FUNDAÇÃO EDUCACIONAL MIGUEL MOFARREJ FACULDADES INTEGRADAS DE OURINHOS MEDICINA VETERINÁRIA

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1 FUNDAÇÃO EDUCACIONAL MIGUEL MOFARREJ FACULDADES INTEGRADAS DE OURINHOS MEDICINA VETERINÁRIA EFEITO SEDATIVO DE UM NEUROPEPTÍDEO DERIVADO DA CROTOXINA (CTX) EM EQUINOS. MARILIA D ELIA ENÉAS OURINHOS - SP 2016

2 MARILIA D ELIA ENÉAS EFEITO SEDATIVO DE UM NEUROPEPTÍDEO DERIVADO DA CROTOXINA (CTX) EM EQUINOS. Trabalho de Conclusão ao Curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos, como pré-requisito para obtenção do Título de Bacharel em Medicina Veterinária. Orientador: Prof. Dr. Caio José Xavier Abimussi OURINHOS - SP 2016

3 Eneas, Marilia D Elia Efeito sedativo de um neuropeptídeo derivado da crotoxina (CTX) em equinos / Marilia D Elia Eneas - Ourinhos, SP: FIO f.; 30cm Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de Medicina Veterinária) - Faculdades Integradas de Ourinhos, Orientador: Prof. Dr. Caio José Xavier Abimussi 1.Crotalfina 2. Equinos 3.Sedação Efeito sedativo de um neuropeptídeo derivado da crotoxina (CTX) em equinos.

4 MARILIA D ELIA ENÉAS EFEITO SEDATIVO DE UM NEUROPEPTÍDEO DERIVADO DA CROTOXINA (CTX) EM EQUINOS. Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção do Título de Bacharel, no Curso de Medicina Veterinária das Faculdades Integradas de Ourinhos. Ourinhos 15 de Dezembro de 2016 Prof. Dr. Cláudia Yumi Matsubara Rodrigues Ferreira Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Caio José Xavier Abimussi Prof. Dra. Beatriz Perez Floriano Prof. Dra. Fernanda Saules Ignácio

5 DEDICATÓRIA Aos meus pais Edilene e Fernando, meu irmão Pedro, meus avós Lúcia, Arthur, Roberto e Dirce e ao meu namorado Luca, que estiveram ao meu lado, nos momentos bons e ruins que passei nesses últimos anos. Sempre me apoiando e incentivando.

