COLABORADOR(ES): DENISE C. TAVARES, EMERSON H. DE FARIA, KÁTIA J. CIUFFI, LUCAS A. ROCHA, NATÁLIA H. FERREIRA

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1 16 TÍTULO: INCORPORAÇÃO DE CISPLATINA NA NANOPARTÍCULA FUNCIONALIZADA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA SUBÁREA: QUÍMICA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA AUTOR(ES): BÁRBARA AYUMI MIURA ORIENTADOR(ES): EDUARDO JOSÉ NASSAR COLABORADOR(ES): DENISE C. TAVARES, EMERSON H. DE FARIA, KÁTIA J. CIUFFI, LUCAS A. ROCHA, NATÁLIA H. FERREIRA

2 1. Resumo Partículas luminescentes vêm sendo cada vez mais estudadas para serem utilizadas como marcadores biológicos, fluoroimunoensaio, carreadores de drogas, entre outras aplicações. Nanopartículas com tamanhos adequados são essenciais para que as mesmas possam transpor a parede celular e ao possuírem luminescência essas partículas podem ser detectadas. A metodologia sol-gel hidrolítica vem sendo utilizada para a preparação de diversos tipos de luminóforos com diferentes aplicações. Neste trabalho foram preparadas nanopartículas do luminóforo vanadato de ítrio (YVO 4 ) dopados com 1% do íons Eu 3+, essas nanopartículas luminescentes sofreram funcionalização via sol-gel com o alcóxido 3-cloropropiltrimetoxisilano. As nanopartículas também sofreram incorporação do quimioterápico cisplatina. As amostras foram caracterizadas através da espectroscopia na região do infravermelho onde comprovou a funcionalização da nanopartícula, difração de raios X no qual podemos observar que após a funcionalização da nanoparticula sua estrutura permanece inalterada, a fotoluminescência dos íons de Eu 3+, teste de viabilidade celular o qual vemos a citoxicidade da nanoparticula, número de mitose onde observamos a divisão celular e ensaio cometa onde observou danos causados ao DNA. 2. Introdução A luminescência definida fisicamente é a luz produzida a partir da emissão de energia, na forma de luz, quando há absorção de energia por alguns átomos. Nesse processo, seus elétrons são induzidos a um estado excitado (mais alta energia), que ao retornarem para o seu estado fundamental (menor energia), emitindo a radiação eletromagnética (luminosa) a temperaturas relativamente baixas [1]. O grupo denominado Terras Raras de acordo com a IUPAC englobam os elementos escândio, ítrio e o grupo lantanídios que são os elementos que vão do

3 lantânio ao lutécio apresentam uma ótima propriedade luminescente [2].Esses elementos podem ser utilizados como dopantes em uma variedade de matriz. Os vanadatos dopados com íons lantanídeos (Ln 3+ ), AVO 4 :Ln 3+ (A = Y, La, Gd; Ln 3+ = Nd 3+, Er 3+, Ho 3+, Eu 3+, Yb 3+, Sm 3+, Tm 3+ ), apresentam ótimas propriedades luminescentes o que os tornam candidatos à luminóforos para tubos de raios catódicos, detectores de imagens médicas, laser, monitor de tela plana, conversão ascendente (up-conversion), biomarcadores, entre outros, podendo ser obtidos através de várias metodologia. [3-5]. A metodologia sol-gel tem sido aplicada na preparação e modificação de uma variedade de nanopartículas. A combinação de componentes orgânicos e inorgânicos, em escala nanométrica, em um único material levou ao desenvolvimento de uma nova área na ciência dos materiais, chamados de híbridos [6]. A cis-diaminodicloroplatina (II), mais conhecida como cisplatina apresenta reconhecida atividade antitumoral e tem sido amplamente utilizada desde a sua descoberta por Rosenberg no final da década de 60. Tem sido clinicamente utilizada no tratamento de tumores sólidos e poucos outros complexos análogos apresentam atividade compatível. Atualmente, ela está entre os principais compostos utilizados na quimioterapia anticâncer [7]. 3. Objetivo O objetivo do trabalho é preparar e caracterizar a nanopartícula de vanadato de ítrio dopada com íon európio III através da metodologia sol gel. Funcionalizar com alcóxido 3-cloropropiltrimetoxilano e incorporar o quimioterápico cisplatina. A caracterização foi realizada através da espectroscopia na região do infravermelho, difração de raios X e fotoluminescência. 4. Metodologia

