considerados curados (TC) e que apresentaram PCR em tecido positiva demonstrou apenas a presença de um clone e os resultados foram semelhantes àqueles encontrados nos animais tratados não curados (TNC), levantando um importante questionamento a respeito do critério de cura na doença de Chagas. Somente clones dos genótipos 19 ou 20 estavam presentes nos tecidos de animais TC e infectados com as combinações genotípicas 19+32, e 20+39, exceto na mistura Cuica cl1 + Bug2148 cl1 (20+39), que demonstrou a presença do clone pertencente ao genótipo 39. Os resultados obtidos nesse trabalho revelaram alteração no tropismo tecidual do kdna do T. cruzi em infecções mistas sugestiva de interações entre os clones da mistura. Os dados em conjunto sugerem que a correlação entre a genética do parasito e as diferentes formas clínicas da doença é ainda mais difícil de ser estabelecida em infecções mistas em relação às infecções monoclonais. Resumo ix

11 Abstract The correlation between the T. cruzi genetics and the clinical forms of Chagas disease is not well established. Despite the host x parasite relationship be complex and multifactorial one reason for this may be the frequent occurrence in nature of mixed infections. The aim of this study was to evaluate by LSSP-PCR technique, the impact of mixed infections in tissue tropism of T. cruzi clonal stocks from major genotypes 19, 20, 39 and 32 in the chronic phase of infection. For this, were evaluated six tissues (heart, skeletal muscle, colon, spleen, bladder and brain) of four female BALB/c mice with mixed infection by IP route, with T. cruzi clonal stocks from each genotype (5.000 blood trypomastigotes of each) combined in pairs, in a total of 24 different mixtures. Mice were divided in two groups: not treated (INT) and treated (IT) with benznidazole (BZ) and compared to the respective monoclonal infection ( blood trypomastigotes of each clone). The PCR technique detected kdna of eight clones of T. cruzi in all six tissues of INT animals. After treatment it was observed reduction of the PCR positivity, particularly in animals infected with clones of genotypes 32 and 39 when compared with those infected with genotypes 19 and 20. No association was observed between the parasites phylogenetic distance and the tissue tropism of T. cruzi kdna. However, clones of genotypes 19 and 20 were the only who showed during the chronic phase, PCR positivity in the brain and higher positivity in bladder. The comparison between the tissue distribution of T. cruzi kdna of each clone in mice with monoclonal and mixed infection revealed that most of the mixtures studied, except Cuica cl1 + SO3 cl5 (20 +39) changed the kdna tissue tropism, both in IT and INT animals. Most tissues of animals with mixed infection (INT and IT) presented negative PCR, in contrast to that verified in animals with monoclonal infection. However, the PCR was positive in animals infected with 18/24 mixtures. The identification of each clone present in these tissues by LSSP-PCR revealed the expected results considering the monoclonal infections in the majority of the mixtures. Interestingly, the genetic profile of the remaining clonal stock in tissues of animals infected with treated mixtures OPS21 cl11 + P209 cl1 and OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 demonstrated the presence of the clone OPS21 cl1, 100% susceptible to BZ. Another interesting result was obtained in the characterization of the remaining clones in tissues of animals infected with the mixture SO3cl5 + IVV cl4 (39 +32) treated with BZ, which showed an indeterminate profile not compatible with the expected for the original clones used for inoculation. The characterization by LSSP-PCR and microsatellite of the clones present in tissues of animals infected with mixtures that showed change in the BZ susceptibility profile showed expected and similar results considering the monoclonal infections, in most of the mixtures. Moreover, the technique of LSSP-PCR revealed changes in tissue tropism of kdna of each clone in these animals, suggestive of interaction phenomena between the parasites present in the mixture. The technique of LSSP-PCR showed higher sensitivity when compared to microsatellites being able to detect a higher percentage of both clones in tissues of INT animals. The LSSP-PCR for identification of clones remaining in tissues from animals considered cured (TC), which showed positive tissue-pcr revealed only the presence of one clone and the results were similar to those obtained in treated not cured (TNC) animals, raising an important question regarding the cure criteria in Chagas disease. Only clones of genotypes 19 and 20 were present in tissues of TC animals infected with and the genotype combinations 19+32, and 20+39, except the mixture Cuica cl1 + Bug2148 cl1 (20 +39), which presented the presence of the clone belonging to genotype 39. The results obtained in this study showed changes in tissue tropism of T. cruzi kdna in mixed infections, suggestive of interactions between the clones of the mixture. Data together suggest that the genetic correlation between the parasite genetic and the different clinical forms of the disease is much more difficult to be established in mixed infections compared to monoclonal infections. Abstract x

12 Lista de Tabelas Lista de tabelas Tabela I: Hospedeiros, origem geográfica, virulência e susceptibilidade ao benzonidazol dos oito clones de Trypanosoma cruzi utilizados nesse estudo Tabela II: Misturas de clones do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais utilizados na infecção de camundongos BALB/c combinados segundo o padrão de virulência e susceptibilidade ao benzonidazol Tabela III: Misturas teóricas de clones de Trypanosoma cruzi pertencentes às diferentes misturas utilizadas na avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP- PCR Tabela IV: Misturas de clones do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais utilizados na infecção de camundongos BALB/c combinados segundo o padrão de virulência e susceptibilidade ao benzonidazol não tratados e tratados com este fármaco Tabela V: Alteração na distribuição tecidual de clones do Trypanosoma cruzi em camundongos BALB/c com infecções mistas pertencentes aos genótipos principais avaliados pela técnica de PCR Tabela VI: Identificação de clones de Trypanosoma cruzi por LSSP-PCR provenientes de tecidos de camundongos BALB/c infectados com misturas de clones e que apresentaram positividade na PCR quando comparado com as suas respectivas infecções monoclonais Tabela VII: Identificação de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c infectados com as nove misturas que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol e nas três misturas caracterizadas pela técnica de microssatélites em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol* Tabela VIII: Distribuição tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais em camundongos BALB/c com infecção monoclonal pela técnica de PCR xi

13 Lista de Tabelas Tabela IX: Identificação de clones do Trypanosoma cruzi em tecidos por LSSP-PCR e no sangue e tecidos por isoenzimas* e microssatélites* de camundongos BALB/c infectados com diferentes misturas pertencentes aos genótipos principais que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol e nas três misturas em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol** Tabela X: Identificação de clones de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c com infecções mistas tratados com benzonidazol e considerados curados (TC) pelo critério de cura e que apresentaram PCR em tecido positiva Tabela X (continuação): Identificação de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c com infecções mistas tratados com benzonidazol e não curados (TNC) e não tratados (INT) pela técnica de LSSP-PCR xii

14 Lista de Figuras Lista de figuras Figura 1: Positividade global da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos de animais na fase crônica da infecção não tratados (IT, n= 16) e tratados com benzonidazol (INT, n= 16) Figura 2: Positividade global da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos de animais com infecções monoclonais pelos genótipos principais desse parasito não tratados (INT, n= 16) e tratados com benzonidazol (IT, n=16) na fase crônica da infecção Figura 3: Positividade da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos na fase crônica da infecção de animais com infecção monoclonal por clones pertencentes aos genótipos principais, não tratados (INT, n=16) e tratados (IT, n=16) com benzonidazol Figura 4: Perfis de LSSP-PCR representativos dos oito clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais (19, 20, 39 e 32) revelados em gel de poliacrilamida 6% e corados pela prata. PM: Padrão de peso molecular 100pb; clones P209 cl1 e Cuica cl1 (genótipo 20, T. cruzi I), clones Gamba cl1 e OPS21 cl11 (genótipo 19, T. cruzi I), clones Bug2148 cl1 e SO3 cl5 (genótipo 39, T. cruzi) e clones IVV cl4 e MAS cl1 (genótipo 32, T. cruzi II) Figura 5: Perfis de LSSP-PCR obtidos a partir de misturas teóricas de DNA do Trypanosoma cruzi (A+B), revelados em gel de poliacrilamida 6% e corados pela prata. Canaleta 1: PM: padrão de peso molecular 100pb; 2: DNA de referência do clone Gamba cl1 (100%); 3: mistura dos clones Gamba cl1 + IVV cl4 (75% + 25%); 4: mistura dos clones Gamba cl1 + IVV cl4 (50% + 50%); 5: mistura dos clones IVV cl4 + Gamba cl1 (75% + 25%); 6: DNA de referência do clone IVV cl4 (100%) Figura 6: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção xiii

15 Lista de Figuras Figura 7: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos na identificação de clones remanescentes nos tecidos de animais tratados e infectados com as misturas Gamba cl1 + P209 cl1: IT1 e IT2 e OPS21 cl11 + P209 cl1: IT3-IT5. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol Figura 8: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção Figura 9: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 não tratados com benzonidazol. INT: clones presentes em tecidos de animais não tratados com benzonidazol Figura 10: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 não tratados e tratados com benzonidazol. INT: clones presentes em tecidos de animais não tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol Figura 11: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção Figura 12: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção Figura 13: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol xiv

16 Lista de Figuras Figura 14: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção Figura 15: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol Figura 16: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção Figura 17: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones remanesentes nos tecidos de animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol Figura 18: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos de isolados de animais infectados com diferentes combinações genotípicas do Trypanosoma cruzi e que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol. INT: isolados de animais não tratados com benzonidazol. TNC: isolados de animais tratados com benzonidazol e não curados Figura 19: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos de isolados de animais infectados com diferentes combinações genotípicas do Trypanosoma cruzi e que foram considerados curados pelo critério de cura clássico (ESF, hemocultura, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) e apresentaram PCR em tecido positiva. TC: isolados de animais tratados com benzonidazol e considerados curados xv

17 Lista de Abreviaturas AATV BZ CEBIO d.a.i. datp dctp dgtp dttp dntp s DTU ELISA ESF FA FC Hc INT IP IT kdna LSSP-PCR TC TNC Pesquisa de anticorpos antitripomastigotas vivos pela citometria de fluxo Benzonidazol Biotério do Instituto de Ciências Biológicas Dias após a infecção 2 -desoxinucleotídeo de Adenosina-5 -trifosfato 2 -desoxinucleotídeo de Citocina-5 -trifosfato 2 -desoxinucleotídeo de Guanina-5 -trifosfato 2 -desoxinucleotídeo de Timina-5 -trifosfato 2 -desoxinucleotídeos-5 -trifosfato Discrete typing unity Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay Exame de sangue a fresco Fase aguda Fase crônica Hemocultura Infectado não tratado Intraperitoneal Infectado tratado DNA do cinetoplasto Low-stringency Single Primer PCR Tratado curado Tratado não curado Lista de abreviaturas xvi

18 Sumário Sumário 1.0) Introdução ) A doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi ) Variabilidade genética do T. cruzi ) Correlação entre a diversidade genética do T. cruzi e suas propriedades biológicas ) Genética do parasito e distribuição tecidual do T. cruzi ) Genética do hospedeiro e distribuição tecidual do T. cruzi ) Infecções mistas ou policlonais e suas conseqüências para o hospedeiro ) Justificativa ) Objetivos ) Objetivo Geral ) Objetivos específicos ) Delineamento experimental ) Animais, material e métodos ) Clones do Trypanosoma cruzi ) Obtenção dos inóculos ) Infecções experimentais avaliadas ) Confirmação da infecção ) Tratamento dos animais ) Fármaco ) Esquema de tratamento ) Necrópsia dos animais xvii

19 Sumário 5.6) Comparação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi nas infecções monoclonais e mistas tratadas e não tratadas pela técnica de PCR ) PCR em tecido ) Determinação do perfil de LSSP-PCR dos oito clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais ) Caracterização genética por LSSP-PCR ) Avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR para detecção dos clones de T. cruzi nos tecidos de animais com infecções mistas ) Identificação das populações do T. cruzi presentes nos tecidos de camundongos com infecções mistas não tratados e tratados com benzonidazol pela técnica de LSSP-PCR ) Resultados ) Positividade da PCR em tecidos de animais com infecção monoclonal por clones de T. cruzi não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol (BZ) agrupados de acordo com os genótipos principais ) Determinação do perfil de LSSP-PCR dos oito clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais ) Avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR para detecção dos clones de T. cruzi em infecções mistas ) Comparação pela técnica de PCR do tropismo tecidual de clones de T. cruzi em camundongos com infecções monoclonais e mistas submetidos ou não ao tratamento com BZ e identificação dos clones presentes nos tecidos por LSSP-PCR ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica xviii

20 Sumário 6.3.4) Avaliação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica ) Identificação de clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas pertencentes aos genótipos principais que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol ) Identificação de clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas dos genótipos principais e tratados com BZ considerados curados (TC) pelo critério de cura utilizado e que apresentaram PCR em tecido positiva ) Discussão ) Avaliação da positividade da PCR em camundongos com infecção monoclonal pelos genótipos principais de T. cruzi não tratados e tratados com o benzonidazol ) Tropismo tecidual de clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais em camundongos com infecção mista e monoclonal não tratados e tratados com benzonidazol e identificação nos tecidos que apresentaram alteração na positividade da PCR ) Identificação de clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol ) Identificação de clones remanescentes nos tecidos de animais tratados curados (TC) que apresentaram positividade na PCR em tecido ) Conclusões ) Referências bibliográficas xix

21 1.0) Introdução

22 Introdução 1.1) A doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi O Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi (Chagas, 1909), protozoário pertencente à ordem kinetoplastida, é o agente etiológico da doença de Chagas (Tripanossomíase Americana), uma das mais importantes doenças parasitárias da América Latina (Schmuñis, 2000). Nas últimas décadas, grandes avanços têm sido obtidos no controle das transmissões vetorial e transfusional da doença, principalmente através da Iniciativa do Cone Sul, o qual reduziu em aproximadamente 60% o índice da infecção humana (Dias et al, 2002b; Schofield et al., 2006; Dias 2007). Embora esses programas de controle tenham alcançado resultados satisfatórios, a transmissão ainda é ativa em outras partes do continente. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, aproximadamente 15 milhões de indivíduos estão infectados pelo T. cruzi na América Latina. A incidência anual é de novos casos e mortes anuais ocorrem como conseqüência dos danos irreversíveis ao coração e ao trato digestivo (WHO, 2007). Dessa forma, a doença de Chagas é a maior causa de morbidade e mortalidade nos países onde é endêmica. A infecção pelo T. cruzi determina no homem quadros clínicos com características muito variadas (Dias 1992; Prata 1999; Macedo et al., 2004; Coura 2007; WHO 2007). Após a infecção e um subseqüente período de incubação, tem-se início a fase aguda da doença de Chagas. Na ausência de tratamento específico, os sintomas podem persistir por até dois meses, com taxa de mortalidade variando de 2-8%, principalmente em crianças. Com a instalação da resposta imune do hospedeiro, as manifestações da fase aguda regridem e instala-se gradativamente a fase crônica, na qual a parasitemia e o parasitismo podem permanecer escassos por toda a vida do indivíduo (Dias, 1992). A forma crônica indeterminada é a mais freqüente, entretanto 30 a 40% dos pacientes chagásicos crônicos apresentam graus variáveis de miocardiopatia e 8 a 10% apresentam a forma digestiva, variando as formas clínicas e seu percentual entre países e, no interior de cada país, entre distintas áreas endêmicas (Dias, 1992). Ainda permanecem inexplicáveis as diferenças regionais nos aspectos clínicos da doença de Chagas. Atualmente, acredita-se que uma das principais causas dessas diferentes manifestações clínicas esteja diretamente relacionada com a variação genética 2

23 Introdução de T. cruzi, não podendo descartar, contudo, um possível papel dos aspectos ambientais, nutricionais genéticos e imunológicos do hospedeiro (Macedo & Pena, 1998; Devera et al., 2003; Macedo et al., 2004; Tibayrenc, 2007). 1.2) Variabilidade genética do T. cruzi O T. cruzi é uma espécie heterogênea constituída por várias sub-populações do parasito que circulam nos ambientes domésticos e silvestres, entre os seres humanos, animais reservatórios e vetores (Morel et al., 1986, Zingales et al., 1998). Variações intra-específicas nesse parasito têm sido observadas com base no comportamento biológico das cepas em animais de laboratório (Silva & Nussenzweig, 1953; Andrade & Andrade, 1966; Andrade, 1985), vetores (Garcia & Dvorak, 1982; Lana et al., 1998) e meios de cultivo celular e acelular (Dvorak et al., 1980; Sanchez et al., 1990; Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998) e essas diferenças estão associadas às características bioquímicas e moleculares dos isolados (Bice & Zeledón 1970, Petana & Coura 1974, Miles et al., 1977, Melo & Brener 1978, Morel et al., 1980, Andrade 1985, Araújo & Chiari 1988, Carneiro et al., 1991, Macedo & Pena 1998). A variabilidade genética entre as populações de T. cruzi tem sido demonstrada tanto em nível de proteína quanto de DNA. Em nível protéico, o primeiro estudo que demonstrou essa ampla diversidade genética foram os estudos iniciais de isoenzimas citoplasmáticas. Diferenças isoenzimáticas entre amostras do T. cruzi foram observadas pela primeira vez por Toyé, (1974) utilizando as enzimas ASAT (aspartato aminotransferase) e ALAT (alanina aminotransferase). Miles et al., (1977, 1978, 1981) estudando o perfil de isoenzimas em amostras de T. cruzi coletadas na Bahia e na região Amazônica, encontraram três grupos isoenzimáticos distintos que foram denominados zimodemas Z1, Z2 e Z3. Estudos epidemiológicos demonstraram que Z1 e Z3 estavam associados ao ciclo silvestre e Z2 ao ciclo doméstico de transmissão da doença. Em seu trabalho posterior, Miles et al., (1981) demonstraram uma predominância do Z1 na Venezuela e do Z2 no Brasil. Os autores consideraram estas variações como possivelmente responsáveis pelas diferentes formas clínicas observadas na doença de Chagas. 3