6 AGRADECIMENTO Primeiramente agradeço a Deus que me iluminou e abençoou nos momentos difíceis e me deu forças para poder seguir minha caminhada durante esses anos. Agradeço meus pais Edilene e Fernando que fizeram o possível e o impossível para que eu conseguisse chegar até aqui. Obrigada por tudo. Amo muito vocês! Agradeço meu irmão Pedro pela paciência comigo, que mesmo não entendendo nada, me escutou estudando para as provas e seminários e sempre esteve do meu lado em todas situações me incentivando. Família, só nós sabemos o que enfrentamos nestes últimos anos. Deus vai fazer com que tudo se encaixe no seu devido lugar. Sempre estaremos juntos no que o outro precisar. Obrigada por tudo. Agradeço meus vovozinhos e vovozinhas que sempre foram mais que presentes em toda minha vida, me ajudando em tudo o que precisei e me apoiando nesta caminhada, acreditando em meu potencial. Lúcia e Arthur, Roberto e Dirce. Vocês são mais do que meus pais duas vezes! Devo minha vida a vocês! Agradeço ao meu namorado Luca, que mesmo far far away me apoiou, conversou e me motivou em todas as escolhas que fiz nestes anos. Obrigada pela confiança, respeito e carinho. Sinto falta da sua pessoa por perto. Te amo jovem. Agradeço meu orientador Prof. Dr. Caio J. X. Abimussi por ter aceitado ser meu orientador desde que busquei aprender um pouco mais sobre anestesiologia. Agradeço-lhe por ter me direcionado durante a execução deste projeto, para que este pudesse ter sido realizado até o final. Obrigada pela paciência, dedicação, ensinamentos, broncas e confiança durante estes anos da minha graduação. Agradeço a Prof. Dra. Beatriz P. Floriano por ter me auxiliado na parte estatística do projeto e em meu estágio com seus ensinamentos. Muito obrigada. Agradeço a Dra. Gisele Picolo por ter fornecido a Crotalfina, juntamente com o Instituto Butantan e ter aceitado fazer parte do projeto. Agradeço a todos que de alguma forma me auxiliaram na execução do projeto, professores, estagiários, alunos, funcionários, obrigada pelo apoio. Ricardo muito obrigada por buscar e levar as éguas todos os dias. Agradeço minha amiga Mayara pelo companheirismo em momentos bons e ruins que passamos nestes anos, pelas conversas, que sempre fizeram eu me acalmar e rir muito. Obrigada pela paciência. Agradeço todo o pessoal do Hospital Veterinário Bicho da Gente, vets e funcionários, obrigada pelo carinho durante estes anos do meu estágio. Agradeço também os residentes, Pgs e professores da UNESP Araçatuba e Unesp Botucatu, que me ensinaram sempre com muita paciência durante todo meu estágio. Por fim agradeço as minhas louquinhas que com paciência e calma (quase sempre rs) fizeram com que eu aprendesse muito sobre como lidar com vocês. Ibily, Castanha, 300 (Esparta), Zazá, 289, 295. Meu sincero agradecimento a vocês éguas que passaram na minha vida não só para o projeto, mas para um aprendizado para sempre. Agradeço a todos os animais que participaram da minha formação, sempre com os rabinhos abanando felizes, pedindo carinho, latindo, miando, arranhando, mordendo, puxando o cabelo ou dando coices enfim aprendi com todos. A todos obrigada por tudo!

7 RESUMO Foi realizado um estudo com o uso de um peptídeo derivado da Crotoxina (CTX) para avaliação de seu efeito sedativo em equinos, denominado Crotalfina, por ser um agonista kappa (κ), em comparativo com demais sedativos já utilizados na rotina hospitalar. Foram utilizadas seis éguas com idade média de 8 anos e peso médio de 415 kg, alocadas em três grupos distintos: GA (Grupo Acepromazina: 0,05 mg/kg IV), GC (Grupo Crotalfina: 0,01 µg/kg IV) e GX (Grupo Xilazina: 1 mg/kg IV). O hemograma foi utilizado como critério de seleção de animais hígidos para o estudo. Todos os animais participaram dos três grupos respeitando um intervalo entre os tratamentos de sete dias. Os animais foram mantidos em jejum alimentar durante 12 horas e hídrico por duas horas. Foi avaliada a sedação dos animais em um período total de uma hora, sendo momento basal (Mb) e o momento 60 (M60). Visando investigar o uso da Crotalfina em busca de avaliar a duração da sedação, além de mensurar quaisquer alterações fisiológicas. No grupo GX, a frequência cardíaca reduziu 70% e 65% comparado ao basal (40 ± 8) em M5 e M10 respectivamente. A AC no GA reduziu comparado ao Mb (127 ± 8) 21,25%, 19,68% e 27,55% em M10, M30 e M60 respectivamente. No GC, a AC reduziu 14,17% em M10 e 14,96% em M5, comparado Mb (127 ± 7), e em GX, comparado ao basal (126 ± 3), reduziu 57,93%, 58,73% e 53,96%, respectivamente em M5, M10 e M15. A TR no M1 (37,2 ± 0,2) em GA diferiu de M15 (36,6 ± 0,5), M30 (36,5 ± 0,6) e M60 (36,5 ± 0,8). Entre grupos, a TR no GC no M30 (37,4 ± 0,6) e M60 (37,4 0,4) diferiu de GA, e no GX, os valores de M15 (37,5 ± 0,4) diferiram de GA. Não houve alterações da frequência respiratória entre grupos e momentos. Não se obteve escore sedativo acima de zero no GC. O uso da Crotalfina na dose estudada pela via intravenosa não promoveu sedação e tampouco alterou os parâmetros avaliados, quando comparada aos demais fármacos estudados. Palavras chave: Crotalfina, equino, sedação.