4 O processo Sol Gel não hidrolitico (SG-NH) consiste na reação de um haleto metálico ou semi-metálico (M-X) e um alcóxido (M -OR) para obtenção de uma cadeia inorgânica de óxidos (M-O-M ). Os alcóxidos podem ser adicionados a reação ou produzidos in situ durante o processo através da reação de um haleto e um doador de oxigênio, como álcool ou éter. Os mecanismos dos processos SG-NH já estão bem discutidos na literatura [8,9]. Este processo apresenta vantagens tais como as baixas temperaturas de obtenção dos materiais, a formação de materiais mais homogêneos, e maior reprodutibilidade. 5. Desenvolvimento Em um balão de 100 ml, sob agitação constante, colocou YCl 3 (40,95 ml) e EuCl 3 (0,41 ml), água destilada(3,95 ml) e álcool isopropílico (12,8 ml) e por fim isopropóxido de vanádio(0,97 ml) solubilizado em ácido acético(0,234 ml), a mistura reacional permaneceu sob agitação durante 24 h. O solvente foi evaporado à baixa temperatura, o sólido obtido foi tratado a 800 ºC durante 4 h. O material final foi caracterizado por espectroscopia da região do infravermelho, difração de Raios X e Fotoluminescência. A funcionalização seguiu o procedimento, colocou-se em um balão de 100 ml, sob agitação, vanadato de ítrio dopado com európio (300 mg) 3- cloropropiltrimetoxilano (769,65 µl), água destilada(4,0 ml) e álcool etílico absoluto (12,0 ml) deixou-se em agitação por 24 h, centrifugou e secou em uma estufa à vácuo a uma temperatura 60 ºC durante 24 h e caracterizou por espectroscopia da região do infravermelho, difração de Raios X e Fotoluminescência. Na incorporação da cisplatina foi feita em um balão de 100mL onde colocou sob agitação constante 40 mg de nanopartícula funcionalizada e uma solução com 40 mg de cisplatina e 10 ml de água destilada deixou-se em agitação durante 48 h posteriormente centrifugou e secou em estufa à vácuo a uma temperatura 60 ºC durante 24 h e caracterizou por espectroscopia da região do infravermelho, difração de Raios X e Fotoluminescência. Testes de viabilidade celular, mitose e ensaio cometa foram realizados no laboratório de mutagênese da universidade de Franca

5 Transmitância (%) 6. Resultados 6.1 Espectroscopia na região do infravermelho A figura 1 mostra o espectro na região do infravermelho, do YVO 4 :Eu 3+, YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina b c a Comprimento de Onda (cm -1 ) Figura 1: Espectroscopia na região do infravermelho das nanopartícula (a), YVO 4 :Eu 3+, (b) YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e (c) YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina. A tabela 1 apresenta as vibrações do vanadato de ítrio dopado com íons Eu 3+, YVO 4 :Eu 3+, YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina. Bandas (cm -1 ) Vibrações 451 Y-O 822 V-O 1045 Si-O-Si

6 cps 2884,2962 CH 3292 NH 3424 H 2 O 3618 OH Tabela 1: Número de onda e vibrações moleculares para os espectros do vanadato de ítrio dopado com európio, vibrações da YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e vibrações da YVO 4 :Eu 3+ incorporada cisplatina. Na espectroscopia da região do infravermelho podemos observar picos na região 451 e 822 cm -1, os quais são atribuídos as vibrações dos Y-O e V-O respectivamente. Na região de 2884, 2962 cm -1 referente CH e em 1045 cm -1 do Si- O-Si referentes à funcionalização da nanoparticula. Podemos observar picos em 3618 e 3292 do OH e NH respectivamente provenientes da incorporação. 6.2 Difração de Raios X A figura 2 mostra o difratogramas de raios X, do YVO 4 :Eu 3+, YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina. (200) (112) (312) a b c ( o )

7 Figura 2: Difração de raios X do YVO 4 :Eu 3+ (a), YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada (b) e YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina (c). A difração de raios X pode-se observar que após a funcionalização e incorporação ambos os difratogramas possuem picos bem finos, definidos mostrando que a amostra está bem organizada e ocorreu a formação da fase tetragonal do óxido. De acordo com o card JCPDS ocorreu a formação da fase tetragonal do óxido. A tabela abaixo apresenta o tamanho do cristalito para a nanoparticula a 800ºC, funcionalizada e funcionalizada e incorporada cisplatina calculo pela equação de Sherrer [10]. Amostra Tamanho do Cristalito (nm) Nanoparticula 800ºC 5,67 Nanoparticula funcionalizada 23,67 Nanoparticula funcionaliza e 9,33 incorporada cisplatina Tabela 2: Tamanho do cristalito A nanoparticula apresentou um tamanho de cristalito 5,67nm, após a funcionalização teve um aumento de quase 5vezes, indicando que houve a funcionalização. A diminuição do tamanho do cristalito após a incorporação da cisplatina pode significar que o processo pode ter removido parte do alcóxido que não estava ligado covalentemente a nanoparticula 6.3 Fotoluminescência A figura 3 mostra a fotoluminescência das nanoparticulas, (a) YVO 4 :Eu 3+, (b) YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e (c) YVO 4 :Eu 3+ funcionalizada e incorporada cisplatina.