24 Introdução Romanha, (1982) e Carneiro et al., (1990) identificaram quatro perfis eletroforéticos de isoenzimas analisados de amostras do T. cruzi isoladas de áreas endêmicas das regiões sul e sudeste do Brasil que foram denominados de zimodemas A, B, C e D. A comparação desses zimodemas com os descritos por Miles et al., (1977, 1978, 1980) mostrou uma forte correlação entre Z2 e ZA. Estudos subseqüentes realizados por Tibayrenc e Ayala, (1986) avaliando 15 locus enzimáticos em 121 amostras de T. cruzi de diferentes regiões geográficas, pertencentes tanto ao ciclo silvestre quanto ao ciclo doméstico, identificaram 43 grupos genéticos distintos, os quais foram denominados clones ou genótipos naturais. Posteriormente, Tibayrenc e Brenière, (1988) verificaram que quatro desses genótipos ou clonets (19, 20, 39 e 32) se apresentavam em maior distribuição entre os hospedeiros e localidades geográficas distintas, constituindo 53,7% dos isolados e, por isso, representariam os genótipos principais do parasito. Esses autores sugeriram que esses estoques clonais ubíquos teriam grande importância epidemiológica para a doença de Chagas, merecendo estudos preferenciais, em diferentes aspectos. De fato, diversos trabalhos demonstraram a presença desses genótipos em diferentes áreas da América Latina: genótipos 19 e 39 na Bolívia, inclusive em infecções mistas em vetores e em humanos (Noireau et al., 1995; Brenière et al., 1995; Brenière et al., 2002; Bastrenta et al., 2003); genótipos 19, 39 e 32 no Chile (Solari et al., 2001; Wallace et al., 2001; Coronado et al., 2006); e genótipo 39 na Argentina (Solari et al., 1992). Entretanto, a prevalência desses genótipos em outros países, inclusive no Brasil, ainda não foi determinada. Tibayrenc & Ayala, (1988) propuseram que o T. cruzi possui estrutura e evolução predominantemente clonal, observação que foi corroborada por vários autores empregando diferentes marcadores moleculares (Oliveira et al., 1998; Barnabé et al., 2000; Brisse et al., 2000; Westenberger et al., 2005; Subileau et al., 2009). Tal modelo implica que a reprodução sexual ou recombinação genética é um fenômeno extremamente raro nesta espécie; tão raro que não é capaz de impedir a existência de clones naturais estáveis no tempo e no espaço mesmo após sofrer pressões do hospedeiro e/ou ambientais. Sendo assim, a variabilidade genética do parasito expressa o longo tempo de evolução separada de múltiplos clones e poderia explicar a grande variabilidade biológica do agente etiológico e clínica da doença de Chagas. 4

25 Introdução Os polimorfismos de fragmentos de restrição do kdna ou RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) foram os primeiros estudos de polimorfismo de DNA descritos em T. cruzi (Morel et al., 1980). Essa metodologia foi proposta a partir da análise do polimorfismo de sítios de restrição dos minicírculos por serem estes numerosos nesta espécie, conferindo elevada sensibilidade à metodologia e permitindo evidenciar a variabilidade intra-específica do kdna exibidos por diferentes populações do parasito (Morel et al., 1980). No entanto, a classificação das amostras baseadas na análise do perfil de restrição do kdna (esquizodemas) necessita de amplificação prévia do isolado por cultura, podendo levar à seleção de sub-populações do parasito, a partir da população inicial presente no hospedeiro (Deane et al., 1984b). Sturm et al., (1989) otimizaram essa metodologia pela realização da digestão com enzimas de restrição diretamente do fragmento de 330pb, amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e que continha as regiões variáveis do minicírculo. Essa estratégia aumentou a sensibilidade da técnica, possibilitando que o estudo de esquizodemas fosse realizado nas amostras biológicas, sem prévia expansão e manuseio em cultura. Com a crescente evolução das técnicas de biologia molecular, diferentes metodologias têm sido também aplicadas para a genotipagem de cepas de T. cruzi em nível de DNA genômico ou nuclear. Dentre elas podemos destacar a análise do polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPD-Random amplified polymorfic DNA) e a impressão digital do DNA (DNA fingerpriting). Steindel et al., (1993) empregaram essa metodologia para analisar diversas cepas isoladas no estado de Santa Catarina e demonstraram uma clara similaridade genética, detectada pelo RAPD, entre cepas de um mesmo zimodema. Similarmente, Tibayrenc et al., (1993) avaliaram 24 estoques clonais de T. cruzi previamente caracterizados por isoenzimas e observaram paridade entre as duas técnicas além de demonstrar a convergência de isolados de T. cruzi para duas grandes subdivisões. Já a técnica do DNA fingerpriting baseia-se na análise do DNA nuclear pela utilização de sondas de mini-satélites humanos (DNA fingerprinting) e permitiu demonstrar uma grande heterogeneidade de cepas e clones desse parasito (Macedo et al., 1992). 5

26 Introdução A grande diversidade observada com os métodos descritos anteriormente não foi observada por Souto & Zingales, (1993) quando estudaram o gene que codifica o rrna 24Sα em diversos isolados de T. cruzi. Utilizando a técnica de PCR, os autores clonaram e seqüenciaram dois produtos distintos de diferentes isolados, com um fragmento de 125pb e com fragmento de 110pb, o que permitiu a classificação em dois grupos genéticos principais dentro da espécie T. cruzi: o grupo 1 e o grupo 2, respectivamente. O aumento do número de amostras permitiu demonstrar a existência de um terceiro grupo de cepas que apresentavam os dois fragmentos (110 e 125 pb), correspondentes à perfis híbridos, sendo então denominados grupo 1/2 (Souto et al., 1996). Posteriormente, Mendonça et al., (2002) e Pimenta (2002) ao analisar isolados da Amazônia pertencentes ao Z3, através das seqüências do gene rdna 24Sα detectaram um fragmento de tamanho intermediário (117pb), correspondente a um novo produto de amplificação do rrna. Análises da seqüência do gene mini-exon também determinaram a divisão de cepas e isolados do T. cruzi em dois grupos: as cepas que apresentaram um produto de 300pb foram designadas como pertencentes ao grupo 1 (ou linhagem 1) e aquelas que apresentaram um produto de 350pb foram designadas como pertencentes ao grupo 2 (ou linhagem 2) Souto et al., (1996). Similarmente, Fernandes et al., (1998) estudaram as seqüências de genes de miniexons de isolados de T. cruzi obtidos de diferentes reservatórios, e verificaram a existência de dois grupos genéticos distintos, linhagem 1 (associada principalmente com isolados humanos) e linhagem 2 (associada com o ciclo silvestre do parasito). Entretanto, algumas cepas não apresentavam produto de amplificação para o gene de mini-exon, apesar de apresentaram grande homologia com a seqüência do gene de cepas do grupo 2. Desse modo, essas cepas foram classificadas como Grupo 2 e apresentaram correlação com o Z3 de Miles. Ao analisar os dados obtidos pelos resultados das seqüências codificadoras para o rrna e para o gene do miniexon na avaliação das relações filogenéticas entre os isolados do T. cruzi, Souto et al., (1996) propuseram a classificação do T. cruzi em três grupos: Grupo I que apresenta um fragmento de 125 pb para o rrna e 330pb para o mini-exon, Grupo II que apresenta um fragmento de 110 pb para o rrna e 350pb para 6

27 Introdução o mini-exon e grupo 1/2 que apresenta ambos os produtos de amplificação do rrna e do produto do grupo I do mini-exon. O estudo do cariótipo do T. cruzi, demonstrou que a organização cromossomal entre diferentes cepas é bem conservada, entretanto, o número e o tamanho das bandas cromossômicas separadas por PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) apresenta grande variação entre as cepas e clones podendo ocorrer, inclusive, variações entre os clones derivados de uma mesma cepa (Gibson & Miles, 1986; Vargas et al., 2004). Clark & Pung, (1994) estudaram o polimorfismo do gene da subunidade 18S do rrna, através da técnica de RFLP, e classificaram as cepas de T. cruzi em grupos denominados ribodemas I, II e III. Foi observada uma forte correlação entre os marcadores genéticos para as subunidades 18S e 24Sα do rdna, sendo as cepas identificadas como ribodema I correspondentes ao grupo 1 e as cepas identificadas como ribodema II e III correspondentes ao grupo 2. Embora análises da variabilidade intraespecífica do T. cruzi demonstrem claramente uma ampla variabilidade biológica e genética desse parasito, as análises filogenéticas, empregando diferentes alvos no genoma do parasito, também revelam a tendência de agrupamento dos diferentes isolados em duas ou três subdivisões bem estruturadas. Nesse sentido, na busca de um consenso sobre a classificação genética do T. cruzi, e na uniformidade da nomenclatura empregada a fim de facilitar as correlações entre os diferentes estudos, a comunidade científica durante o Encontro Satélite realizado em abril de 1999, no Rio de Janeiro, em comemoração ao 90º aniversário da descoberta da doença de Chagas, decidiu padronizar a nomenclatura dos dois grupos de T. cruzi empregando a seguinte classificação (Anonymous, 1999): i) cepas classificadas como Zimodema 1 (Miles et al., 1978), Tipo III (Andrade, 1974) Ribodemas II/ III (Clark & Pung, 1994), Grupo 1 (Tibayrenc, 1995) e linhagem 2 (Souto et al., 1996) foram renomeadas T. cruzi I. ii) cepas classificadas como Zimodema 2 (Miles et al., 1978), Zimodema A (Romanha et al., 1979), Tipo II (Andrade, 1974), Ribodema I (Clark & Pung, 1994), 7

28 Introdução Grupo 2 (Tibayrenc, 1995) e linhagem 1 (Souto et al., 1996) foram designadas T. cruzi II. iii) cepas caracterizadas híbridas ou cuja caracterização seja inconclusiva, dentre as quais o Zimodema 3 (Miles et al., 1978), Zimodema B (Romanha et al., 1979) Zimodema Chileno 2b (Miles et al., 1984), Tipo 1 (Andrade, 1974) o grupo 1/2 (Souto et al., 1996), genótipo 39 (Tibayrenc, 1995) foram nomeadas T. cruzi. Entretanto, o desenvolvimento de novos marcadores multilocos para o estudo da diversidade genética do T. cruzi evidenciou a existência de mais subdivisões em T. cruzi (Barnabé et al., 2000a; Brisse et al., 2000; Brisse et al., 2001; Westerbeng, 2005; Subileau et al., 2009). Como já citado anteriormente, Tibayrenc, (1993) verificaram pelo perfil de isoenzimas e RAPD, que o T. cruzi pode ser subdividido em dois grandes que foram denominados de DTU1 e DTU2 (Discrete Typing). Posteriormente, a fim de melhor entender a estrutura populacional do T. cruzi II Brisse et al., (2000) utilizando análise de MLEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis) e RAPD (Randomly Amplified Polimorphic DNA) estudaram um grande número de isolados do parasito e propuseram a sua subdivisão em cinco sublinhagens discretas denominadas DTUs 2a, 2b, 2c, 2d e 2e. A DTU2b corresponde ao Zimodema 2 (Miles et al., 1977), as DTU 2c ao Zimodema 3 (Miles et al., 1977) e as DTUs 2d e 2e são linhagens híbridas estabelecidas após subseqüente propagação clonal. Nesse estudo, os autores ainda sugeriram que as DTUs IId e IIe foram consideradas produtos de um evento ancestral de hibridização entre DTUs IIb and IIc (Brisse et al., 2000a,b; Barnabé et al., 2000, 2003). Ao estudar esses mesmos subgrupos do T. cruzi, (Westenberger et al., 2005) demonstraram que as DTUs estão relacionadas através de dois fenômenos distintos de hibridização e postularam um modelo no qual a fusão entre DTU I e cepas IIb levaram à formação dos híbridos IIa e IIc que apresentam características de ambas as cepas e ainda uma segunda fusão entre cepas pertencentes às DTUs IIb e IIc que geraram os híbridos das DTUs IId e IIe. Posteriormente, esses mesmos autores demonstraram a presença da DTU IIb e seus híbridos IId e IIe coexistindo em uma mesma região geográfica (Westenberger et al., 2006). 8

29 Introdução Variações intraespecíficas do T. cruzi também tem sido demonstradas por meio da análise genes que codificam proteínas e rrna mitocondriais (Freitas et al., 2006, Westenberger et al., 2006). Avaliando genes mitocondriais, Freitas et al., (2006) sugeriram a existência de um terceiro grupo ancestral denominado T. cruzi III e que por eventos de hibridização desse com o T. cruzi II, teria originado os isolados de caráter híbrido que são observados atualmente. Desta maneira, as populações do T. cruzi seriam subdivididas em T. cruzi I, T. cruzi II e T. cruzi III (que corresponde ao Zimodema 3 e a DTU2c e os híbridos (que correspondem às DTU(s) 2d e 2e. A busca de uma correlação entre a variabilidade genética do T. cruzi e as diferentes manifestações clínicas na doença de Chagas, tem estimulado os pesquisadores a desenvolverem novas metodologias capazes de detectar alvos do parasito diretamente no sangue ou de tecidos provenientes do hospedeiro infectado Os microssatélites, que correspondem a pequenas seqüências em tandem de DNA com motivos de repetição de dois até seis nucleotídeos apresentam um elevado grau de polimorfismo em relação ao número de repetições de um dado loco e, portanto, são bastante úteis para o estudo da variabilidade genética do parasito. A primeira técnica a empregar esse alvo no genoma do parasito foi proposta por Oliveira et al., (1997) e foi denominada de SSR-PCR (Simple Sequence Repeat-anchored PCR). Os autores realizaram a amplificação simultânea de vários locos entre as repetições (CA)n de microssatélites, produzindo um perfil de múltiplas bandas. Posteriormente, esses mesmos autores caracterizaram oito locos polimórficos contendo microssatélites em diversas cepas de T. cruzi (Oliveira et al., 1998) e demonstraram sua importância para a reconstrução filogenética deste parasito. Além disso, Pimenta, (2002) demonstraram que os microssatélites são marcadores com um enorme poder de resolução. Recentemente, Valadares et al., (2008) demonstraram que as análises de microssatélites também apresentam boa estabilidade sob condições de laboratório, além de uma elevada sensibilidade. Dessa forma, essa técnica é adequada para detectar o T. cruzi em amostras biológicas mesmo quando esse está presente em baixa quantidade, dispensando o cultivo e a manipulação do parasito, o que poderia levar a diferenças do isolado original. Entretanto, Martins et al., (2008) observaram que a técnica de microssatélites não apresentou um bom rendimento para a identificação de clones no 9

30 Introdução sangue e em tecidos de animais com infecção mista atribuindo esse insucesso à baixa carga parasitária, o que diminuiria a sensibilidade da técnica. Dessa forma, outra abordagem deve ser empregada para caracterizar o T. cruzi diretamente de amostras biológicas que apresentam baixa quantidade do parasito. Neste sentido, a técnica de LSSP-PCR (Low-stringency Single Primer PCR), que utiliza um único iniciador complementar a um sítio específico do DNA molde, ao hibridizar com diversos sítios de maneira independente, é capaz de gerar um padrão complexo de fragmentos que constitui uma assinatura gênica, além de apresentar elevada sensibilidade (Pena et al., 1994). Essa metodologia foi a primeira capaz de detectar a variabilidade do kdna do T. cruzi diretamente de tecidos infectados sem necessitar de isolamento prévio das cepas infectantes, evitando a seleção de uma sobre a outra. Vago et al., (1996b, 2000) utilizaram essa mesma metodologia e avaliaram o tropismo tecidual do T. cruzi diretamente no coração e no esôfago de 15 pacientes chagásicos crônicos. Nesse estudo, foi demonstrado que a caracterização das populações do T. cruzi, presentes nos tecidos do coração e do esôfago, revelou diferentes perfis de assinaturas gênicas nestes órgãos, sugerindo que a variabilidade genética do parasito pode determinar diferentes tropismos, exercendo assim papel importante na evolução das diferentes formas clínicas da doença de Chagas. Por outro lado, Lages-Silva, (2001) utilizando essa mesma técnica, demonstrou identidade nos perfis de LSSP-PCR das populações do parasito isoladas do sangue por hemocultura e/ou pelo vetor de um mesmo paciente cujos perfis foram altamente representativos das populações teciduais. Lages-Silva et al., (2006) utilizando a técnica de LSSP-PCR para caracterizar cepas de T. cruzi obtidas de pacientes chagásicos, demonstraram um alto grau de variabilidade intra-específica entre os isolados, sendo únicos e específicos para cada paciente. Entretanto, esses autores não puderam correlacionar essa variabilidade genética com as características clínicas apresentadas pelos pacientes. Uma grande heterogeneidade genética também foi verificada por Salazar et al., (2006), ao utilizarem a técnica de LSSP-PCR para caracterizar isolados de T. cruzi obtidos diretamente no sangue de diferentes hospedeiros vertebrados e de vetores de diferentes regiões geográficas da Colômbia. 10

31 Introdução Recentemente, Brito et al., (2008) estudaram a variabilidade genética de cepas de T. cruzi isoladas de fezes de triatomíneos capturados do nordeste brasileiro através da técnica de LSSP-PCR. Os autores verificaram a presença de diferentes genótipos pertencentes ao T. cruzi I circulando entre diferentes espécies de vetores. No entanto, mesmo com os grandes avanços obtidos em relação ao desenvolvimento de metodologias capazes de detectar polimorfismos em diferentes alvos no genoma do T. cruzi, o estabelecimento de correlações entre a genética do parasito e suas características biológicas, epidemiológicas e clínicas da doença de Chagas ainda é difícil de ser demonstrado. Possivelmente, fatores do hospedeiro devem ser considerados para um maior entendimento desta íntima relação parasito-hospedeiro. 1.3) Correlação entre a diversidade genética do T. cruzi e suas propriedades biológicas Diversos trabalhos utilizando diferentes modelos experimentais mostraram que o T. cruzi apresenta uma grande variabilidade nas suas propriedades biológicas, inclusive no tropismo tecidual e na susceptibilidade aos nitroderivados (Chagas, 1909; Vianna, 1911; Brener & Chiari, 1963; Melo & Brener, 1978; Bice & Zeledon, 1970; Andrade, 1974; Brener et al., 1976; Filardi & Brener, 1987; Lenzi et al., 1998). Considerando que o T. cruzi apresenta estrutura e evolução predominantemente clonal é esperada uma evolução pareada entre a divergência filogenética de diferentes clones e genes que dirigem importantes propriedades do parasito relacionadas à virulência, patogenicidade e a epidemiologia da doença. Portanto, essa evolução nãoindependente implicaria em uma forte correlação entre a variabilidade genética do parasito e essas propriedades (Tibayrenc, 2003). Dessa forma, os genótipos de T. cruzi filogeneticamente próximos ou aparentados, teriam propriedades biológicas ou clínicas semelhantes e os genótipos filogeneticamente distantes apresentariam propriedades mais distintas entre si (Tibayrenc et al., 1986; Tibayrenc & Ayala, 1988). A fim de investigar essa correlação, diferentes estudos foram realizados em cultura, no vetor ou em camundongo e demonstraram uma forte associação entre a distância genética e as propriedades biológicas do parasito. De um modo geral, as 11