8 ABSTRACT A study was carried out with the use of a Crotoxin-derived peptide (CTX) to evaluate its sedative effect in horses, called Crotalfina, as a kappa agonist (κ), in comparison with other sedatives already used in the hospital routine. Six mares with mean age of 8 years and mean weight of 415 kg were used, allocated in three different groups: GA (Acepromazine Group: 0.05 mg / kg IV), GC (Crotalfine Group: 0.01 μg / kg IV) And GX (Xylazine group: 1 mg / kg IV). The hemogram was used as a criterion for selection of healthy animals for the study. All the animals participated in the three groups, respecting an interval between treatments of seven days. The animals were fasted for 12 hours and hydrated for two hours. Sedation of the animals was evaluated over a total period of one hour, baseline (Mb) and moment 60 (M60). Aiming to investigate the use of Crotalfina in order to evaluate the duration of sedation, besides measuring any physiological changes. In the GX group, heart rate decreased 70% and 65% compared to baseline (40 ± 8) in M5 and M10 respectively. AC in GA reduced compared to Mb (127 ± 8) 21.25%, 19.68% and 27.55% in M10, M30 and M60 respectively. In CG, CA reduced 14.17% in M10 and 14.96% in M5, compared to Mb (127 ± 7), and in GX, compared to baseline (126 ± 3), it reduced 57.93%, % And 53.96%, respectively in M5, M10 and M15. The TR in M1 (37.2 ± 0.2) in GA differed from M15 (36.6 ± 0.5), M30 (36.5 ± 0.6) and M60 (36.5 ± 0.8). Among groups, TR in the GC at M30 (37.4 ± 0.6) and M60 ( ) differed from GA, and in GX, M15 values (37.5 ± 0.4) differed Of GA. There were no changes in respiratory rate between groups and moments. There was no sedative score above zero in the GC. The use of Crotalfina at the dose studied by the intravenous route did not promote sedation nor did it alter the parameters evaluated, when compared to the other drugs studied. Keywords: Crotalfina, equine, sedation.

9 SUMÁRIO CAPÍTULO I RELATÓRIO DE ESTÁGIO UNESP ARAÇATUBA UNESP BOTUCATU...14 CAPÍTULO II TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Introdução Objetivos Hipótese Revisão de literatura Fenotiazínicos Alfa-2 agonistas Opioides Material e Métodos Extrapolação da dose de Crotalfina por alometria Diluição da Crotalfina Animais Parâmetros avaliados Estatística Resultados Frequência Cardíaca Altura da cabeça Temperatura Retal Frequência Respiratória Discussão Conclusão Referências...34

10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AC bpm CAM cm CRF CTX f FC FIO FMVA FMVZ GA GC GX kcal kg mg ml MPA mpm ng TR UNESP Altura da cabeça Batimentos por minuto Concentração alveolar mínima Centímetros Crotalfina Crotoxina Frequência respiratória Frenquência cardíaca Faculdades Integradas de Ourinhos Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Grupo Acepromazina Grupo Crotalfina Grupo Xilazina quilocaloria quilograma Miligrama Mililitros Medicação pré- anestésica Movimentos por minuto Nanograma Temperatura retal Universidade Estadual Paulista µl Microlitro µg Micrograma