8 Intensidade (u.a.) Intensidade (u.a.) 5 D 0-7 F 4 b YVO 4 :Eu 3+ YVO 4 :Eu 3+ :func YVO 4 :Eu 3+ :func:cisp YVO 4 :Eu 3+ YVO 4 :Eu 3+ :func YVO 4 :Eu 3+ :func:cisp 5 D 0-7 F 2 a c 5 L 6 5 D 2 b c 5 D 0-7 F 0 5 D 0-7 F 1 5 D 0-7 F 3 a Comprimento de Onda (nm) comprimento de Onda (nm) a b Figura 3: Fotoluminescência do vanadato de ítrio dopado com íons Eu 3+, funcionalizada e incorporada cisplatina a)espectro de excitação (λ em. = 616nm), b)espectro de emissão (λ exc. = BTC) Os espectros de excitação foram realizados fixando o comprimento de onda em 616 nm. A larga banda centrada em 320 nm refere-se à absorção do vanadato. Os espectros de emissão do íon Eu 3+ na matriz hospedeira foram obtidos pela excitação na BTC, os espectros apresentam as bandas correspondentes às transições 5 D 0 7 F J (J = 0-4), sem alteração na simetria do íon. Podemos observar que após a funcionalização e a incorporação de cisplatina as amostras apresentaram as linhas características de emissão do íon. 6.4 Viabilidade Celular A figura 4 mostra a Viabilidade celular para celulares V79 e B16F10

9 Figura 4. Viabilidade Celular (%) para V79 e B16F10 No teste de viabilidade foi possível observar a cisplatina foi altamente toxica para ambas às linhagens celular com concentração abaixo de 39 g/ml, enquanto para a nanoparticula funcionalizada e incorporada cisplatina a concentração aumenta 2500 e 5000 g/ml, respectivamente. 6.5 Número de mitose e o ensaio cometa Na tabela abaixo estão o numero de mitose e o valor obtido no ensaio cometa para o controle, implante a nanoparticula, nanoparticula funcionalizada, nanoparticula funcionalizada e incorporada cisplatina e cisplatina. Tratamento Mitose E. Cometa Controle Implante YVO 4 :Eu YVO 4 :Eu 3+ : CPTES YVO 4 :Eu 3+ : CPTES:CDDP CDDP livre Tabela 3: apresenta o número de mitose e os valores obtidos no ensaio cometa Na tabela podemos observar o número de mitose para a nanopartícula funcionalizada e incorporada e para a cisplatina, esse número cai quando comparado com o implante. No ensaio cometa

10 podemos observar que a cisplatina causa mais danos ao DNA do que a nanoparticula funcionalizada e incorporada. 7. Considerações finais Observou-se que a nanopartícula preparada pelo método sol-gel obteve tamanho adequado par adentrar a células e ser utilizado como carregador de drogas. Foi observado que a cisplatina pura é mais citotóxica que a nanopartícula funcionaliza e incorporada com cisplatina e ambas conseguiram diminuir a mitose e a quantidade das células cancerígenas, portanto a nanopartícula foi muito eficiente como carregador de droga. 8. Fontes consultadas [1] T. S. dos Santos,; Emissão de luz em matrizes policristalinas de H 3 BO 3, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Sergipe, (2008). [2]O.A. Serra, J.F. Lima, P.C.S. Filho,; A luz e as terras raras. Revista Virtual de Química (2015),7(1), [3] Y. Li a, Y. Zheng a, Q. Wang a,b,*, C. C. Zhang c,; Synthesis of luminescent YVO 4 :Eu 3+ submicrometer crystals through hydrogels as directing agents. Materials Chemistry and Physics 135 (2012) [4] E. J. Nassar, L. R. Avila, P. F.S. Pereira, C. Mello, O. J. de Lima, K. J. Ciuffi, L.D. Carlos,; Eu(III) incorporation in sol gel aluminum yttrium matrix by nonhydrolytic route. Journal of Luminescence 111 (2005) [5] R.S. Ningthoujam, L. Robindro Singh, V. Sudarsan, S. Dorendrajit Singh,; Energy transfer process and optimum emission studies in luminescence of core shell nanoparticles: YVO4:Eu YVO4 and surface state analysis. Journal of Alloys and Compounds 484 (2009)

11 [6] K.G. Tshabalalaa, S.H. Chob. J.K. Park, Shereyas S. pitale, I.M. Nagpure, R.E. Kroon, H.C. Swart, O.M. Ntwaeaborwa,; Luminescent properties and X-ray photoelectron spectroscopy study of Zn 2 O 4 Al:Ce 3+, Tb 3+ phosphor. Journal of Alloys and Compounds 509(2011) [7] I.H. Krakoff, Platinum and Other Metal Coordenation Compounds in Cancer Chemotherapy: Clinical Aplications of Platinum Complexes; Nicoline, M., Boston: Martinus N. Publishing (1988) 351. [8] Neeraj, S. et al. Chemical Physics Letters, (1-3): p [9] Wu, Z.C., et al., Journal of Solid State Chemistry, (8): p [10] Xu, W.; Wang, Y.; Bai, X.; Dong, B.; Liu, Q.; Chen, J.; and Song, H.; Controllable synthesis and size-dependent luminescent properties of YVO4:Eu3+ nanospheres and microspheres. J. Phys. Chem. C 114 (2010)