32 Introdução populações pertencentes aos genótipos 19 e 20, filogeneticamente próximos e correspondentes ao grupo T. cruzi I (Anonymous, 1999) apresentaram maior habilidade em infectar e completar seu ciclo de vida no inseto vetor (Garcia & Dvorak, et al., 1982; Garcia & Azambuja, 1991; Lana et al., 1998), maior capacidade de realizar a metaciclogênese, maior capacidade de multiplicação no hospedeiro vertebrado (Andrade, 1974; Andrade et al., 1983; Sànchez et al., 1990; Gonzalez et al., 1995; Andrade & Magalhães, 1997; Wallace et al.; 2001; Toledo et al., 2002) e maior capacidade de multiplicação e diferenciação em meios de cultura celular e acelular (Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998) do que as populações pertencentes aos genótipos 39 e 32, correspondentes ao grupo T. cruzi II, geneticamente mais relacionados entre si e distantes dos genótipos 19 e 20 que apresentaram características opostas em relação a todos estes parâmetros analisados. Com relação à susceptibilidade a fármacos, foi demonstrado em diversos trabalhos, que cepas do grupo T. cruzi I apresentaram elevado grau de resistência, tanto em cultivo celular como em camundongos, enquanto as cepas do grupo T. cruzi II foram mais susceptíveis (Andrade et al., 1985a; Andrade & Magalhães, 1997, Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2003). Por outro lado, Villareal et al., (2004) não conseguiram estabelecer correlação entre susceptibilidade ao BZ e distância filogenética do parasito in vitro. Estes resultados analisados em conjunto, enfatizam a crucial importância de considerar a diversidade filogenética dos clones naturais do T. cruzi em todos os estudos referentes a biologia e susceptibilidade aos quimioterápicos, pois tem sido observada uma grande variabilidade entre os clones de um mesmo genótipo (Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2003, 2004; Martins et al., 2006, 2007). Estes resultados sugerem a necessidade de considerar subgrupos menores do parasito ou a utilização de marcadores moleculares mais discriminantes para melhor avaliar a associação entre a genética do parasito e suas características biológicas, de susceptibilidade a fármacos e clínicas. Ao investigar a associação entre divergência filogenética e resposta à quimioterapia, Toledo et al., (2003, 2004) demonstraram importantes diferenças na sensibilidade a quimioterápicos entre essas mesmas populações de T. cruzi. Esses autores, avaliando a ação do BZ em camundongos BALB/c, observaram que clones pertencentes ao grupo genético T. cruzi I (genótipos 19/20) foram altamente resistentes 12

33 Introdução ao tratamento, enquanto clones pertencentes ao grupo genético T. cruzi II (genótipos 32 e 39) foram susceptíveis ou parcialmente susceptíveis. Foi demonstrado ainda que a resistência observada para T. cruzi I foi devido aos isolados pertencentes ao genótipo 20 (100% de resistência), já que o genótipo 19 inclui clones sensíveis, parcialmente e totalmente resistentes ao BZ. Os diferentes graus de susceptibilidade ao BZ observado para clones pertencentes ao grupo T. cruzi II se deve ao fato que nesse grupo estão incluídos clones resistentes ou susceptíveis ao tratamento (genótipo 39) e clones que apresentam um perfil típico de susceptibilidade (genótipo 32). A correlação entre divergência filogenética e propriedades biológicas foi particularmente demonstrada por Toledo et al., (2002) ao estudar estoques clonais do T. cruzi. Os autores utilizaram camundongos BALB/c inoculados com clones pertencentes aos genótipos principais do T. cruzi (19, 20, 39 e 32) e avaliaram comparativamente 14 parâmetros durante as fases aguda e crônica da infecção. Os resultados obtidos demonstraram que os genótipos mais relacionados entre si (19x20 ou 32x39) apresentaram um menor número de diferenças significativas do que os genótipos geneticamente distantes (19 ou 20 versus 32 ou 39), exceto para a comparação 19x32. Clones do genótipo 20 foram os mais virulentos e patogênicos e na fase aguda da infecção, enquanto clones do genótipo 39 foram os únicos nos quais se detectou parasitismo tecidual durante a fase crônica. Ao estudar o impacto da variabilidade genética de clones pertencentes aos genótipos principais do T. cruzi (19, 20 e 39), Diego et al., (1998) verificaram uma correlação entre distância genética e achados histopatológicos em camundongos Swiss. Os animais infectados com o genótipo 20 apresentaram comprometimento encefálico correspondendo a áreas de inflamação e necrose. Foi observado também parasitismo no baço e fígado apenas em animais infectados com o genótipo 39. O tropismo para o músculo esquelético foi acentuado para todos os genótipos e mais intenso que o cardiotropismo, que por sua vez apresentou diferenças entre todos os genótipos. Apesar dos diversos clones de T. cruzi apresentarem um tropismo preferencial para determinados tipos celulares, a correlação entre a variabilidade genética do T. cruzi e as diferentes formas clínicas da doença ainda não está bem estabelecida. Nesse sentido, D Ávila et al., (2006) caracterizaram isolados de pacientes infectados pelo 13

34 Introdução parasito na fase crônica da infecção, a fim de estabelecer uma correlação entre o perfil de RAPD dos isolados e as diferentes formas clínicas apresentadas pelos pacientes. Apesar da grande similaridade entre isolados, indicando a presença de grupos genéticos bem correlacionados, os autores não conseguiram estabelecer essa correlação. Apesar desses diversos genótipos principais (Tibayrenc e Brenière, 1988) apresentarem características peculiares em diversos parâmetros biológicos, na resposta à quimioterapia, bem como no tropismo tecidual, a associação entre esses grupos genéticos do T. cruzi, além das características genéticas do hospedeiro parecem resultar em importantes alterações no curso da infecção chagásica (Lana et al., 2000; Martins et al., 2006). 1.4) Genética do parasito e distribuição tecidual do T. cruzi A distribuição tecidual preferencial de cepas do T. cruzi em humanos e animais experimentais tem sido discutida por muitos autores desde o início do século. Viannia, (1911) verificou que o T. cruzi poderia ser encontrado em diferentes tecidos do hospedeiro vertebrado, embora os parasitos apresentassem certa preferência por determinados grupos celulares. Diferenças no tropismo tecidual foram observadas por Brener, (1977) e Melo & Brener, (1978) em camundongos inoculados com diferentes cepas (Y, Berenice, ABC e CL) quando verificaram parasitismo preferencial para dois sistemas de células, as fagocitárias do baço, fígado e medula óssea (cepas Y e Berenice) e células musculares lisa, esquelética e cardíaca (cepa ABC e Berenice). Diversos autores têm demonstrado que as populações do T. cruzi são multiclonais, constituídas por populações heterogêneas (Macedo et al., 2002, 2004) e consideram que as propriedades biológicas e bioquímicas de cada clone determinariam o tropismo tecidual diferenciado, resultando em intensas investigações na tentativa de correlacionar a genética do parasito com as diferentes formas clínicas. Dessa forma, as cepas representariam uma variedade de clones que interagem de maneira diferente em diversos ambientes. O homem, por exemplo, ao ser infectado por esse arsenal de clones, poderia, através do seu sistema imunológico, eliminar alguns deles devido à sua 14

35 Introdução inabilidade de competir e se propagar no ambiente humano. Dessa forma, o hospedeiro funcionaria como um filtro biológico, diminuindo a complexidade da cepa infectante. Entretanto, os clones remanescentes poderiam apresentar tropismos para diferentes tipos celulares e, como conseqüência, determinar o curso clínico da doença. Este cenário levou a criação do Modelo Histiotrópico Clonal da doença de Chagas (Macedo & Pena,1998). Essa variação no tropismo tecidual de diferentes populações do T. cruzi também foi demonstrada por Andrade et al., (1999) que, ao infectarem camundongos BALB/c simultaneamente com duas diferentes populações do parasito (a cepa JG, isolada de um paciente com megaesôfago e o clone CoL1.7G2, isolado do sangue de um paciente com a forma cardíaca) demonstraram uma clara diferença na distribuição tecidual das populações do parasito tanto nas infecções mistas quanto nas infecções monoclonais. Após três meses de infecção, o clone CoL1.7G2 predominou sobre a cepa JG no reto, diafragma, esôfago e no sangue, enquanto a cepa JG foi encontrada no músculo cardíaco do mesmo animal. Esses resultados não apenas fornecem evidências do tropismo tecidual de cepas na fase crônica da infecção, mas também demonstraram a importância de se considerar a variabilidade genética do hospedeiro na distribuição tecidual do parasito. Apesar dos diversos clones de T. cruzi possuírem um tropismo tecidual para órgãos específicos, vários mecanismos dependentes do hospedeiro podem também estar envolvidos no processo de distribuição tecidual diferenciado do parasito (Russo et al., 1996). 1.5) Genética do hospedeiro e distribuição tecidual do T. cruzi Ao abordar aspectos genéticos do hospedeiro como um dos fatores determinantes das formas clínicas da doença de Chagas, Andrade et al., (2002) estudaram o papel de genética de camundongos na distribuição tecidual de populações clonais do T. cruzi. Os autores compararam as infecções experimentais entre animais das linhagens BALB/c e DBA-2 (ambos haplótipo 2d), C57BL/6 (haplótipo 2b) e Swiss infectados com o clone Col1.7G2 e com a cepa monoclonal JG. Os camundongos BALB/c e DBA-2 infectados com a mistura das duas populações apresentaram o mesmo padrão de distribuição 15

36 Introdução tecidual do parasito, com a cepa JG predominando no coração e o clone CoL1.7G2 predominando no reto e em outros tecidos. Entretanto, o mesmo padrão de distribuição não foi observado para os camundongos da linhagem C57BL/6 e Swiss. Nos animais da linhagem C57BL/6, o clone CoL1.7G2 foi detectado em quase todos os tecidos analisados, inclusive no coração, semelhante ao observado para os camundongos Swiss, com exceção do sangue e reto, onde predominou a cepa JG, indicando a importância de aspectos genéticos do hospedeiro no padrão de distribuição tecidual de populações do T. cruzi. Embora a exata causa dessa variabilidade clínica ainda deva ser elucidada, diversos trabalhos indicam que a região do MHC do hospedeiro modula o dano tecidual, a sua sobrevivência (Wrightsman et al., 1984) e a susceptibilidade/resistência à infecção pelo T. cruzi no modelo murino (Trischmann et al., 1982), já que a interação do MHC com o parasito poderia influenciar na resposta humoral contra este parasito (Aguillon et al., 2000) e na indução de apresentação de antígenos à células TCD8 + (Van Overtvelt et al., 2002) através da modulação da expressão de moléculas pelo T.cruzi (Alba Soto et al., 2003). Apesar de alguns autores terem demonstrado nenhuma ou pouca influência do MHC no desenvolvimento das diferentes formas clínicas da doença de Chagas em pacientes do Brasil (Fae et al., 2000), estudos em indivíduos com infecção pelo T. cruzi do México sugeriram que alguns alelos do MHC poderiam estar associados com as formas clínicas da doença crônica, especialmente com maior risco de desenvolver a doença cardíaca (Cruz-Robles et al., 2004). Recentemente, Freitas et al., (2009) estudaram a doença de Chagas no modelo murino e demonstraram que a região do MHC do hospedeiro influencia o padrão de distribuição tecidual de cepas de T. cruzi, o qual poderia, na infecção humana, contribuir para a determinação das formas clínicas da doença de Chagas. Os autores demonstraram que o clone CoL1.7G2 predominou no coração de animais C57BL/6 (H-2b), enquanto a cepa JG foi a que predominou no coração de camundongos da linhagem C57BLKS/J (haplótipo H2-d). Outros trabalhos ainda demonstraram que tanto o parasito quanto o hospedeiro têm um importante papel no desenvolvimento da infecção não só na fase crônica, mas também na fase aguda da doença. (Andersson et al., 2003) demonstraram que camundongos da linhagem CBA/J e BALB/c infectados com a cepa Talahuen 16

37 Introdução desenvolveram uma greve doença aguda com elevada taxa de mortalidade e uma severa miocardite, ao contrário dos camundongos CBA/J infectados com a mesma cepa que também desenvolveram miocardite, mas com menos severidade. Os camundongos BALB/c infectados com o clone CA-1 apresentaram uma fase aguda menos grave do que aqueles infectados com a cepa Talahuen. Este conjunto de resultados indica que além do polimorfismo genético do parasito, a genética do hospedeiro também seria responsável pela distribuição tecidual diferenciada de populações do T. cruzi e, conseqüentemente, pelas diferentes formas clínicas da doença de Chagas. 1.6) Infecções mistas ou policlonais e suas conseqüências para o hospedeiro A utilização de técnicas moleculares capazes de detectar o parasito diretamente no sangue de hospedeiros humanos ou fezes de triatomíneos, tem detectado a ocorrência de infecções mistas ou policlonais em diferentes hospedeiros invertebrados e vertebrados, inclusive no homem (Tibayrenc et al., 1985; Bosseno et al., 1996; Solari et al., 1998; Lisboa et al., 2006; Rozas et al., 2007a; Brenière et al., 1995; Lauria-Pires et al., 1996; Brenière et al., 1998; Solari et al., 2001; Di Noia et al., 2002; Torres et al., 2003; Mejia et al., 2005; Herrera et al., 2008; Lisboa et al., 2008). Esses resultados sugerem que as infecções mistas devem ter implicações importantes na epidemiologia da doença, podendo desencadear respostas imunológicas, lesões histopatológicas e evolução clínica distintas das observadas nas infecções monoclonais. Estudos de infecções mistas experimentais em vetores e hospedeiros vertebrados vêm sendo realizados por diversos autores. Pinto et al., (1998) comparando os percentuais de infectividade, a produção das formas epimastigotas e a taxa de metaciclogênese em T. infestans, em infecções mistas e monoclonais por clones dos genótipos principais (19, 20, 39 e 32), verificaram que não ocorre apenas uma justaposição entre os clones da mistura, mas uma interação entre eles, sendo observados tanto efeitos de estimulação quanto de inibição recíprocos. Desse modo, clones do genótipo 32, que apresentam baixa infectividade e multiplicação de parasitos no inseto vetor, quando combinados com clones do genótipo 19/20, que são mais fortes para essas 17

38 Introdução propriedades nas infecções monoclonais, foram capazes de permanecer no hospedeiro invertebrado e às vezes até mais presentes do que aqueles dos genótipos 19/20. Resultados semelhantes foram obtidos por Lana et al., (2000) ao estudarem infecções mistas com alguns desses mesmos clones no modelo murino quando analisaram os parâmetros de infectividade, curva de parasitemia e percentual de positividade de hemocultura nos animais. Ao estudar o efeito de infecções mistas no hospedeiro vertebrado, sobre diferentes propriedades biológicas do T. cruzi, Martins et al., (2006) verificaram que não se pode determinar o comportamento de uma infecção mista considerando o conhecimento individual das propriedades dos clones que a constituem. Estes autores observaram alterações na maioria das misturas estudadas, principalmente em relação à curva de parasitemia, sendo também constatados efeitos de inibição e estimulação recíprocos entre os clones da mistura, semelhante ao observado por Pinto et al., (1998) e Lana et al., (2000). Essas interações que ocorrem entre as populações do parasito podem alterar não apenas parâmetros biológicos na infecção, mas também a resposta à quimioterapia. Martins et al., (2008) demonstraram que o tratamento de infecções mistas parece ser mais complexo que o tratamento de infecção monoclonal. Os resultados obtidos demonstraram uma alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol quando foram consideradas, principalmente, as subdivisões menores do T. cruzi, sendo observado tanto aumento quanto diminuição da susceptibilidade ao fármaco baseado nas suas respectivas infecções monoclonais. Isso sugere que a correlação entre a genética do parasito e a resposta ao tratamento pode ser ainda mais difícil de ser estabelecida em infecções mistas, motivando ainda mais este tipo de estudo. Um achado interessante nesse trabalho foi a mudança no perfil molecular em 11,6% dos clones remanescentes em animais INT e TNC quando comparados aos clones neles inoculados, através das técnicas de microssatélites e isoenzimas. Mudanças no perfil genético desses mesmos clones foram também verificadas anteriormente por Toledo (2001) e Lana & Toledo, (2004) em infecção monoclonal, em animais submetidos ao tratamento utilizando as técnicas de MLEE e RAPD para a caracterização dos isolados. Outros trabalhos na literatura também demonstraram 18