11 11 1 CAPÍTULO - RELATÓRIO DE ESTÁGIO 1.1 UNESP Araçatuba O primeiro estágio curricular foi realizado na Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba - FMVA UNESP, nas dependências do Hospital Veterinário Luiz Quintiliano de Oliveira na cidade de Araçatuba- SP no setor de anestesiologia, durante o mês de agosto de A estrutura física do hospital, conta com uma recepção,uma farmácia, uma sala própria para triagem dos casos novos, ambulatórios da clínica médica e da clínica cirúrgica de pequenos animais, sala de fluidoterapia, duas salas de MPA - medicação pré-anestésica, cinco centros cirúrgicos, sendo dois usados habitualmente na rotina e os demais específicos para os setores: reprodução, oftalmologia e odontologia, além da sala de emergência. O hospital também conta com uma farmácia, uma sala de diagnóstico por imagem contendo o aparelho de raio-x, uma sala de cardiologia contendo eletrocardiograma e ecocardiograma. O hospital na área de grandes animais continha um centro cirúrgico, uma baia de indução anestésica, troncos de contenção, baias de recuperação, baias de internamento e piquetes para os animais. Os animais eram encaminhados ao setor de anestesiologia, quando necessitavam de intervenção cirúrgica, analgesia ou sedação. Primeiramente o exame físico era realizado, os exames complementares como hemograma, bioquímico, eletrocardiograma e raio-x eram avaliados em seguida. Então a medicação era realizada de acordo com o quadro do animal e o mesmo seguia para o procedimento a ser feito. Haviam cinco residentes e três professores do setor de anestesiologia que acompanhavam a rotina de pequenos e grandes animais. Neste estágio acompanhei a rotina do hospital veterinário, realizando avaliação pré anestésica, discussão dos protocolos anestésicos, canulação de veias e artérias, bloqueios locais, intubação orotraqueal, monitoração do paciente e acompanhamento dos animais na recuperação anestésica. A maior casuística durante esse mês de estágio em agosto foi de procedimentos no centro cirúrgico e procedimentos ambulatoriais em pequenos animais. A rotina em grandes animais e silvestres é pequena.

12 12 De pontos positivos a serem destacados, sendo a estrutura do hospital em relação aos recursos oferecidos ao paciente, desde medicações, aparelhagens de monitoração até o acompanhamento do paciente até de finais de semana. De pontos negativos é de que a rotina de grandes animais e em silvestres é pequena, o hospital de pequenos animais não possui internação e não possui atendimento 24 horas. Foto 1: Área externa do Hospital Veterinário (A), Ambulatório do setor de clínica cirúrgica de pequenos animais (B), Sala de emergência do setor de clínica cirúrgica de pequenos animais (C), Sala de fluidoterapia dos setores de clínica médica e clínica cirúrgica de pequenos animais (D) FMVA - Unesp. A C B D Fonte: Arquivo pessoal, 2016

13 13 Foto 2: Centro cirúrgico de odontologia (A), Centros cirúrgicos (B,C,D) FMVA Unesp. A C B D Fonte: Arquivo pessoal, Foto3: Sala de medicação pré anestésica (MPA) de pequenos animais (A), baias de internamento de grandes animais (B), centro cirúrgico de grandes animais (C), baia de recuperação anestésica de grandes animais (D) FMVA - Unesp. A C B D Fonte: Arquivo pessoal, 2016.