39 Introdução mudanças genéticas em amostras clonadas de alguns protozoários, como o T. cruzi e Leishmania e acredita-se que a pressão exercida pelo fármaco seja um dos fatores indutores dessa alteração (Beverley & Coburn, 1990; MacDaniel e Devorak, 1993; Alves et al., 1996; Pacheco & Brito, 1999). No entanto, a constatação de mudança do perfil genético em animais com infecções mistas não tratados, sugere ainda que tais mudanças possam ser decorrentes de interações entre os clones e/ou pressão da resposta imune do hospedeiro como já demonstrado por Lana et al., (2000) e Martins et al., (2008) no modelo murino. Franco et al., (2003) ao estudar o efeito de infecções mistas do T. cruzi em ratos inoculados com a cepa monoclonal JG (isolada de um paciente com megaesôfago) e com o clone CL-Brener (miotrópico) demonstraram que o clone CL-Brener, que sozinho provoca um intenso processo inflamatório nos músculos cardíaco e esquelético, em associação com a cepa JG foi eliminado do coração ou reduzido a níveis indetectáveis pela metodologia de LSSP-PCR. Nas infecções mistas, somente a cepa JG foi encontrada no músculo cardíaco no final da fase aguda e durante a fase crônica. Os resultados mostraram uma tendência da cepa JG em parasitar os órgãos anteriormente parasitados pelo clone CL-Brener, sendo esse comportamento aparentemente dependente do tamanho do inóculo. Com um inóculo de 10 3 tripomastigotas de cada população, não foi detectado DNA do clone CL-Brener em nenhum dos tecidos avaliados, ocorrendo o mesmo para os animais com infecção monoclonal com esse clone. Entretanto, o kdna do clone CL-Brener estava presente no esôfago e no músculo esquelético dos animais inoculados com 10 4 tripomastigotas de cada população. Além desse comportamento, a dupla infecção preveniu a alta mortalidade induzida pelo clone CL-Brener, quando comparadas com sua respectiva infecção isolada. Mais recentemente, Martins et al., (2008) empregando a PCR realizada em tecidos em paralelo à PCR feita em eluato de sangue como método de avaliação da eficácia terapêutica do BZ (juntamente com avaliações sorológicas e parasitológicas usualmente empregadas como critério de cura) em camundongos BALB/c com infecções mistas por clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais (19, e 32) verificaram uma ampla distribuição tecidual do kdna do parasito no coração, músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon em ambas as fases da infecção. 19

40 Introdução É interessante ressaltar ainda que no grupo de animais tratados e considerados curados (TC) por todos os demais exames, inclusive pela PCR em eluato de sangue, foi detectada elevada frequência de positividade para o kdna do parasito no coração e músculo esquelético semelhante ao observado nos animais infectados e não tratados (INT). Como observado nos animais tratados e não curados (TNC), a bexiga passou a representar um importante sítio de deteção do kdna do T. cruzi. Quando os resultados da PCR em tecido dos animais tratados curados foram avaliados considerando as combinações genotípicas, foi observada uma alta positividade para camundongos infectados com as misturas e 19+39; e média e baixa positividade para os animais infectados com os genótipos e 19+32, respectivamente. A PCR tem sido também de extrema importância para a avaliação do tropismo tecidual do parasito em tecidos de pacientes e de animais infectados experimentalmente pelo T. cruzi (Olivares-Villago, 1998; Cruz et al., 2002; Vera-Cruz et al., 2003; Veloso et al., 2007; Martins et al., 2008). Baseado nos trabalhos que reforçam a sensibilidade da técnica de LSSP-PCR (Pena et al., 1994; Vago et al., 1996, 2000; Lages-Silva et al., 2001, 2006; Salazar et al., 2006; Brito et al., 2008; Freitas et al., 2009), considerando a importância do parasito na gênese e na perpetuação das lesões na doença de Chagas, e que o tratamento com benzonidazol apresentou um papel seletivo sobre os clones de T. cruzi presentes nas infecções mistas destes animais detectadas no sangue do hospedeiro e alguns de seus tecidos, em paralelo à mudança do perfil genético dos parasitos originalmente presentes na mistura, este trabalho visa, por meio dessa metodologia, detectar e identificar os clones de T. cruzi diretamente de tecidos do hospedeiro, determinando assim o seu tropismo tecidual no sentido de tentar compreender melhor o papel da genética do parasito na gênese das lesões e das infecções mistas na evolução das manifestações clínicas observadas na doença de Chagas. 20

41 2.0) Justificativa

42 Justificativa Como exposto anteriormente, o T. cruzi apresenta uma ampla variabilidade genética e a ocorrência de infecções mistas por clones desse parasito na natureza é um evento freqüente, tanto nos hospedeiros vertebrados (humanos e reservatórios) quanto nos invertebrados (vetores). Além disso, estudos experimentais com infecções mistas, inclusive pelo nosso próprio grupo, têm verificado interações entre diferentes populações do parasito que resultam em alterações importantes no comportamento biológico, evolução da infecção e na resposta à quimioterapia. Esses dados sugerem a necessidade de aprofundar o estudo da influência de infecções mistas em relação a outros parâmetros determinantes da patogênese da doença tal como o tropismo tecidual dos parasitos em animais tratados e não tratados etiologicamente. Já está bem estabelecida a importância do parasito na gênese e na perpetuação das lesões e conseqüentemente na evolução da doença, o que tem motivado várias investigações no intuito de estabelecer uma correlação entre a forma clínica da doença de Chagas e a variabilidade genética do T. cruzi. Entretanto, com os marcadores moleculares disponíveis até o momento, esta correlação não foi claramente demonstrada. Essa falha provém provavelmente da interação que se estabelece entre o parasito e seu hospedeiro, a qual é naturalmente mais complexa em infecções mistas ou policlonais, decorrentes do fato de que diferentes clones do parasito sofreriam pressões distintas do hospedeiro nas diferentes fases da infecção, da possível interação entre eles, além do papel do hospedeiro e de sua genética na evolução da infecção. Dessa forma, a proposta do presente trabalho é avaliar o tropismo tecidual de clones de T. cruzi em animais com infecções mistas submetidos ou não ao tratamento com benzonidazol comparando-as com suas respectivas infecções monoclonais. 22

43 3.0) Objetivos

44 Figueiredo, L. M. Objetivos 3.1) Objetivo Geral Avaliar o impacto de infecções mistas por clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais 19, 20, 39 e 32 (Tibayrenc & Brenière, 1988) no tropismo tecidual de camundongos BALB/c na fase crônica da infecção tratados ou não com benzonidazol. 3.2) Objetivos específicos 3.2.1) Comparar o tropismo tecidual do T. cruzi em infecções mistas com o de suas respectivas infecções monoclonais nos animais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol; 3.2.2) Identificar por LSSP-PCR os clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas de clones pertencentes aos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol que apresentaram alteração no tropismo tecidual quando comparado às suas respectivas infecções monoclonais; 3.2.3) Identificar os clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de animais com infecções mistas tratados que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol (Martins et al., 2007) e nos animais infectados não tratados (INT) pela técnica de LSSP-PCR e comparar com aqueles isolados por hemocultura do sangue periférico e caracterizados por isoenzimas e microssatélites e diretamente nos tecidos por microssatélites (Martins, 2008); 3.2.4) Avaliar o impacto do tratamento no tropismo dos clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos com infecção mista tratados com benzonidazol e considerados curados pelo critério de cura empregado [(exame de sangue a fresco (ESF), hemocultura, ELISA, pesquisa de anticorpo anti-tripomastigota vivo (AATV) e PCR em eluato de sangue)] e que apresentaram PCR em tecido positiva (tratados curados - TC) e compará-los com os resultados obtidos de animais tratados não curados (TNC) e não tratados (INT). 24

45 4.0) Delineamento experimental

46 Delineamento experimental Camundongos BALB/c, fêmeas, 28 a 30 dias de idade 8 Infecções monoclonais: TS/animal de cada clone, via IP (Não tratados e Tratados) 24 Infecções mistas: TS de cada clone/animal, via IP (Não tratados e Tratados) - Martins et al., 2006 Necropsia: dias de infecção: coração, músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon Tecidos: extração de DNA (Vago et al., 1996) PCR: Gomes et al., (1998) Critério de cura utilizado (ESF, Hc, ELISA, AATV, PCR em eluato de sangue e em tecido) nos animais com infecção mista. Caracterização molecular de clones de T. cruzi no sangue e tecidos de animais com infecção mista pelas técnicas de isoenzimas (Ben Abdenrrazak et al., 1993) e microssatélites (Valadares et al., 1997) Martins (2008) Caracterização molecular por LSSP-PCR dos clones de T. cruzi nos tecidos de animais com infecção mista (Vago et al., 1996) i) Animais com misturas onde a PCR revelou mudança de tropismo do parasito em relação às infecções monoclonais; (ii) Animais com misturas que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol; iii) Animais tratados e considerados curados (TC) e com PCR em tecido positiva; (iv) (ii) e (iii); (v) Animais com misturas cuja caracterização molecular dos parasitos identificados por isoenzimas e microssatélites revelou predominantemente o clone mais susceptível ao benzonidazol; 26

47 5.0) Animais, material e métodos

48 Animais, material e métodos 5.1) Clones do Trypanosoma cruzi Nesse estudo, foram utilizados oito estoques clonais do T. cruzi pertencentes aos genótipos principais 19, 20, 39 e 32 descritos por Tibayrenc & Brenière, (1988). Essas amostras foram isoladas de diferentes hospedeiros, vertebrados e invertebrados, originárias de diversas regiões geográficas e países da América Latina (Tabela I), clonadas por técnicas de micromanipulação e mantidas criopreservadas no Laboratoire de Génetique des Maladies Infectieuses, Unité Mixte de Recherche (UMR) Institute de la Recherche sur le Dévelopment (IRD)/Conceil Nationale de la Recherche Scientific (CNRS), Montpellier, França. Tabela I: Hospedeiros, origem geográfica, virulência e susceptibilidade ao benzonidazol dos oito clones de Trypanosoma cruzi utilizados nesse estudo. Susceptibilidade Classificação Genótipos Clones Hospedeiros Região, País Virulência ao BZ Gamba c1 T. cruzi I 19 OPS21 cl11 P209 cl1 T. cruzi I 20 Cuica cl1 Bug2148 cl1 T. cruzi 39 SO3 cl5 IVV cl4 T. cruzi II 32 MAS cl1 Didelphis azare São Paulo, Brasil Maior 40% Homem, Cojedes, Menor fase aguda Venezuela 100% Homem, fase crônica Sucre, Bolívia Maior 0% Opossum cuica São Paulo, philander Brasil Menor 0% Triatoma Rio Grande do infestans Sul, Brasil Maior 0% Triatoma Potosi, infestans Bolívia Menor 100% Homem, Brasília, fase crônica Brasil Maior 40% Homem, Santiago, fase crônica Chile Menor 100% 28

49 Animais, material e métodos 5.2) Obtenção dos inóculos A inoculação dos animais foi feita segundo o descrito por Martins et al., (2006). Resumidamente, os estoques clonais criopreservados foram descongelados, mantidos em crescimento exponencial em meio LIT (Liver Infuso Triptose - Camargo, 1964), a 28ºC e os tripomastigotas metacíclicos obtido dessas culturas inoculados em camundongos albinos Swiss, de dias de idade, para obtenção de tripomastigotas sanguíneos os quais foram utilizados na inoculação dos grupos experimentais. 5.3) Infecções experimentais avaliadas Para as infecções monoclonais, um grupo de oito camundongos BALB/c, isogênicos, fêmeas com dias de idade, provenientes do Biotério do Instituto de Ciências Biológicas (CEBIO) da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, foram inoculados por via intraperitoneal com tripomastigotas sanguíneos de cada um dos oito clones de T. cruzi por animal, contados segundo a técnica de Brener, (1962). Os grupos de animais com infecções mistas são originários do estudo de Martins et al., (2006) e foram analisados comparativamente às infecções monoclonais. Os animais foram inoculados nas mesmas condições anteriores, porém com 5000 tripomastigotas de cada clone componente da mistura. Os clones foram combinados aos pares considerando seus perfis de virulência e susceptibilidade ao BZ em camundongos BALB/c determinados por Toledo et al., (2002, 2003) em infecções monoclonais, resultando em 24 misturas distintas (Tabela II). O presente trabalho constitui, portanto uma continuação dos estudos de Martins et al., (2008) cujo projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Ouro Preto, MG, Brasil, protocolo n o 77/

50 Animais, material e métodos Tabela II: Misturas de clones do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais utilizados na infecção de camundongos BALB/c combinados segundo o padrão de virulência e susceptibilidade ao benzonidazol. Misturas de clones Misturas de genótipos + Virulento/+resistente + Virulento/+resistente - Virulento/-resistente - Virulento/-resistente + Virulento/+resistente - Virulento/-resistente - Virulento/+resistente +Virulento/+resistente Gamba cl1 + P209 cl1 OPS21 cl11 + Cuica cl1 Gamba cl1 + Cuica cl1 OPS21 cl11 + P209 cl Gamba cl1 + IVV cl4 OPS21 cl11 + MAS cl1 Gamba cl1 + MAS cl1 OPS21 cl11 + IVV cl Gamba cl1+ Bug2148 cl1 OPS21 cl11 + SO3 cl5 Gamba cl1 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + Bug2148 cl P209 cl1 + IVV cl4 Cuica cl1 + MAS cl1 P209 cl1 + MAS cl1 Cuica cl1 + IVV cl P209 cl1 + Bug2148 cl1 Cuica cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + Bug2148 cl IVV cl4 + Bug2148 cl1 MAS cl1 + SO3 cl5 IVV cl4 + SO3 cl5 MAS cl1 + Bug2148 cl ) Confirmação da infecção ) Exame de sangue a fresco Para a confirmação da infecção antes de se iniciar o tratamento foi feito o exame de sangue a fresco realizado segundo Brener, (1962) entre o 4 o e 10 o dia após a inoculação. Para tal, amostras de sangue foram coletadas diariamente da veia caudal do animal e examinadas ao microscópio óptico (aumento de 40 vezes) para a pesquisa de formas tripomastigotas sangüíneas. Nos animais cuja infecção não pôde ser comprovada pelo exame de sangue a fresco até o 10 o dia após a inoculação foi realizada hemocultura segundo Filardi & Brener, (1987) sendo para isto coletados aproximadamente 0,5 ml de sangue do seio venoso retro-orbital de cada animal. Essas amostras foram distribuídas em dois tubos cônicos de 15 ml contendo 3mL de meio LIT, incubadas a 28 C e homogeneizadas a cada 48h. Para detecção do parasito, uma gota da hemocultura foi examinada ao microscópio óptico no 30 o, 60 o, 90 o e 120 o dias após cultivo. 30

51 Animais, material e métodos 5.4) Tratamento dos animais 5.4.1) Fármaco O derivado nitroimidazólico Benzonidazol (BZ - Rochagan, Roche) foi utilizado para o tratamento dos animais infectados com clones do T. cruzi por ser classicamente empregado no tratamento da doença de Chagas humana (Cançado & Brener, 1979) ) Esquema de tratamento O tratamento com BZ foi iniciado no 10 o dia de infecção, utilizando uma dose diária de 100mg/kg de peso corporal (Brener, 1962). O fármaco foi administrado por gavagem na forma de suspensão em goma arábica, durante 20 dias consecutivos. Todos os animais incluídos nesse estudo tiveram a infecção confirmada pela detecção do parasito através do exame de sangue a fresco e, quando necessário, por meio da hemocultura (Filardi & Brener, 1987). 5.5) Necrópsia dos animais Os animais foram necropsiados com duas finalidades: (i) para se verificar o tropismo tecidual do parasito pela técnica de PCR (Gomes et al., 1998) e (ii) viabilizar sua identificação nos tecidos de animais com infecção mista pela metodologia de LSSP- PCR (Vago et al., 1996). A necropsia dos animais foi feita na fase crônica (FC) da infecção entre o 120 o e 125 o dia após inoculação. Os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical e os tecidos coletados lavados exaustivamente com PBS estéril, secados em papel absorvente, recortados em pequenos fragmentos e armazenados a -70ºC. Para a preservação dos tecidos todas as etapas foram realizadas em banho de gelo. Após o processamento de cada um dos fragmentos, o material cirúrgico foi higienizado em solução de hipoclorito de sódio a 2%, lavado com PBS e secado em papel absorvente. 31

52 Animais, material e métodos 5.6) Comparação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi nas infecções monoclonais e mistas tratadas e não tratadas pela técnica de PCR Para se comparar o tropismo tecidual do kdna do parasito nos animais com infecções monoclonais e mistas não tratados e tratados com BZ foi empregada a técnica de PCR (Gomes et al., 1998). A PCR foi realizada em seis órgãos/tecidos (coração, músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon) coletados de cada animal não tratado (INT) e tratado (IT) com benzonidazol uma vez que os resultados obtidos por Martins et al., (2008) demonstraram que estes foram os tecidos de camundongos com infecções mistas pelos estoques clonais pertencentes aos genótipos principais de Tibayrenc e Brenière, (1988) que apresentaram a maior taxa de positividade para o kdna do T. cruzi. A análise das taxas de positividade da PCR nos seis tecidos de animais com infecção monoclonal foi realizada pelo teste Chi-quadrado ) PCR em tecido ) Extração de DNA tecidual A extração de DNA em órgãos/tecidos foi realizada pela técnica de lise alcalina, segundo Vago et al., (1996) com algumas modificações. Cada fragmento de tecido foi macerado em tubos eppendorf de 1,5mL e acrescentado de 120µL de água milli-q estéril e 6µL de hidróxido de sódio (50mM). A mistura foi agitada vigorosamente em vórtex, acrescida de 240µL de óleo mineral para evitar evaporação e submetida à ebulição em banho-maria por 10 minutos. A seguir, o lisado foi neutralizado com 20µL de Tris-HCl (1M/pH 8,0), agitado e centrifugado rapidamente. A camada intermediária foi coletada, diluída na proporção de 1:10 em água milli-q estéril e armazenada a -20ºC ) Amplificação do kdna do T. cruzi Para a amplificação do kdna do parasito foi utilizado o protocolo de Gomes et al., (1998), com ligeiras modificações. A mistura da reação foi preparada contendo 32

53 Animais, material e métodos 0,1% de Triton X-100 (Tampão 10x, Invitrogen São Paulo, SP, Brasil); 75mM de cloreto de potássio (KCl - Tampão 10x, Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil); 3,5mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil); 0,2mM de cada deoxinucleotídeo (datp, dctp, dgtp, dttp Sigma, St. Louis, MO, EUA); 0,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil); 10pmoles de cada iniciador S35 (5 AAATAATGTACGGGKGAGATGCATGA3 ) e S36 (5 GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA3 ), descritos por Ávila et al., (1991) e sintetizados pela Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil. Foram aplicados 2,0µL de amostra extraída de tecido suficiente para 11µL. A mistura foi coberta com 20µL de óleo mineral para evitar evaporação e a amplificação foi processada em um termociclador automático (MinCycler TM ) nas seguintes condições: uma etapa inicial de desnaturação do DNA a 95 C por 5min, seguida de 35 ciclos de amplificação constituídos de um passo de desnaturação a 95ºC por 1min, um de anelamento a 65 C por 1min e um de extensão a 72 C por 1min, finalizando com uma etapa de extensão a 72ºC por 10min ) Visualização dos produtos da PCR O DNA amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e revelado com NaOH e formaldeído após a coloração pela prata (Santos et al., 1993). 5.7) Determinação do perfil de LSSP-PCR dos oito clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais Inicialmente foram determinados os perfis de assinaturas gênicas (LSSP-PCR) dos oito clones de T. cruzi utilizados nesse estudo a fim de verificar se os perfis seriam polimórficos o suficiente para identificar os clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com as diferentes misturas. Para isso, o clone presente nos tecidos de animais infectados com cada um dos oito clones e positivos para o kdna do T. cruzi foram caracterizados pela técnica de LSSP-PCR. 33

54 Animais, material e métodos 5.7.1) Caracterização genética por LSSP-PCR Amostras de órgãos/tecidos de camundongos positivas para o fragmento de 330pb do minicírculo do kdna do T. cruzi foram analisadas pela técnica de LSSP-PCR segundo o protocolo de Vago et al., (1996). Sabendo que a reação de LSSP-PCR ocorre em condições de baixa estringência e especificidade e que a presença de qualquer DNA contaminante impede a reprodutibilidade dessa técnica, todos os procedimentos empregados durante sua execução foram realizados em condições de preveni-la. A obtenção das assinaturas gênicas do kdna pela técnica de LSSP-PCR foi realizada em duas etapas: a primeira consistiu na amplificação específica do kdna do T. cruzi, descrito anteriormente. Em seguida, os produtos foram revelados em gel de agarose 1,5% (1,0% agarose, 0,5% agarose low melting point - Invitrogen) e corados por brometo de etídio. Os fragmentos de 330pb visualizados pela radiação ultravioleta foram removidos do gel com o auxílio de um pipetador de plástico. Após aquecimento em banho-maria, esses fragmentos foram homogeneizados, diluídos em água Milli-Q estéril na proporção de 1:10 e utilizados em um segundo passo de amplificação. Nas reações de LSSP-PCR as amostras de DNA foram re-amplificadas utilizando um único iniciador específico (correspondente ao iniciador S35), denominado S35G* (5 -AAA TAA TGT ACG GGG GAG AT-3 ). A mistura da reação totalizou um volume final de 10 µl, contendo 6,38 µl de água milli-q estéril, 2,0 µl de tampão de amostra, 0,2 µl de cada desoxinucleotídeo (datp, dctp, dgtp, dttp Sigma, St. Louis, MO, EUA), 0,1 µl do iniciador S35G* (450µM) e 0,32 µl de Taq DNA polimerase (Go Taq- Promega). Nessa mistura foi acrescentado 1µL do DNA diluído na proporção 1:10. A amplificação ocorreu nas seguintes condições: uma etapa inicial de desnaturação do DNA a 95 C por 5min, anelamento a 30º por 1 minuto, extensão a 72º por 1 minuto, seguida de 40 ciclos de amplificação constituídos de um passo de desnaturação a 94ºC por 1min, um de anelamento a 30 C por 1min, finalizado com uma etapa de extensão a 72ºC por 10min. 34

55 Animais, material e métodos Os produtos da reação de LSSP-PCR foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e revelados com NaOH e formaldeído após a coloração pela prata (Santos et al., 1993). 5.8) Avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR para detecção dos clones de T. cruzi nos tecidos de animais com infecções mistas Para verificar a sensibilidade da técnica de LSSP-PCR em detectar os clones de T. cruzi presentes nas misturas, inicialmente foram realizadas misturas teóricas de DNA dos clones pertencentes aos genótipos principais em diferentes proporções. Esta avaliação objetivou verificar qual a concentração/proporção mínima de kdna de cada clone a ser pesquisado seria possível de ser detectado nos tecidos de animais infectados com as diferentes misturas. Para isso, foi utilizada uma solução original de DNA na concentração de 1ng/µL de cada clone. A Tabela III mostra a proporção dos clones utilizados nas misturas teóricas avaliadas. Tabela III: Misturas teóricas de clones de Trypanosoma cruzi pertencentes às diferentes misturas utilizadas na avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR. Clones Misturas teóricas (Porcentagem de A:B) A B ) Identificação das populações do T. cruzi presentes nos tecidos de camundongos com infecções mistas não tratados e tratados com benzonidazol pela técnica de LSSP-PCR A identificação do(s) clone(s) de T. cruzi pela técnica de LSSP-PCR foi realizada nos tecidos dos animais infectados com as 24 misturas clonais (Tabela IV) 35

56 Animais, material e métodos não tratados (INT) e tratados (IT) com BZ, que apresentaram positividade para o kdna do T. cruzi. Tabela IV: Misturas de clones do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais utilizados na infecção de camundongos BALB/c combinados segundo o padrão de virulência e susceptibilidade ao benzonidazol não tratados e tratados com este fármaco. Misturas de clones Misturas de genótipos + Virulento + Virulento - Virulento - Virulento + Virulento - Virulento - Virulento +Virulento Gamba cl1+ P209 cl1 OPS21 cl11+ Cuica cl1 Gamba cl1+ Cuica cl1 OPS21 cl11+ P209 cl Gamba cl1+ IVV cl4 OPS21 cl11+ MAS cl1 Gamba cl1+ MAS cl1 OPS21 cl11+ IVV cl Gamba cl1+ Bug2148 cl1 OPS21 cl11+ SO3 cl5 Gamba cl1 + SO3 cl5 OPS21 cl11+ Bug2148 cl P209 cl1+ IVV cl4 Cuica cl1+ MAS cl1 P209 cl1 + MAS cl1 Cuica cl1 + IVV cl P209 cl1+ Bug2148 cl1 Cuica cl1+ SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + Bug2148 cl IVV cl4+ Bug2148 cl1 MAS cl1+ SO3 cl5 IVV cl4 + SO3 cl5 MAS cl1 + Bug2148 cl1 Em vermelho são as misturas de clones de T. cruzi que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol (TNC) em relação às infecções monoclonais correspondentes; em azul são as misturas de clones em animais considerados curados (TC) pelo critério de cura empregado (ESF, Hc, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) e que apresentaram PCR em tecido positiva; e em negrito são as misturas que apresentaram simultaneamente as características dos dois grupos anteriores [animais considerados curados (TC) pelo critério de cura (ESF, Hc, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) com PCR em tecido positiva e que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol em relação ao observado nas infecções monoclonais] e em verde são as misturas cuja caracterização molecular dos isolados remanescentes no sangue por isoenzimas e microssatélites demonstrou predominantemente o clone mais susceptível ao benzonidazol baseado nas infecções monoclonais. 36

57 Animais, material e métodos Os animais foram agrupados da seguinte maneira: (i) aqueles infectados com as misturas (5/24), previamente avaliadas por Martins et al., (2008) que apresentaram quando tratados, alteração no perfil de susceptibilidade ao BZ em relação ao esperado baseado nas respectivas infecções monoclonais [10 não tratados (INT) e 10 tratados (IT) com benzonidazol]. Essas misturas estão assinaladas em vermelho na Tabela IV. (ii) aqueles animais infectados com as misturas (5/24) que apresentaram PCR em tecido positiva para o kdna do T. cruzi e foram considerados curados pelo critério de cura empregado (ESF, Hc, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) por Martins et al., (2008) - [10 não tratados (INT) e 7 tratados com BZ (TC)]. Essas misturas estão assinaladas em azul na Tabela IV. (iii) animais infectados com as misturas (4/24) que apresentaram simultaneamente as características descritas em (i) e (ii) 8 animais não tratados (INT) e 5 tratados (TC) com BZ. Essas misturas estão assinaladas em negrito na Tabela IV. (iv) animais com (3/24) misturas cuja caracterização molecular dos isolados remanescentes no sangue por isoenzimas e microssatélites demonstrou predominantemente o clone mais susceptível ao BZ baseado nas infecções monoclonais - 6 animais não tratados (INT) e 6 tratados (IT) com BZ. Essas misturas estão assinaladas em verde na Tabela IV. v) animais infectados com as misturas (7/24) que não apresentaram nenhuma das características descrita acima - 14 animais não tratados (INT) e 14 tratados (IT) com benzonidazol. Essas misturas estão assinaladas em letra normal na Tabela IV. 37

58 6.0) Resultados

59 Resultados Os resultados obtidos nesse trabalho estão apresentados conforme o Organograma apresentado a seguir: Positividade da PCR em tecidos de animais com infecção monoclonal não tratados (INT) e tratados (IT) com BZ Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de T. cruzi em animais com infecção mista e monoclonal e caracterização molecular por LSSP-PCR dos clones nos tecidos de animais com infecção mista não tratados (INT) e tratados (IT) com BZ Com especial interesse (1) nos tecidos de animais com infecção mista onde a PCR revelou mudança de tropismo do parasito em relação às infecções monoclonais. (2) nos tecidos de animais com infecção mista que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao BZ (Martins et al., 2007) (3) nos tecidos de animais com infecção mista considerados curados (TC) pelo critério de cura utilizado (Martins et al., 2007) 39

60 Resultados 6.1) Positividade da PCR em tecidos de animais com infecção monoclonal por clones de T. cruzi não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol (BZ) agrupados de acordo com os genótipos principais Ao considerar o agrupamento dos genótipos principais do T. cruzi, as taxas de positividade da PCR de animais não tratados (INT) e tratados (IT) com BZ variaram de acordo com os diferentes tecidos avaliados. No grupo dos animais não tratados (INT) a maior freqüência de positividade da PCR foi observada no coração (100%), sendo essa significativamente maior do que a observada nos demais tecidos. O músculo esquelético foi o segundo órgão com maior taxa de positividade (81%), sendo significativamente superior a observada na bexiga e no cérebro (38%). O cólon apresentou taxa de positivida de (75%) e o baço (69%), significavemente maiores do que a do cérebro. No grupo dos animais tratados (IT) maior freqüência de positividade da PCR foi observada no músculo esquelético (81%), bexiga e cólon (69% para cada), coração (62%), cérebro (25%) e baço (19%) - Figura 1. Diferenças signficativas não foram observadas entre as taxas de positividade da PCR no músculo esquelético, bexiga, cólon e coração e entre o cérebro e o baço. Figura 1: Positividade global da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos de animais na fase crônica da infecção não tratados (IT, n= 16) e tratados com benzonidazol (INT, n= 16). 40

61 Resultados Comparando os grupos de animais INT e IT foi observada uma diminuição significativa da positividade da PCR após o tratamento no coração (100% para 62,5%) e baço (69% para 19%). Taxas de positividade da PCR semelhantes foram observadas para o músculo esquelético, cólon e cérebro. Entretanto, nos animais tratados (IT) a bexiga apresentou taxa de positividade para o kdna do T. cruzi significativamente superior ao grupo de animais INT (44% para 69%) - Figura 1. Quando os resultados foram analisados considerando os genótipos principais do T. cruzi, foi verificado que no grupo de animais não tratados (INT) foram observadas taxas de positividade global de 75% nos animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 19 e 20, 62% nos animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 39 e 58% naqueles infectados com o genótipo 32 (Figura 2). Diferenças significativas não foram observadas entre nenhum dos genótipos. Figura 2: Positividade global da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos de animais com infecções monoclonais pelos genótipos principais desse parasito não tratados (INT, n= 16) e tratados com benzonidazol (IT, n=16) na fase crônica da infecção. Nos animais tratados (IT), foram observados resultados semelhantes, sendo as maiores taxas de positividade observadas nos camundongos infectados com clones pertencentes aos genótipos 19 (71%) e 20 (67%) e, menores taxas nos animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 39 (50%) e 32 (29%). Diferenças estatísticas foram observadas entre os genótipos 19 e 20 com o genótipo 32 (Figura 2). 41

62 Resultados Animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 19 e não tratados (INT) apresentaram uma alta positividade da PCR na maioria dos tecidos avaliados. Entretanto, as taxas de positividade foram signficativamente maiores no coração e baço (100% para cada), seguidos do músculo esquelético e cólon (75% para cada) e da bexiga e do cérebro com taxas de 50% (Figura 3). Figura 3: Positividade da PCR para o kdna do Trypanosoma cruzi em diferentes tecidos na fase crônica da infecção de animais com infecção monoclonal por clones pertencentes aos genótipos principais, não tratados (INT, n=16) e tratados (IT, n=16) com benzonidazol. Os animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 19 e submetidos ao tratamento (IT) apresentaram uma redução significativa na positividade da PCR no baço (100% para 0%) e no cérebro (50% para 25%). Entretanto, após o tratamento a positividade da PCR aumentou significativamente na bexiga (50% para 100%), músculo esquelético (75% para 100%) e cólon (75% para 100%). No coração não foi observada alteração na taxa de positividade da PCR para o kdna do T. cruzi após o tratametno (100% para ambos os grupos - INT e IT) - Figura 3. Ao analisar os tecidos de animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 20 e não tratados (INT) também pode ser observada uma alta taxa de positividade da PCR na maioria dos tecidos analisados. Nesse genótipo, taxas de positividade significativamente maiores também foram observadas no coração, músculo esquelético e cérebro (100% para cada), seguidas da bexiga (75%), baço (50%) e cólon (25%) - Figura 3. Animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 20 e tratados (IT) com BZ apresentaram uma redução signficativa na positividade da PCR no coração (100% para 50%) e cérebro (100% para 50%). O tratamento não alterou a taxa 42

63 Resultados de positividade no músculo esquelético (100%), baço (50%) e bexiga (75%). Um aumento significativo na taxa de positividade foi observado apenas no cólon dos animais tratados (25% para 75%) em relação aos não tratados (INT) - Figura 3. Animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 39 e não tratados (INT) apresentaram taxa de positividade global da PCR em tecido intermediária em comparação com os animais infectados com clones pertencentes aos demais genótipos 19/20 e 32. As maiores taxas de positividade foram observadas no coração, músculo esquelético e cólon (100% para cada), seguido do baço (50%) e bexiga (25%). Nesse grupo de animais o cérebro não apresentou positividade para o kdna do T. cruzi (Figura 3). Os animais infectados com esse mesmo genótipo e tratados (IT) com BZ apresentaram redução significativa na positividade da PCR na maioria dos tecidos avaliados: músculo esquelético (100% para 75%) e cólon (100% para 50%) e no baço (50% para 25%). Novamente, no grupo de animais tratados (IT), a bexiga apresentou um aumento na positividade da PCR em relação aos animais não tratados INT (25% para 50%). Não foi observada alteração na taxa de positividade da PCR no coração (100%) e no cérebro (0%) - Figura 3. Animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 32 e que não foram submetidos ao tratamento (INT) apresentaram a menor taxa global de positividade da PCR em comparação com os demais genótipos. Taxas de positividade da PCR foram significativamentes maiores no coração e cólon (100% em cada), seguidas do baço (75%), músculo esquelético (50%) e bexiga (25%). Assim como foi observado para os animais infectados com o genótipo 39, o cérebro foi o único tecido que não apresentou positividade na PCR (Figura 3). Animais infectados com clones pertencentes ao genótipo 32 e submetidos ao tratamento (IT) apresentaram redução signficativa na positividade da PCR no coração (100% para 0%), baço (75% para 0%) e cólon (100% para 50%). Entretanto, após o tratamento foi observado um aumento na positividade da PCR na bexiga (25% para 50%) e também um aumento signficativo no cérebro (0% para 25%) dos animais infectados por esse genótipo - Figura 3. Em geral, no grupo dos animais INT, foi observada diferença nas taxas de positividade na PCR para os clones pertencentes a todos os genótipos na maioria dos tecidos avaliados, exceto no coração. O kdna dos clones de T. cruzi foram encontrados 43

64 Resultados em todos os tecidos os quais apresentaram diferentes taxas de positividade. A exceção foi observada no cérebro dos animais infectados com clones pertencentes aos genótipos 39 e 32 que não apresentaram positividade. Os clones pertencentes ao genótipo 19 e 20 apresentaram as maiores taxas de positividade na bexiga e foram os únicos que apresentaram positividade no cérebro. Além disso, o genótipo 20 apresentou taxas de positividade mais elevadas ou semelhantes aos demais genótipos, exceto no cólon e baço. Nos animais IT, todos os clones pertencentes aos genótipos principais foram encontrados na maioria dos tecidos avaliados. A exceção foi o baço onde não foi verificada a presença de kdna dos clones pertencentes ao genótipo 19 e 32, o coração que não foi encontrado os clones pertencentes ao genótipo 32 e o cérebro onde não foi encontrado kdna dos clones pertencentes ao genótipo ) Determinação do perfil de LSSP-PCR dos oito clones de T. cruzi pertencentes aos genótipos principais Inicialmente, foi determinado o perfil genético dos oito clones utilizados nesse estudo através da técnica de LSSP-PCR a fim de verificar se os perfis seriam polimórficos o suficiente para identificar os clones nas 24 combinações avaliadas. Os resultados demonstraram que essa metodologia foi capaz de diferenciar os perfis de clones pertencentes aos genótipos principais do T. cruzi e inclusive dos clones pertencentes a um mesmo grupo genético. Os perfis representativos dos oito clones de referência estão demonstrados na Figura 4. 44