14 UNESP Botucatu O segundo estágio curricular foi realizado na Faculdade de Medicina Veterinária de Botucatu - FMVZ - UNESP, nas dependências do Hospital Veterinário na cidade de Botucatu- SP no setor de anestesiologia, durante o mês de setembro e outubro de A estrutura física do hospital havia no setor cirúrgico, quatro centros cirúrgicos de pequenos animais, sendo um da oftalmologia, uma sala de indução anestésica e uma sala de medicação pré-anestésica (MPA). Três ambulatórios de atendimento, sendo que um é o local da fluidoterapia. No setor da reprodução havia um centro cirúrgico de pequenos animais, uma sala de medicação pré-anestésica (MPA), dois ambulatórios. No setor de cirurgia de grandes animais existem dois troncos de contenção, e dois centros cirúrgicos. O setor de anestesiologia atendia os animais quando os demais setores encaminhavam o animal, realizando o pedido pelo sistema online, quando os mesmos necessitavam de analgesia, sedação ou intervenção cirúrgica. Assim que o animal era encaminhado no sistema, os exames complementares como hemograma, bioquímico, radiografia, ultrassonografia, eletrocardiograma e ecocardiograma entre outros exames e os dados do animal como peso e idade, eram avaliados pelo residente da anestesiologia responsável pelo animal e então o exame físico era realizado. A medicação era realizada de acordo com a situação do quadro clínico que o animal se apresentava e então após a medicação fazer efeito o mesmo era encaminhado para o setor do procedimento a ser realizado. Haviam seis residentes e três professores do setor de anestesiologia que acompanhavam a rotina de pequenos e grandes animais além de animais silvestres. Neste estágio acompanhei a rotina do hospital veterinário, realizando avaliação pré anestésica, discussão dos protocolos anestésicos, canulação de veias e artérias, intubação traqueal, monitoração do paciente e acompanhamento dos animais na recuperação anestésica. A maior casuística durante esse mês de estágio em setembro e outubro foi de procedimentos no centro cirúrgico e procedimentos ambulatoriais em pequenos animais. A rotina em grandes animais e silvestres é menor do que a de pequenos.

15 15 De pontos positivos a serem destacados, sendo a estrutura do hospital em relação aos recursos oferecidos ao paciente, desde medicações, aparelhagens de monitoração até o acompanhamento do paciente até de finais de semana. Os grandes animais que sofrem intervenção cirúrgica permanecem sobre observação do residente durante toda a noite, feriados e finais de semana até completa alta do paciente. De pontos negativos é de que existe uma falha na comunicação entre os setores, fazendo com que alguns procedimentos fossem cancelados com frequência, por falta de jejum dos animais, falta de exames complementares e outros empecilhos. As medicações pré anestésicas são separadas para a aplicação sem a confirmação que o animal irá comparecer ao procedimento ou que a avaliação pré anestésica seja realizada, para a real confirmação de que o animal pode receber aquele fármaco já instituído. Havendo um desperdício de medicações e materiais relativamente alto. A rotina de grandes animais e em silvestres é menor, e o hospital de pequenos animais não possui internação e não atende 24 horas, fazendo com que os animais que passaram por procedimentos cirúrgicos simples ou complexos fossem encaminhados para internamento em clínicas particulares. Foto 4: Centros cirúrgicos (A, D), ambulatório de atendimento- clínica cirúrgica de pequenos animais (B), ambulatório de pequenos procedimentos cirúrgicos (C), FMVZ - Unesp. A C B D Fonte: Arquivo pessoal, 2016.

16 16 Foto 5: Sala de fluidoterapia da clínica cirúrgica de pequenos animais (A), sala de medicação pré anestésica de pequenos animais (B) - FMVZ - Unesp. A B Fonte: Arquivo pessoal, Foto 6: Baias de medicação pré anestésica da clínica cirúrgica de grandes animais (A), baia de indução anestésica (B), centro cirúrgico de grandes animais (C), Ressonância magnética (D) - FMVZ - Unesp. A C B D Fonte: Arquivo pessoal, 2016.