65 Resultados PM P209 cl1 Cuica cl1 Gamba cl1 OPS21 cl11 Bug2148 cl1 SO3 cl5 IVV cl4 MAS Figura 4: Perfis de LSSP-PCR representativos dos oito clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais (19, 20, 39 e 32) revelados em gel de poliacrilamida 6% e corados pela prata. PM: Padrão de peso molecular 100pb; clones P209 cl1 e Cuica cl1 (genótipo 20, T. cruzi I), clones Gamba cl1 e OPS21 cl11 (genótipo 19, T. cruzi I), clones Bug2148 cl1 e SO3 cl5 (genótipo 39, T. cruzi) e clones IVV cl4 e MAS cl1 (genótipo 32, T. cruzi II) ) Avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR para detecção dos clones de T. cruzi em infecções mistas A avaliação da sensibilidade da técnica de LSSP-PCR demonstrou que ambos os isolados foram detectados em todas as misturas teóricas, o que confirma a sensibilidade desta metodologia em demonstrar a presença dos dois clones mesmo quando algum deles estiver em menor proporção (Figura 5) Figura 5: Perfis de LSSP-PCR obtidos a partir de misturas teóricas de DNA do Trypanosoma cruzi (A+B), revelados em gel de poliacrilamida 6% e corados pela prata. Canaleta 1: PM: padrão de peso molecular 100pb; 2: DNA de referência do clone Gamba cl1 (100%); 3: mistura dos clones Gamba cl1 + IVV cl4 (75% + 25%); 4: mistura dos clones Gamba cl1 + IVV cl4 (50% + 50%); 5: mistura dos clones IVV cl4 + Gamba cl1 (75% + 25%); 6: DNA de referência do clone IVV cl4 (100%). 45

66 Resultados 6.3) Comparação pela técnica de PCR do tropismo tecidual de clones de T. cruzi em camundongos com infecções monoclonais e mistas submetidos ou não ao tratamento com BZ e identificação dos clones presentes nos tecidos por LSSP-PCR Os resultados de PCR em tecido serão apresentados segundo as combinações genotípicas: 19+20, 19+32, 19+39, 20+32, 20+39, e avaliados comparativamente com as suas respectivas infecções monoclonais. A Tabela V apresenta os tecidos onde foi encontrada diferença na distribuição tecidual do kdna do T. cruzi e estes resultados estão apresentados detalhadamente nos itens a Todos os resultados serão apresentados de forma descritiva e avaliados qualitativamente, uma vez que o reduzido número de animais analisados nas diferentes misturas de cada uma das combinações genotípicas (n=2) não permitiria a realização de análise estatística adequada. 46

67 Resultados Tabela V: Alteração na distribuição tecidual de clones do Trypanosoma cruzi em camundongos BALB/c com infecções mistas pertencentes aos genótipos principais avaliados pela técnica de PCR. Misturas de genótipos Misturas clonais Animais INT Tecidos (alteração) Animais IT Gamba cl1 + P209 cl Gamba cl1 + Cuica cl OPS21 cl11 + P209 cl OPS21 cl11 + Cuica cl Gamba cl1 + IVV cl4 Em negrito estão representados os tecidos de camundongos com misturas clonais de Trypanosoma cruzi pertencentes aos diferentes genótipos principais de Tibayrenc & Ayala, (1988) que apresentaram positividade na PCR. Em letra normal estão representados os tecidos que apresentaram PCR negativa. 47 Bexiga, cérebro e cólon Cólon Baço Cérebro Baço, Bexiga e cérebro Baço e cérebro Cólon Músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon Cérebro Coração, músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon Gamba cl1 + MAS cl1 Bexiga e cérebro Baço e cérebro OPS21 cl11 + IVV cl4 Baço e bexiga OPS21 cl11 + MAS cl1 Bexiga, cérebro e cólon Cérebro e cólon Gamba cl1 + Bug2148 cl OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 Músculo, baço, bexiga e cérebro Coração, músculo esquelético, baço e bexiga Baço Baço e cérebro Gamba cl1 + SO3 cl5 Bexiga e cérebro Cérebro OPS21 cl11 + SO3 cl P209 cl1 + IVV cl Cuica cl1 + IVV cl P209 cl1 + MAS cl Cuica cl1 + MAS cl1 Baço e cérebro Coração, músculo esquelético, baço e cérebro Bexiga, cérebro e cólon Bexiga, cérebro e cólon Cérebro Baço Cérebro e cólon Baço e cérebro Coração, baço, cérebro e cólon Não alterou Coração e cérebro P209 cl1 + Bug2148 cl1 Coração e baço Cérebro Cuica cl1 + Bug2148 cl P209 cl1 + SO3 cl Cuica cl1 + SO3 cl Bug2148 cl1 + IVV cl SO3 cl5 + IVV cl4 cl Bug2148 cl1 + MAS cl SO3 cl5 + MAS cl1 Baço, bexiga, cérebro e cólon Não alterou Não alterou Baço e cólon Músculo esquelético e baço Coração, baço e bexiga Coração, músculo esquelético e cólon Não alterou Coração, músculo esquelético, bexiga e cérebro Não alterou Baço, bexiga, cérebro e cólon Cérebro e cólon Baço Músculo esquelético

68 Resultados 6.3.1) Avaliação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica Ao comparar a positividade da PCR nos tecidos de animais infectados com a combinação genotípica com a de suas respectivas infecções monoclonais foi observada alteração no tropismo dos clones em pelo menos um dos tecidos avaliados em todas as misturas, nos animais não tratados (INT) e tratados (IT). Esses resultados estão ilustrados na Figura 6 e descritos detalhadamente. 48

69 Resultados A B C D Figura 6: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 49

70 Resultados No grupo dos animais não tratados (INT), a bexiga, o cérebro e o cólon dos camundongos infectados com a mistura Gamba cl1 + P209 cl1 e o cólon dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + Cuica cl1 apresentaram PCR negativa em comparação com as infecções monoclonais (Figura 6A, 6B). O mesmo foi observado no músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + Cuica cl1 e no baço, bexiga e cérebro dos camundongos infectados com a mistura OPS21 cl11 + P209 cl1 (Figura 6C e 6D). Nos animais tratados (IT), o cérebro dos camundongos infectados com a mistura OPS21 cl11 + Cuica cl1, Gamba cl1 + Cuica cl1 e OPS21 cl11 + P209 cl1 foi o único órgão que apresentou PCR negativa em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 6B, 6C e 6D). Entretanto, o baço dos camundongos infectados com a mistura de clones Gamba cl1 + P209 cl1 e OPS21 cl11 + P209 cl1 foi o único órgão que apresentou PCR positiva em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 6A e 6D). A caracterização por LSSP-PCR dos clones remanescentes no baço dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + P209 cl1 demonstrou a presença do clone P209 cl1 (genótipo 20), 100% resistente ao BZ (Tabela VI). Entretanto, foi observada alteração no tropismo tecidual do kdna do clone P209 cl1 nos animais com infecção mista e tratados (IT) em comparação com os animais com infecção monoclonal nos quais não foi detectada a presença do kdna desse clone nesse tecido (Tabela VI e Figura 6A). 50

71 Resultados Tabela VI: Identificação de clones de Trypanosoma cruzi por LSSP-PCR provenientes de tecidos de camundongos BALB/c infectados com misturas de clones e que apresentaram positividade na PCR quando comparado com as suas respectivas infecções monoclonais. Misturas de genótipos Misturas clonais Tecidos/Grupo de animais Clone de T. cruzi Gamba cl1 + P209 cl1 Baço/IT P209 cl OPS21 cl11 + P209 cl1 Baço/IT OPS21 cl Gamba cl1 + IVV cl4 Baço/IT OPS21 cl11 + MAS cl1 Cérebro/INT OPS21 cl11 + MAS cl OPS21 cl11 + IVV cl4 Baço/IT Gamba cl1 + MAS cl1 Bexiga/INT Gamba cl1 Baço/IT Gamba cl Gamba cl1 + Bug2148 cl1 Baço/IT - Cérebro/IT OPS21 cl11 + SO3 cl5 Cérebro /INT OPS21 cl11 + SO3 cl OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 Baço/IT OPS21 cl Gamba cl1 + SO3 cl5 Bexiga/INT Gamba cl1 Cérebro/IT Gamba cl P209 cl1 + IVV cl4 Baço/IT - Cérebro/IT P209 cl Cuica cl1 + MAS cl1 Coração/IT Cuica cl Cuica cl1 + IVV cl4 Coração/IT Cuica cl P209 cl1 + Bug2148 cl1 Baço/INT - Cérebro/IT P209 cl1 + SO3 cl5 Cérebro/IT P209 cl Bug2148 cl1 + IVV cl4 Baço/IT - Bexiga/IT - Cérebro/IT Bug2148 cl SO3 cl5 + IVV cl4 Cólon/IT indeterminado Cérebro/IT indeterminado Bug2148 cl1 + MAS cl1 Baço/IT Bug2148 cl1 Em negrito estão os genótipos e clones do T. cruzi resistentes ao benzonidazol; em vermelho estão os genótipos e clones do T. cruzi parcialmente susceptíveis ao benzonidazol e em letra normal estão os genótipos e clones do T. cruzi susceptíveis ao benzonidazol. (-) representa combinações que não foi possível fazer a identificação do clone presente no tecido. 51

72 Resultados A caracterização dos clones remanescentes no baço dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + P209 cl1 (100% susceptível + 0% susceptível), revelou a presença do OPS21 cl11, ou seja, do clone mais susceptível ao tratamento da mistura (Tabela VI). Além disso, foi observada alteração no tropismo tecidual do clone OPS21 cl11 nos animais com infecção mista e submetidos ao tratamento em comparação com os animais com infecção monoclonal em que não foi detectada a presença desse clone nesse tecido (Figura 6D). O perfil de LSSP-PCR obtido do clone remanescente nos tecidos de animais infectados com as misturas Gamba cl1 + P209 cl1 e OPS21 cl11 + P209 cl1 e submetidos ao tratamento está representado na Figura 7. IT1 IT2 IT3 IT4 IT5 Gamba cl1 P209 cl1 OPS21 cl11 Figura 7: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos na identificação de clones remanescentes nos tecidos de animais tratados e infectados com as misturas Gamba cl1 + P209 cl1: IT1 e IT2 e OPS21 cl11 + P209 cl1: IT3-IT5. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica A comparação entre a positividade da PCR nos tecidos de animais infectados com a combinação genotípica com a observada nas respectivas infecções monoclonais revelou que todas as misturas apresentaram alteração no tropismo tecidual em pelo menos um dos tecidos obtidos dos animais não tratados (INT) ou tratados (IT) com benzonidazol (Figura 8). 52

73 Resultados A B C D Figura 8: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 53

74 Resultados No grupo dos animais não tratados (INT) infectados com a mistura Gamba cl1 + IVV cl4, ao contrário do esperado considerando os resultados observados nas infecções monoclonais, a maioria dos tecidos (exceto o coração) apresentou PCR negativa (Figura 8A). Resultados semelhantes foram observados na bexiga e no cólon dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 (Figura 8B); no baço e na bexiga dos camundongos infectados com a mistura OPS21 cl11 + IVV cl4 (Figura 8C) e no cérebro dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 (Figura 8D). Entretanto, o cérebro dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 e a bexiga dos camundongos infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 foram os únicos órgãos que apresentaram PCR positiva em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 8B e 8D). O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones presentes no cérebro dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 e não tratados (INT) demonstrou a mistura de ambos os clones (Tabela VI). Foi observada alteração no tropismo tecidual do clone OPS21 cl11 e MAS cl1, ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 8B). O perfil de LSSP-PCR encontrado na identificação dos clones presentes no cérebro desses animais está representado na Figura 9. INT1 INT2 OPS21 cl11 MAS cl1 Figura 9: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 não tratados com benzonidazol. INT: clones presentes em tecidos de animais não tratados com benzonidazol. 54

75 Resultados A caracterização por LSSP-PCR dos clones presentes na bexiga dos animais não tratados e infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 revelou a presença do clone Gamba cl1, pertencente ao genótipo 19 (Tabela VI), diferentemente do observado nos animais com infecções monoclonais correspondentes (Figura 8D). O perfil de LSSP- PCR obtido na identificação dos clones presentes na bexiga desses animais está representado na Figura 10. INT 1 INT 2 IT1 IT2 Gamba cl1 MAS cl1 Figura 10: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 não tratados e tratados com benzonidazol. INT: clones presentes em tecidos de animais não tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol. Nos animais tratados (IT), a maioria dos tecidos, exceto o baço, dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + IVV cl4 apresentou PCR negativa em comparação com as infecções monoclonais (Figura 8A). Resultado semelhante foi observado no cérebro e cólon dos animais infectados as misturas OPS21 cl11 + MAS cl1 e no cérebro dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 (Figura 8B e 8D). Entretanto, apenas o baço dos animais infectados com as misturas Gamba cl1 + IVV cl4, OPS21 cl11 + IVV cl4 e Gamba cl1 + MAS cl1 apresentou PCR positiva ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 8A, 8C e 8D). Não foi possível fazer a caracterização dos clones presentes no baço dos animais infectados com as misturas Gamba cl1 + IVV cl4 e OPS21 cl11 + IVV cl4 (Tabela VI). 55

76 Resultados A caracterização dos clones remanescentes no baço dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 (40% susceptível + 100% susceptível) e tratados demonstrou a presença do clone Gamba cl1, mais resistente ao tratamento da mistura (Tabela VI) e revelou alteração no tropismo tecidual desse clone nos animais infectados com essa mistura em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 8D). O perfil de LSSP-PCR obtido do clone presente nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 tratados com BZ está representado na Figura ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica Ao comparar a positividade da PCR nos tecidos de animais infectados com a combinação genotípica com suas respectivas infecções monoclonais foi observado que todas as misturas apresentaram alteração no tropismo tecidual em pelo menos um dos tecidos avaliados nos animais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol (Figura 11). 56

77 Resultados A B C D Figura 11: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 57

78 Resultados No grupo dos animais não tratados (INT), o músculo, o baço, a bexiga e o cérebro dos camundongos infectados com a mistura Gamba cl1 + Bug2148 cl1 e o baço dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 apresentaram PCR negativa em comparação com as infecções monoclonais (Figura 11A e 11B). O mesmo foi observado no coração, músculo esquelético, no baço e na bexiga dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 e no cérebro dos camundongos infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5 (Figura 11C e 11D). Entretanto, o cérebro dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 e a bexiga dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5 apresentaram PCR positiva em comparação com o observado nos animais com infecção monoclonal (Figura 11B e 11D). O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones remanescentes no cérebro dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 demonstrou a presença de ambos os clones (Tabela VI), ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal por esses mesmos clones (Figura 11B). A caracterização pela técnica de LSSP-PCR dos clones presentes na bexiga dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5 e não tratados revelou a presença do clone Gamba cl1 (Tabela VI), pertencente ao genótipo 19, enquanto nas respectivas infecções monoclonais não foi observada a presença desse clone (Figura 11D). No grupo dos animais tratados (IT), o cérebro e o cólon dos camundongos infectados com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 apresentaram PCR negativa ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 11B). Entretanto, o baço e o cérebro dos animais infectados com a mistura de clones Gamba cl1 + Bug2148 cl1 e o baço dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 apresentaram PCR positiva em comparação com as infecções monoclonais (Figura 11A e 11C). Resultado semelhante foi observado no cérebro dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5, que apresentou PCR positiva, ao contrário das infecções monoclonais (Figura 11D). 58

79 Resultados Não foi possível fazer a caracterização dos clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos dos animais infectados com a mistura Gamba cl1 + Bug2148 cl1, pois essas amostras apresentaram a banda de 330pb muito fraca (Tabela VI). A identificação do clones remanescente no baço dos animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 demonstrou a presença do clone OPS21 cl11 (pertencente ao genótipo 19) e 100% susceptível ao benzonidazol (Tabela VI), ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal (Figura 11C). Semelhante ao observado nos animais não tratados, a caracterização do clone remanescente no cérebro dos camundongos infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5 (40% susceptível + 100% susceptível ao benzonidazol) e tratados revelou a presença do clone Gamba cl1, mais resistente da mistura (Tabela VI). Foi observada alteração no tropismo tecidual desse clone nos animais com infecção mista em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 11D) ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna do T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica Ao comparar a positividade da PCR nos tecidos de animais infectados com a combinação genotípica com suas respectivas infecções monoclonais foi observado que todas as misturas apresentaram alteração no tropismo tecidual em pelo menos um dos tecidos avaliados tanto nos animais não tratados (INT) como nos tratados (IT) com BZ (Figura 12). 59

80 Resultados A B C D Figura 12: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 60

81 Resultados No grupo de animais não tratados (INT), ao contrário do esperado observado nas infecções monoclonais correspondentes, foi verificada ausência de positividade na PCR na maioria dos tecidos de camundongos infectados com a mistura P209 cl1 + IVV cl4, exceto na bexiga e no cólon (Figura 12A). Resultado semelhante foi observado no cérebro dos animais infectados com a mistura Cuica cl1 + MAS cl1 (Figura 12B). A bexiga, o cérebro e o cólon dos animais infectados com as misturas Cuica cl1 + IVV cl4 e P209 cl1 + MAS cl1 também apresentaram PCR negativa em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 12C e 12D). No grupo de animais tratados (IT), ausência de positividade na PCR foi observada no cérebro dos animais infectados com a mistura Cuica cl1 + MAS cl1, ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 12B). Resultado semelhante foi observado no baço, cérebro e cólon dos camundongos infectados com a mistura Cuica cl1 + IVV cl4 (Figura 12C). Os animais infectados com a mistura P209 cl1 + MAS cl1 e tratados não apresentaram alteração na positividade da PCR em nenhum dos seis tecidos avaliados comparando com os resultados observados nas infecções monoclonais (Figura 12D). O baço e o cérebro dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + IVV cl4 apresentaram PCR positiva (Figura 12A). O mesmo foi observado no coração dos animais infectados com as misturas Cuica cl1 + MAS cl1 e Cuica cl1 + IVV cl4 (Figura 12B e 12C). A caracterização por LSSP-PCR do clone remanescente no cérebro dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + IVV cl4 revelou a presença do clone P209 cl1 (genótipo 20) e 100% resistente ao benzonidazol (Tabela VI). Foi observada alteração no tropismo tecidual desse clone nos animais com infecção mista em comparação com o observado nas infecções monoclonais (Figura 12A). Não foi possível fazer a caracterização do clone remanescente no baço desses animais (Tabela VI). A caracterização dos clones remanescentes no coração dos animais infectados com as misturas Cuica cl1 + MAS cl1 e Cuica cl1 + IVV cl4 e submetidos ao tratamento demonstrou a presença do clone Cuica cl1 (genótipo 20 e 100% resistente ao benzonidazol), ao contrário do observado nas infecções monoclonais - Tabela VI e Figura 12B e 12C. O perfil de LSSP-PCR representativo obtido do clone remanescente nos tecidos de animais infectados com essas misturas está representado na Figura