17 17 2 CAPÍTULO - TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO 1.Introdução A sedação em equinos é na maioria das vezes necessária para a realização de procedimentos rápidos com baixo intensidade de dor. Também é utilizada devido ao porte e natureza do equino, onde o manejo inadequado durante o procedimento pode se tornar potencialmente perigoso para o animal, para o Medico Veterinário e para sua equipe (ROSA, 2009). O uso de fármacos para a sedação em equinos deve possuir como característica uma pequena latência e uma progressão contínua dos efeitos farmacológicos no animal. Fármacos ideais a serem utilizados nesta espécie são os que necessitam de poucas quantidades e que possuam como efeito principal a tranquilização, além de relaxamento muscular e analgesia. É importante que estes medicamentos não alterem significativamente os parâmetros fisiológicos do animal, principalmente o cardiorrespiratório e também proporcionem uma recuperação tranquila, livre de excitação e complicações (LAM, 2005). Alguns fármacos derivados opioides, como a petidina, podem causar excitação em equinos devido a sua característica farmacológica por atuação em receptor mu. Para isso a associação de sedativos a estes agentes opioides é utilizada na anestesiologia veterinária. Os mais rotineiramente empregados são os derivados fenotiazinicos e os agonistas alfa-2 adrenérgicos, como agentes de sedativos (SILVA JÚNIOR, 2009). Diferentes classes de fármacos podem ser utilizadas para tratamento da dor em equinos, sendo os opioides e os anti-inflamatórios não esteroidais os fármacos mais utilizados para esta finalidade (GÓRNIAK, 1996). Há relatos de Vital Brazil, entre 1930 e 1940, sugerindo que o veneno de cascavel provavelmente possuiria um fator analgésico, devido às vítimas dos acidentes crotálicos não se queixarem de dor severa (SOUSA E SILVA et al., 1996; PICOLO, 2003). Com o auxílio de novas tecnologias e pesquisas foi possível isolar e sintetizar o fator analgésico presente no veneno crotálico, então denominado crotalfina. A partir de então este fármaco foi considerado como um opioide, pois atua centralmente e em receptores kappa (GIORGI et al., 1993; PICOLO et al., 1998; BRIGATTE et al., 2001).

18 Objetivos O presente estudo visa investigar o uso da Crotalfina por via intravenosa, em busca de avaliar a duração da sedação, além de mensurar quaisquer alterações fisiológicas nos parâmetros. Perante os estudos disponíveis na literatura, este trabalho justifica-se na necessidade de fundamentar o Crotalfina como sedativo em equinos saudáveis, comparando seus efeitos sedativos com os de outros fármacos comumente utilizados, uma vez que não há estudos sobre o fármaco com a finalidade sedativa. 1.2 Hipótese O uso da Crotalfina por via endovenosa em equinos hígidos não alterará os parâmetros fisiológicos dos animais e possui uma atividade sedativa significativa para o uso na rotina de procedimentos rápidos ou como medicação pré- anestésica.

19 19 2. Revisão de literatura Associações de medicamentos com características sedativas e analgésicas são utilizadas com frequência em medicina veterinária, devido a obtenção de maior grau de sedação e analgesia (HALL, 2001). Ainda, grande parte dos fármacos utilizados com a finalidade sedativa produzem relaxamento muscular e podem ser utilizados como medicação pré-anestésica (FANTONI & CORTOPASSI, 2002). Existe uma preocupação com uso isolado de fármacos sedativos e associados a opioides em equinos, devido a predisposição destes animais em apresentarem alterações comportamentais com estas medicações. Por isso a utilização de novas metodologias de avaliação da sedação vem sendo aplicadas para reduzir estas alterações (TAYLOR et al., 2002; TAYLOR, 2003). Os sinais indicativos de sedação em equinos são caracterizados pelo abaixamento de cabeça, ptose de lábios e pálpebras e irreponsividade a ruídos (NATALINI et al., 2008), podendo diminuir a propriocepção com consequente ataxia (RABELO et al., 2008). 2.1 Fenotiazínicos Na busca de medicações que causem tranquilização e relaxamento muscular para o uso como medicações pré-anestésicas, os fenotiazínicos se destacam (MARROUM et al., 1994). Os efeitos cardiovasculares dos fenotiazínicos são ocasionados pelo bloqueio da transmissão α-1 andrenérgica e podem proceder em hipotensão pela vasodilatação periférica, sendo que esta hipotensão na maioria das vezes é dose dependente e pode levar a taquicardia reflexa em decorrência da diminuição da resistência vascular periférica, diminuição de 20-30% do hematócrito por sequestro sanguíneo esplênico (HALL & CLARKE, 2001; DOHERTY & VALVERDE, 2006; MUIR & HUBBELL,1991; PAWSON, 2010), além da diminuição da temperatura corporal e da pequena depressão respiratória (GEISER, 1990). O débito cardíaco não se altera em equinos acordados e hígidos (DOHERTY & VALVERDE, 2006). O efeito tranquilizante causado por esta classe de fármacos faz com que os animais não percam a resposta a estímulos externos, como o som de outros animais e ruídos altos (TRANQUILLI & THURMON 2007).

20 20 Segundo Taylor & Clarke (2007) e Doherty & Valverde (2006), os fenotiazínicos, apesar de não possuírem um efeito analgésico e não diminuírem a dose anestésica intravenosa, suavizam a indução e a recuperação anestésica. Além deste benefício, diminuem significantemente a CAM do isofluorano em média 30%, bem como a dose analgésica de um opioide. Os fenotiazínicos podem também causar com frequência prolapso peniano, com grau e tempo dose dependentes, sendo necessária cautela de seu uso em garanhões, pois o efeito pode ser permanente (TRANQUILLI & THURMON, 2007). Dentre seus efeitos promove ptose palpebral e abaixamento cabeça em equinos (BOOTH & MCDONALD, 1992). Além dessas características, apresenta outros efeitos, dentre eles a atividade imunomoduladora, antioxidante e antinflamatória (SANDERSEN, 2011). Também é o relatado efeito anti emético por inibirem os receptores dopaminérgicos da zona deflagradora, mas o efeito é irrelevante em equinos (DOHERTY & VALVERDE, 2006). A acepromazina é o fenotiazínico mais empregado em equinos nas doses de 0,03 a 0,05 mg/kg/iv ou IM (LUNA & TEIXEIRA NETO, 2008). 2.2 Alfa-2 agonistas Os agonistas alfa-2 adrenérgicos são os fármacos mais antigos utilizados para produzir sedação e analgesia em equinos, sendo os mais utilizados, xilazina, detomidina e romifidina (MASON, 2004) e ainda lhes são atribuídos um bom relaxamento muscular (MOENS et al., 2003). O uso destes fármacos como medicação pré-anestésica parece ter influência na qualidade de recuperação, desde que o tempo de anestesia não seja maior que o tempo de duração do agonista alfa- 2-adrenérgico (VALVERDE et al., 2013). O mecanismo de ação dos fármacos classificados como agonistas alfa-2 adrenérgicos é caracterizado pela ligação dos receptores adrenérgicos no sistema nervoso central e periférico, impedindo a liberação de noradrenalina por meio da inibição do influxo de íons cálcio na membrana neuronal. Os alfa-2 adrenorreceptores centrais são pré-sinápticos e similares aos periféricos, porém, na musculatura lisa vascular, esses receptores têm localização pós-sináptica e, quando estimulados, promovem vasoconstrição (MASON, 2004; SPINOSA; GORNIAK, 2006).