82 Resultados IT1 IT2 IT3 Cuica cl1 IVV cl4 MAS cl1 Figura 13: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica Na combinação genotípica foram observadas alterações no tropismo tecidual dos clones comparativamente às respectivas infecções monoclonais nas misturas P209 cl1 + Bug2148 cl1 e Cuica cl1 + Bug2148 cl1 nos animais não tratados (INT) - (Figura 14A e 14C) e nas misturas P209 cl1 + Bug2148 cl1 e P209 cl1 + SO3 cl5 nos animais tratados (IT) com benzonidazol (Figura 14A e 14D). Os animais infectados com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5 não apresentaram alteração na positividade da PCR em nenhum dos tecidos avaliados em ambos os grupos de animais (Figura 14B). 62

83 Resultados A B C D Figura 14: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 63

84 Resultados No grupo dos animais não tratados (INT), o coração dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + Bug2148 cl1 e o baço, a bexiga, o cérebro e o cólon dos animais infectados com a mistura Cuica cl1 + Bug2148 cl1 apresentaram PCR negativa em comparação com as suas infecções monoclonais (Figura 14A e 14C). Entretanto, o baço dos camundongos infectados com a mistura P209 cl1 + Bug2148 cl1 apresentou PCR positiva, ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 14A). Entretanto, não foi possível fazer a caracterização dos clones presentes no baço desses animais (Tabela VI). No grupo dos animais tratados (IT) com benzonidazol, o coração, o músculo esquelético e a bexiga dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 apresentaram PCR negativa em comparação com as infecções monoclonais (Figura 14D). Por outro lado, o cérebro dos animais infectados com as misturas P209 cl1 + Bug2148 cl1 e P209 cl1 + SO3 cl5 apresentou PCR positiva ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 14A e 14D). Não foi possível fazer a caracterização do clone remanescente no cérebro dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + Bug2148 cl1 (Tabela VI). O perfil de LSSP-PCR obtido da caracterização do clone remanescente no cérebro dos animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 demonstrou a presença do clone P209 cl1, pertencente ao genótipo 20 e 100% resistente ao benzonidazol, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal (Tabela VI e Figura 14D). O perfil de LSSP-PCR representativo obtido do clone remanescente nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura

85 Resultados IT1 IT2 SO3 cl5 P209 cl1 Figura 15: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol ) Avaliação do tropismo tecidual do kdna de T. cruzi e identificação dos clones presentes em tecidos de animais infectados com a combinação genotípica Na combinação genotípica todas as misturas apresentaram alteração no tropismo tecidual em pelo menos um dos tecidos avaliados tanto nos grupos de animais não tratados (INT) como nos tratados (IT) com BZ quando comparados aos resultados esperados baseados nas respectivas infecções monoclonais (Figura 16). 65

86 Resultados A B C D Figura 16: Comparação do tropismo tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi em camundongos com infecções mistas pelos genótipos principais não tratados (INT) e tratados (IT) com benzonidazol com suas respectivas infecções monoclonais na fase crônica da infecção. 66

87 Resultados No grupo de animais não tratados (INT), o baço e o cólon dos camundongos infectados com a mistura Bug2148 cl1 + IVV cl4 e o coração, o músculo esquelético e o cólon dos animais infectados com a mistura SO3 cl5 + MAS cl1 apresentaram PCR negativa em comparação com as infecções monoclonais (Figura 16A e 16B). Resultados semelhantes foram observados no músculo esquelético e baço dos animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 e no coração, no baço e na bexiga dos camundongos infectados com a mistura Bug2148 cl1 + MAS cl1 (Figura 16C e 16D). No grupo dos animais tratados (IT) o cólon dos camundongos infectados com a mistura Bug2148 cl1 + IVV cl4 apresentou PCR negativa e o baço, a bexiga e o cérebro apresentaram PCR positiva em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 16A). O perfil obtido dos clones remanescentes no cérebro desses animais demonstrou a presença do clone Bug2148 cl1 (genótipo 39 e 100% resistente ao BZ) Tabela VI. Entretanto, não foi possível fazer a identificação do clone remanecente no baço e na bexiga desse mesmo animal (Tabela VI). Apenas o músculo esquelético dos animais infectados com a mistura SO3 cl5 + MAS cl1 apresentou alteração na positividade da PCR, sendo negativo ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Figura 16B). O cérebro e o cólon dos animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 apresentaram PCR positiva em comparação com os animais com infecção monoclonal. Resultado semelhante foi observado no baço dos camundongos infectados com a mistura Bug2148 cl1 + MAS cl1 (Figura 16C e 16D). A caracterização do clone remanescente no baço dos animais infectados com a mistura Bug2148 cl1 + MAS cl1 (0% susceptível + 100% susceptível ao BZ) revelou a presença do Bug2148cl1, ou seja, do clone mais resistente da mistura (Tabela VI). Entretanto, foi observada alteração no tropismo tecidual desse clone em comparação com os animais com infecção monoclonal (Figura 16D). A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes no cólon e cérebro dos animais infectados com a mistura dos clones SO3 cl5 + IVV cl4 (100% susceptível ao BZ) demonstrou um perfil genético distinto dos clones inoculados cuja identificação 67

88 Resultados não foi definida (Tabela VI). O perfil de LSSP-PCR obtido dessa caracterização está representado na Figura 17. IT1 IT2 IT3 IT4 SO3 cl5 IVV cl4 Figura 17: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos da identificação de clones remanesentes nos tecidos de animais infectados com a mistura SO3 cl5 + IVV cl4 tratados com benzonidazol. IT: clones remanescentes em tecidos de animais tratados com benzonidazol. Resumindo o conjunto de resultados comentados nos itens a verificou-se que, de uma maneira geral, a maioria das misturas, exceto Cuica cl1 + SO3 cl5 (20+39) apresentou alguma alteração na positividade da PCR em comparação com suas respectivas infecções monoclonais (Tabela V). A maioria dos tecidos de animais INT e IT com as diferentes combinações genotípicas apresentou PCR negativa em comparação com os animais com infecção monoclonal (Tabela V). Por outro lado, animais infectados com 18 misturas (18/24) apresentaram um ou mais tecidos que foram positivos na PCR, ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Tabela V). Nos animais infectados tratados (IT), o baço foi o tecido que mais apresentou alteração na distribuição do kdna do T. cruzi (47% de positividade da PCR), seguido do cérebro (33%), coração (9%), bexiga e cólon (4%) - (Dados calculados a partir da Tabela VI). Os tecidos de animais não tratados (INT) que mais apresentaram alteração na positividade da PCR foram a bexiga e o cérebro (40%), seguido do baço (20%) - (Dados calculados a partir da Tabela VI). 68

89 Resultados A identificação pela técnica de LSSP-PCR dos clones presentes nos tecidos demonstrou que na maioria das misturas somente um dos clones foi encontrado, exceto nas misturas OPS21 cl11 + SO3 cl5 (19+39) e OPS21 cl11 + MAS cl1 (19+32) Tabela VI. 6.4) Identificação de clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas pertencentes aos genótipos principais que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol Resultados prévios obtidos por nosso grupo demonstraram que nove das 24 (9/24) infecções mistas avaliadas por (Martins et al., 2007) apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao BZ em relação ao esperado baseado na sua respectiva infecção monoclonal. Além disso, a caracterização dos clones presentes no sangue dos animais infectados pela técnica de microssatélites e isoenzimas demonstrou a presença ou a predominância (maior parte dos animais do grupo com uma determinada mistura ou com um determinado clone) do clone mais susceptível ao BZ em três misturas: i) Gamba cl1 + Cuica cl1 (19+20); ii) OPS21 cl11 + P209 cl1 (19+20); iii) Gamba cl1 + Bug2148 cl1 (19+39) Dessa forma, tecidos de animais infectados com 12 misturas foram avaliados e comparados com os resultados obtidos por Martins et al., (2007) e Martins, (2008). Entretanto, a caracterização por microssatélites dos clones presentes diretamente nos tecidos dos animais apresentou uma baixa sensibilidade não permitindo identificar o clone nos tecidos em muitas infecções mistas analisadas. Em virtude desses resultados, nesse trabalho foi realizada uma análise pela técnica de LSSP-PCR dos clones presentes nos tecidos dos animais com infecções mistas, não tratados (INT) e tratados não curados (TNC), a fim de: 69

90 Resultados i) identificar o(s) clone(s) presente(s) nestes tecidos; ii) estudar a dinâmica da distribuição tecidual o kdna desses clones nas infecções mistas; iii) comparar com os resultados obtidos pelas metodologias de isoenzimas e microssatélites empregadas por Martins et al., (2007) e Martins, (2008). (Tabela VII). Um total de 74 amostras foram caracterizadas pela técnica de LSSP-PCR 70

91 Resultados Tabela VII: Identificação de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c infectados com as nove misturas que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol e nas três misturas caracterizadas pela técnica de microssatélites em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol*. Mistura de Genótipos Misturas clonais Animais INT Animais TNC Tecidos Tecidos Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon *Gamba cl1 + Cuica cl *OPS21cl11 + P209 cl1 OPS21 cl11 + P209 cl1 OPS21 cl11 + P209 cl1 OPS21 cl11 + P209 cl1 - OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl Gamba cl1 + IVV cl4 Gamba cl1 Gamba cl OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 +MAS cl1 OPS21 cl11 +MAS cl1 OPS21 cl11 +MAS cl1 OPS21 cl11 +MAS cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl OPS21 cl11 + Bug2148 cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl Gamba cl1 + SO3 cl5 Gamba cl1 Gamba cl1 - Gamba cl1 - Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 OPS21cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 + SO3 cl5 + SO3 cl5 + SO3 cl5 + SO3 cl5 + SO3 cl *Gamba cl1 + Bug2148 cl1 - - Gamba cl1 Gamba cl1 - Gamba cl P209 cl1 + IVV cl4 P209 cl1 + IVV cl P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + IVV cl4 P209 cl1 P209 cl1 - P209 cl1 P209 cl P209 cl1 P209 cl1 P209 cl Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 - - Cuica cl Bug2148 cl1 + MAS cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 *Estão representadas as três misturas caracterizadas pela técnica de microssatélites em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol. Em negrito estão os genótipos e clones do T. cruzi resistentes ao benzonidazol; em vermelho estão os genótipos e clones do T. cruzi parcialmente susceptíveis ao benzonidazol e em letra normal estão os genótipos e clones do T. cruzi susceptíveis ao benzonidazol. (-) representa combinações que não foi possível fazer a identificação do clone remanescente no tecido e em branco estão representados os tecidos cuja PCR para o kdna do T. cruzi foi negativa. 71

92 Resultados Dessas, 31 foram obtidas de animais não tratados (INT) e 43 foram obtidas de animais tratados com BZ e não curados (TNC). Entretanto, devido à sensibilidade inerente à técnica de LSSP-PCR, 19 amostras não puderam ser caracterizadas porque apresentaram a banda de 330pb muito fraca. Desse modo, 80% das amostras puderam ser identificadas por essa metodologia (Tabela VII). A detecção da presença dos dois clones de T. cruzi nas misturas pela técnica de LSSP-PCR não foi observada em nenhum dos isolados obtidos de animais com infecções mistas tratados com BZ e não curados (TNC) Tabela VII. Por outro lado, a caracterização dos isolados remanescentes em tecidos de animais não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones em 77% das amostras analisadas (24/31) pertencentes às misturas (Tabela VII). Na combinação genotípica foram avaliadas duas misturas: Gamba cl1 + Cuica cl1 e OPS21 cl11 + P209 cl1, que não revelaram mudança no perfil de susceptibilidade ao BZ quando avaliadas pelo controle de cura empregado. Entretanto, a caracterização molecular dos isolados remanescentes nos tecidos e no sangue revelou a predominância do clone mais susceptível ao BZ da mistura (Martins 2008). Não foi possível fazer a caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + Cuica cl1 (19+20) pela técnica de LSSP-PCR - Tabela VII. Na mistura OPS21 cl11 + P209 cl1 foi detectada a presença de ambos os clones em todos os tecidos positivos provenientes de animais INT, enquanto nos tecidos dos animais IT foi encontrado apenas o clone OPS21 cl11, ou seja, o mais susceptível ao BZ da mistura (Tabela VII). A identificação do clone presente nos tecidos de animais INT pela técnica de LSSP-PCR não revelou alteração no tropismo tecidual do kdna do clone OPS21 cl11 (Tabela VIII). Entretanto, foi observada alteração adicional na distribuição tecidual do kdna do clone P209 cl1 em comparação com o resultado observado nas infecções monoclonais correspondentes, ou seja, o clone P209 cl1 encontrado no cólon dos animais com infecção mista não foi detectado nesse tecido nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). 72

93 Resultados Tabela VIII: Distribuição tecidual do kdna de clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais em camundongos BALB/c com infecção monoclonal pela técnica de PCR. Genótipo Clone Tecidos positivos para o kdna do T. cruzi Animais INT Animais IT 19 Gamba cl1 Coração, músculo esquelético, baço, cérebro e cólon Coração, músculo esquelético, bexiga e cólon OPS21 cl11 Coração, músculo esquelético, baço, bexiga e cólon Coração, músculo esquelético, bexiga, cérebro e cólon 20 Cuica cl1 Coração, músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon Músculo esquelético, baço, bexiga, cérebro e cólon P209 cl1 Coração, músculo esquelético, bexiga e cérebro Coração, músculo esquelético, bexiga e cólon 39 SO3 cl5 Coração, músculo esquelético, baço e cólon Coração, músculo esquelético, baço e bexiga Bug2148 cl1 Coração, músculo esquelético, bexiga e cólon Coração, músculo esquelético e cólon 32 IVV cl4 Coração, baço, bexiga e cólon --- MAS cl1 Coração, músculo esquelético, baço e cólon Músculo esquelético, bexiga, cérebro e cólon (---) indica que todos os tecidos apresentaram PCR negativa para o kdna do Trypanosoma cruzi. 73

94 Resultados A identificação do clone remanescente nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + P209 cl1 e tratados não revelou alteração na distribuição tecidual do kdna do clone OPS21 cl11 em comparação com o observado nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Entretanto, o clone P209 cl1 que inicialmente estava presente no músculo e na bexiga de animais com infecção monoclonal não foi encontrado nesses tecidos nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + P209 cl1 está representado na Figura 18. TNC1 TNC2 TNC3 INT1 INT2 INT3 IVV cl4 P209 cl1 A C TC1 TC2 TC3 INT1 INT2 INT3 INT5 OPS21 cl11 MAS cl1 INT1 INT2 INT3 TNC1 TNC2 SO3 cl5 P209 cl1 TC1 TC2 TC3 P209 cl1 OPS21 cl11 B D Figura 18: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos de isolados de animais infectados com diferentes combinações genotípicas do Trypanosoma cruzi e que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol. INT: isolados de animais não tratados com benzonidazol. TNC: isolados de animais tratados com benzonidazol e não curados. A: Mistura dos clones OPS21 cl11 + P209 cl1 (19+20); B: Mistura dos clones OPS21 cl11 + MAS cl1 (19+32); C: Mistura dos clones P209 cl1 + IVV cl4 (20+32); D: Mistura dos clones P209 cl1 + SO3 cl5 (20+39). 74

95 Resultados A caracterização por LSSP-PCR dos isolados remanescentes nos tecidos dos animais infectados com a combinação foi realizada em duas misturas que apresentaram mudança no perfil de susceptibilidade ao BZ de parcialmente susceptível para resistente: Gamba cl1 + IVV cl4 e de susceptível para resistente: OPS21 cl11 + MAS cl1 (Martins et al., 2007). A identificação por LSSP-PCR dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + IVV cl4 (19+32), ambos parcialmente susceptíveis ao BZ, não tratados (INT) e tratados não curados (TNC) demonstrou apenas a presença do clone Gamba cl1 (Tabela VII). Em relação ao tropismo tecidual, foi observada alteração na distribuição tecidual do kdna do clone IVV cl4 nos animais não tratados (INT), ou seja, este clone que inicialmente foi detectado no coração dos animais com infecção monoclonal não tratados não estava presente nesse tecido nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). A caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 e não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones (Tabela VII). Por outro lado, somente o clone OPS21 cl11, pertencente ao genótipo 19, foi encontrado nos tecidos de animais tratados não curados (TNC) - Tabela VII - e não revelou alteração na distribuição tecidual desse clone nos tecidos de animais com infecção mista INT e IT em comparação com os animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura 18. A combinação apresentou três misturas com alterações no perfil de susceptibilidade ao BZ (OPS21 cl11 + Bug2148 cl1, Gamba cl1 + SO3 cl5 e OPS21 cl11 + SO3 cl5), sendo observadas alterações em direção ao aumento e à diminuição da susceptibilidade a este fármaco. Uma mistura (Gamba cl1 + Bug2148 cl1) não apresentou alteração nas taxas de cura, mas a caracterização molecular demonstrou a presença do clone Gamba cl1, o mais susceptível da mistura (Martins et al., 2007). A caracterização por LSSP-PCR dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essas misturas não tratados (INT) e tratados não curados (TNC) apresentou resultados distintos. Nos animais infectados com a mistura OPS21 cl

96 Resultados Bug2148 cl1 (19+39) e não tratados somente o cólon apresentou positividade na PCR e a caracterização do clone presente nesse tecido demonstrou a presença do OPS21 cl11 (Tabela VII) e não revelou alteração adicional na distribuição tecidual do kdna desse clone (Tabela VIII). Nos animais tratados (TNC), o perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos demonstrou a presença do clone OPS21 cl11 no coração, músculo esquelético e baço e do Bug2148cl1 na bexiga, cérebro e no cólon (Tabela VII). Em relação ao tropismo tecidual, a identificação adicional do clone remanescente nesses tecidos revelou alteração na distribuição tecidual do kdna de ambos os clones em comparação com o observado nas infecções monoclonais. O clone OPS21 cl11 que estava presente na bexiga, no cérebro e no cólon dos animais com infecção monoclonal não foi detectado nesses tecidos nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII); e o clone Bug2148 cl1 que inicialmente estava presente no coração e músculo esquelético dos animais com infecção monoclonal não foi encontrado nesses tecidos nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). A caracterização por LSSP-PCR dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + SO3 cl5 (19+39) não tratados e tratados demonstrou a presença do Gamba cl1 pertencente ao genótipo 19 e mais resistente ao BZ da mistura (Tabela VII). Em relação ao tropismo tecidual, não foi observada alteração adicional na distribuição do kdna do clone Gamba cl1 nos animais com infecção mista não tratados (INT) - (Tabela VII e Tabela VIII). Entretanto, a identificação dos clones remanescentes nos tecidos por LSSP-PCR de animais tratados (TNC) revelou alteração adicional no tropismo tecidual do clone Gamba cl1, sendo este detectado no baço dos animais infectados com essa mistura, ao contrário do observado nas infecções monoclonais (Tabela VII e Tabela VIII). Além disso, o clone SO3 cl5 que inicialmente estava presente no baço dos animais com infecção monoclonal, não foi detectado nesse tecido nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 (19+39) demonstrou a presença de ambos os clones nos animais não tratados (INT) e somente a presença do clone OPS21 cl11 nos tecidos dos animais tratados (TNC) - Tabela VII. A identificação adicional do clone presente nos tecidos de animais não tratados revelou 76

97 Resultados alteração na distribuição tecidual do clone SO3 cl5 que foi detectado na bexiga dos animais com infecção mista, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Nos animais tratados não curados (TNC), a caracterização adicional por LSSP-PCR revelou alteração na distribuição tecidual do kdna do clone OPS21 cl11 que foi encontrado no baço, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal, onde não foi observada a presença deste clone neste tecido (Tabela VII e Tabela VIII). Não foi possível fazer por LSSP-PCR a caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + Bug2148 cl1 (19+39) e não tratados (Tabela VII). Nos animais tratados não curados (TNC), somente o clone Gamba cl1, o mais susceptível ao tratamento foi encontrado nos tecidos (Tabela VII). A caracterização por LSSP-PCR não revelou alteração na distribuição tecidual do kdna do clone Gamba cl1 nos animais com infecção mista em comparação com os animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Na combinação 20+32, somente a mistura P209 cl1 + IVV cl4 apresentou mudança no perfil de susceptibilidade ao BZ (de resistente para parcialmente susceptível). A caracterização dos clones presentes nos tecidos pela técnica de LSSP- PCR nos animais infectados com essa mistura não tratados revelou a presença dos dois clones (Tabela VII). Em relação ao tropismo tecidual, a identificação do clone nos animais com infecção mista e não tratados revelou alteração na distribuição tecidual do kdna do clone P209 cl1, sendo este detectado no cólon em comparação com os animais com infecção monoclonal, onde não foi observada a presença desse clone neste órgão (Tabela VII e Tabela VIII). Nos animais tratados (TNC), a identificação do clone remanescente em todos os tecidos de animais infectados com a mistura P209 cl1 + IVV cl4 (0% susceptível + 40% susceptível ao BZ) demonstrou apenas a presença do clone P209 cl1, ou seja, do clone mais resistente ao tratamento (Tabela VII). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura 18. A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos não revelou alteração na distribuição do kdna do clone 77

98 Resultados P209 cl1 nos animais com infecção mista em comparação com os animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Na combinação foram avaliadas duas misturas P209 cl1 + SO3 cl5 e Cuica cl1 + SO3 cl5 que apresentaram mudança no perfil de susceptibilidade ao BZ de resistente para parcialmente susceptível quando comparadas com suas respectivas infecções monoclonais (Martins et al., 2007). A caracterização do clone presente pela técnica de LSSP-PCR nos tecidos de animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 e não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones (Tabela VII). O mesmo foi observado na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5, onde o kdna de ambos os clones foi detectado nos tecidos analisados (Tabela VII). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura 18. Em relação ao tropismo tecidual do kdna do T. cruzi, a identificação dos clones presentes nos tecidos por LSSP-PCR de animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 e não tratados (INT) revelou alteração na distribuição tecidual do kdna de ambos os clones. O clone P209 cl1 que foi encontrado no baço dos animais com infecção mista não estava presente nesse tecido nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). O mesmo foi observado para o clone SO3 cl5, que foi detectado na bexiga dos animais com infecção mista, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). A identificação dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5 e não tratados (INT) revelou alteração na distribuição tecidual do kdna do clone SO3 cl5 que foi detectado na bexiga e cérebro dos animais com infecção mista em comparação com os animais com infecção monoclonal, onde não foi observada a presença desse clone nesses tecidos (Tabela VII e Tabela VIII). Nos animais tratados (TNC), a identificação dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura P209 cl1 + SO3 cl5 demonstrou a presença do clone P209 cl1, mais resistente ao tratamento e pertencente ao genótipo 20 (Tabela VII) e revelou ainda alteração adicional na distribuição tecidual do kdna dos clones envolvidos na mistura em comparação com o encontrado nas infecções monoclonais 78

99 Resultados correspondentes, ou seja, o clone SO3 cl5 inicialmente encontrado no baço dos animais com infecção monoclonal, não foi detectado nesse tecido em animais com esta infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5 e tratados (TNC) demonstrou a presença do clone Cuica cl1, mais resistente ao BZ e pertencente ao genótipo 20 (Tabela VII). Em relação ao tropismo tecidual do kdna do T. cruzi, a identificação dos clones remanescentes em todos os tecidos pela técnica de LSSP-PCR do mesmo animal que apresentou mudança no perfil de susceptibilidade ao BZ revelou ainda alteração adicional na distribuição tecidual do kdna do T. cruzi dos clones envolvidos na mistura em comparação com o encontrado nas infecções monoclonais correspondentes. O clone Cuica cl1 foi detectado no coração dos animais com infecção mista, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Por outro lado, o clone SO3 cl5 inicialmente encontrado no coração de animais com infecção monoclonal não foi detectado nesse tecido nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). Uma mistura (Bug2148 cl1 + MAS cl1) pertencente à combinação genotípica apresentou alteração no perfil de susceptibilidade ao BZ de resistente para susceptível (Martins et al., 2007). A caracterização por LSSP-PCR do clone presente nos tecidos de animais não tratados (INT) e tratados não curados (TNC) demonstrou apenas o clone Bug2148 cl1, ou seja, o mais resistente ao tratamento da mistura (Tabela VII) e não revelou alteração na distribuição tecidual do kdna desse clone nos animais com infecção mista em comparação com os animais com infecção monoclonal (Tabela VII e Tabela VIII). Entretanto, o clone MAS cl1, que inicialmente foi detectado no músculo esquelético e cólon dos animais com infecção monoclonal, não estava presente nesses tecidos nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). A caracterização adicional por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de animais tratados não curados (TNC) revelou alteração na distribuição tecidual do kdna de ambos os clones: o Bug2148 cl1 foi detectado na bexiga e no cérebro dos animais com infecção mista, ao contrário do observado nos animais com infecção monoclonal e o clone MAS cl1, inicialmente detectado no músculo esquelético, bexiga, 79

100 Resultados cérebro e cólon de animais com infecção monoclonal, não estava presente nos animais com infecção mista (Tabela VII e Tabela VIII). A Tabela IX representa o resultado obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais com infecção mista não tratados (INT) e tratados (TNC) por LSSP-PCR e dos clones presentes no sangue e tecidos e caracterizados por isoenzimas e microssatélites (Martins et al., 2007; Martins, 2008). 80

101 Resultados Tabela IX: Identificação de clones do Trypanosoma cruzi em tecidos por LSSP-PCR e no sangue e tecidos por isoenzimas* e microssatélites* de camundongos BALB/c infectados com diferentes misturas pertencentes aos genótipos principais que apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol e nas três misturas em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol**. Misturas de genótipos Misturas clonais LSSP-PCR (tecido) Isoenzimas e microssatélites (sangue/tecido) Animais INT Animais TNC Animais INT Animais TNC Clone de T. cruzi Clone de T. cruzi Clone de T. cruzi Clone de T. cruzi **Gamba cl1 + Cuica cl1 - - Cuica cl1 + Gamba cl1 Cuica cl1 + Gamba cl **OPS21 cl11 + P209 cl1 OPS21 cl11 + P209 cl1 OPS21 cl11 P209 cl1 + OPS21 cl11 OPS21 cl Gamba cl1 + IVV cl4 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 (2) OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 Indeterminado Indeterminado **Gamba cl1 + Bug2148 cl OPS21 cl11 + Bug2148 cl Gamba cl1 + SO3 cl5 - - Gamba cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 e Bug2148 cl1 OPS21 cl11 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 + Indeterminado OPS21 cl11 Gamba cl OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl P209 cl1 + IVV cl4 P209 cl1 + IVV cl4 P209 cl1 P209 cl1 P209 cl P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 + SO3 cl5 P209 cl1 P209 cl1 P209 cl1 + Indeterminado Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 Cuica cl1 + Indeterminado Cuica cl Bug2148 cl1 + MAS cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 - Em negrito são representados os genótipos e clones do Trypanosoma cruzi resistentes ao Benzonidazol. Em vermelho genótipos e clones do Trypanosoma cruzi parcialmente susceptíveis ao benzonidazol. Em letra normal: genótipos e clones do Trypanosoma cruzi susceptíveis ao benzonidazol. Sublinhado: representa isolados em que houve a predominância após tratamento, do clone do T. cruzi mais susceptível ao benzonidazol baseado nas infecções monoclonais correspondentes. Indeterminado: representa isolados cujos perfis de LSSP-PCR ou microssatélites não foram compatíveis com o esperado baseado nos clones inoculados. (-) representa as misturas em que não foi possível fazer a caracterização dos clones por LSSP-PCR porque apresentaram a banda de 330pb fraca ou porque não foi possível caracterizar por microssatélites. *Resultados obtidos por Martins **Representa as três misturas em que houve predominância do clone mais susceptível ao benzonidazol. 81

102 Resultados 6.5) Identificação de clones de T. cruzi remanescentes nos tecidos de camundongos infectados com misturas dos genótipos principais e tratados com BZ considerados curados (TC) pelo critério de cura utilizado e que apresentaram PCR em tecido positiva Resultados prévios obtidos por nosso grupo demonstraram que 12 animais considerados curados pelo critério de cura parasitológico e sorológico utilizado (ESF, He, PCR em eluato de sangue, ELISA e AATV) apresentaram PCR em tecido positiva (Martins et al., 2008). Em decorrência desses resultados, nesse trabalho foi feita também a identificação dos clones remanescentes nos tecidos desses animais empregando a técnica de LSSP-PCR a fim de verificar qual seria o clone responsável por essa positividade. Um total de 46 tecidos positivos para o kdna do T. cruzi de animais tratados e considerados curados (TC) foram avaliados pela técnica de LSSP-PCR e comparados com os tecidos de animais tratados não curados (TNC) e não tratados (INT). Oito amostras (11%) dos animais INT não puderam ser caracterizadas pela técnica de LSSP- PCR, pois apresentaram a banda de 330pb muito fraca (Tabela X). 82

103 Resultados Tabela X: Identificação de clones de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c com infecções mistas tratados com benzonidazol e considerados curados (TC) pelo critério de cura e que apresentaram PCR em tecido positiva. Animais TC Misturas de Genótipos Misturas clonais Tecidos Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon *OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl Gamba cl1 + MAS cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl1 Gamba cl OPS21 cl11 + IVV cl4 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21cl11 OPS21 cl *OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl *Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl Cuica cl1 + Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl SO3 cl5 + MAS cl1 Ind ind ind ind ind SO3 cl5 + IVV cl4 Ind ind ind ind ind ind *Bug2148 cl1 + MAS cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Em negrito estão os genótipos e clones do T. cruzi resistentes ao benzonidazol; em vermelho estão os genótipos e clones do T. cruzi parcialmente susceptíveis ao benzonidazol e em letra normal estão os genótipos e clones do T. cruzi susceptíveis ao benzonidazol. (-) representa combinações que não foi possível fazer a identificação do clone remanescente no tecido e em branco estão representados os tecidos cuja PCR para o kdna do T. cruzi foi negativa. *Estão as misturas que também apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol baseado na sua infecção monoclonal. 83

104 Resultados Tabela X (continuação): Identificação de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de camundongos BALB/c com infecções mistas tratados com benzonidazol e não curados (TNC) e não tratados (INT) pela técnica de LSSP-PCR. Animais INT Animais TNC Misturas de Genótipos Misturas clonais Tecidos Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon Coração Músculo Baço Bexiga Cérebro Cólon Tecidos *OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 + MAS cl1 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl Gamba cl1 + MAS cl Gamba cl1 - Gamba cl **OPS21 cl11 + IVV cl4 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl *OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 + SO3 cl5 OPS21 cl11 +SO3 cl5 OPS21cl11 +SO3 cl5 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl11 OPS21 cl *Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 +SO3 cl5 Cuica cl1 +SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 + SO3 cl5 Cuica cl1 +SO3 cl5 Cuicacl1 +SO3 cl5 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl1 Cuica cl Cuica cl1 + Bug2148 cl1 Cuica cl1 + Bug2148 cl1 - Cuica cl1 + Bug2148 cl **SO3 cl5 + MAS cl1 - Bug2148 cl SO3 cl5 + IVV cl ind ind */**Bug2148 cl1 + MAS cl1 Bug2148 cl1 Bug2148 cl1 Em negrito estão os genótipos e clones do T. cruzi resistentes ao benzonidazol; em vermelho estão os genótipos e clones do T. cruzi parcialmente susceptíveis ao benzonidazol e em letra normal estão os genótipos e clones do T. cruzi susceptíveis ao benzonidazol. (-) representa combinações que não foi possível fazer a identificação do clone remanescente no tecido e em branco estão representados os tecidos cuja PCR para o kdna do T. cruzi foi negativa. *Estão as misturas que também apresentaram alteração no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol baseado na sua infecção monoclonal. ** São as misturas que não apresentaram animais tratados e não curados (TNC). 84

105 Resultados Não foi observada a presença de ambos os clones do T. cruzi em nenhum dos isolados (0/46) obtidos de animais tratados com BZ e considerados curados (TC). Entretanto, a caracterização dos clones presentes em tecidos de animais não tratados (INT) demonstrou a presença de ambos os clones em 73% dos isolados (17/23) - Tabela X. A presença de ambos os clones só não foi observada nos tecidos de animais infectados com as misturas Gamba cl1 + MAS cl1, OPS21 cl11 + IVV cl4 e Bug2148 cl1 + MAS cl1. Um animal infectado com a mistura OPS21 cl11 + MAS cl1 (ambos 100% susceptíveis ao BZ) foi considerado curado (TC) pelo critério de cura empregado. A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos desse animal demonstrou a presença do OPS21 cl11, pertencente ao genótipo 19, semelhante ao obtido nos tecidos de animais tratados não curados (TNC). Entretanto, o perfil de LSSP- PCR obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais não tratados (INT) revelou a presença de ambos os clones (Tabela X). A identificação por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de um animal infectado com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 (40% susceptível + 100% susceptível ao BZ) revelou a presença do clone Gamba cl1, ou seja, o mais resistente ao tratamento (Tabela IX). Resultado semelhante foi obtido na caracterização dos clones remanescentes nos tecidos de animais tratados não curados (TNC) e infectados não tratados (INT) Tabela X. O perfil de LSSP-PCR obtido na caracterização dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com a mistura Gamba cl1 + MAS cl1 está representado na Figura

106 Resultados INT1 TC1 TC2 INT2 INT3 INT4 TC3 TC4 TC5 TC6 OPS21 cl11 IVV cl4 Gamba cl1 MAS cl1 TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 TC7 TC8 TC9 TC10 MAS cl1 SO3 cl5 IVV cl4 A B Figura 19: Perfil de LSSP-PCR representativo dos resultados obtidos de isolados de animais infectados com diferentes combinações genotípicas do Trypanosoma cruzi e que foram considerados curados pelo critério de cura clássico (ESF, hemocultura, ELISA, AATV e PCR em eluato de sangue) e apresentaram PCR em tecido positiva. TC: isolados de animais tratados com benzonidazol e considerados curados. A: Combinação 19+32: INT1, TC1 e TC2: Gamba cl1 + MAS cl1; INT2- INT4 e TC3- TC6: OPS21 cl11 + IVV cl4; B: Combinação 39+32: TC1-TC6: SO3 cl5 + MAS cl1; TC7-TC10: SO3 cl5 + IVV cl4. INT: isolados de animais não tratados com benzonidazol. Os dois animais infectados com a mistura OPS21 cl11 + IVV cl4 (100% susceptível + 40% susceptível ao BZ) e tratados foram considerados curados (TC) e a caracterização do clone remanescente nos tecidos positivos na PCR revelou a presença do clone OPS21 cl11, ou seja, do clone mais susceptível ao BZ (Tabela X), semelhante ao observado nos animais não tratados (INT). O perfil de LSSP-PCR obtido na identificação dos clones presentes nos tecidos de animais infectados com essa mistura está representado na Figura 19. A caracterização por LSSP-PCR dos clones remanescentes nos tecidos de um animal infectado com a mistura OPS21 cl11 + SO3 cl5 (ambos 100% susceptíveis ao tratamento) demonstrou a presença do clone OPS21 cl11, pertencente ao genótipo 19 (Tabela IX). Resultado semelhante foi obtido nos tecidos de animais tratados e não curados (TNC). Por outro lado, nos tecidos de animais infectados não tratados (INT) foi observada a presença de ambos os clones (Tabela X - continuação). Um animal infectado com a mistura Cuica cl1 + SO3 cl5 (0% susceptível susceptível ao tratamento) foi considerado curado (TC) e a caracterização do clone remanescente nos tecidos desse animal demonstrou a presença do clone Cuica cl1, mais 86