21 21 Os agonistas alfa-2-adrenérgicos têm sido usados frequentemente para melhorar a qualidade de recuperação anestésica de equinos após anestesia inalatória (SANTOS et al., 2003). Estes fármacos agonistas α-2 adrenérgicos possuem alguns efeitos colaterais como bradicardia, redução de ADH (hormônio antidiurético), vasoconstrição periférica e redução da atividade elétrica e mecânica do estômago, intestino delgado, ceco, cólon maior e menor, porém possui o mínimo efeito nas porções proximais do trato gastrointestinal dos equinos (PESTEAN et al., 2010; VALVERDE & GUNKEL, 2005; MANOLE; GRAHAM, 2002), também podem causar sudorese e midríase nos equinos (ELFENBEIN et al., 2009; STEFFEY, et al., 2000), outros efeitos observados são de ataxia, ptose labial, glicosúria e aumento da tonicidade uterina, além de hiperglicemia (MUIR; HUBBELL, 1991; WILSON et al., 2002). A motilidade gastrointestinal pode ser reduzida com administração de xilazina (RUCKEBUSCH, 1987), incluindo a motilidade do ceco e cólon (RUTKOWSKI et al., 1989). Dentre os fármacos alfa-2 agonistas mais utilizados em equinos podemos destacar a detomidina, xilazina e romifidina, as doses utilizadas são de 0,01-0,03 mg/kg, 0,05-2,0mg/kg e 0,06-0,1 mg/kg respectivamente (NATALINI, 2007). A xilazina foi inicialmente sintetizada na Alemanha, em 1962, com a finalidade de controle da hipertensão, sendo também utilizada na sedação de animais (MOENS, 2000). Trata-se do fármaco da classe mais utilizado porque em baixas doses prolonga menos a recuperação e causa menores alterações cardiorrespiratórias que romifidina e detomidina em doses equipotentes (IDA et al., 2011). 2.3 Opioides Os opioides são fármacos eletivos para o tratamento da dor em todas espécies de mamíferos. Embora seu uso em pequenos animais seja convencional sem alterações comportamentais, a utilização em equinos é limitada devido a grande possibilidade de excitação nesta espécie (TOBIN et al. 1979a; TOBIN et al. 1979b; BOSCAN et al. 2006). A classificação dos opioides é realizada de acordo com sua ação em receptores, que são classificados em agonistas µ (morfina, metadona, fentanil, meperidina e tramadol), agonista k antagonista µ (butorfanol, nalbufina), Agonista

22 22 parcial μ e antagonista k (buprenorfina) e antagonista (naloxona) (ANDRADE, 2002). Os receptores µ causam analgesia supra-espinhal, depressão respiratória e euforia, já os opioides com receptores k geram analgesia medular, miose, sedação e disforia (GÓRNIAK, 2006). Os efeitos sedativos dos opioides resultam da interação com receptores μ e k, porém diferentes fatores podem colaborar para o efeito do fármaco como: tipo do receptor ativado, dosagem, diferenças farmacocinéticas além da resposta individual de cada animal (MUIR et al., 2001). Na maioria das vezes receptores opioide k, geram efeitos sedativos (ARGUEDAS et al. 2008), além deste efeito, podem produzir analgesia com menor estímulo locomotor e simpático do que os opioides de estimulação em receptores μ (BENNETT & STEFFEY, 2002). Dentre os opioides mais utilizados em equinos possuímos o butorfanol e a morfina utilizados nas doses de 0,1 mg/kg de butorfanol, pode ocorrer diminuição dos borborigmos e no trânsito fecal e constipação. Já com a morfina, na dose de 0,4 mg/kg ou mais, foi relatado diminuição significativa do trânsito gastrointestinal em pôneis (MALONE e GRAHAM 2002). Estudos recentes relataram um peptídeo ácido sintetizado de 14 aminoácios chamado crotalfina, sendo um composto de efeito antinociceptivo (GUTIERREZ et al, 2008;. KONNO et al., 2008). Estes aminoácidos são baseados na estrutura cascavel da América do Sul Crotalus durissus terrificus e são baseados na ativação de receptores opioides (KONNO et al., 2008). Baseado nos resultados de um estudo realizado em equinos com as doses de 1,4-3,8 ng/kg, (GUIRRO, 2008) não foi evidenciado nenhum efeito colateral do fármaco em questão na espécie. Os experimentos pré-clínicos confirmaram que a crotalfina produz uma potente e prolongada analgesia em roedores e sem efeitos colaterais marcantes (GIORGI et al., 1993; PICOLO et al.,1998; PICOLO et al., 2000; BRIGATTE et al., 2001; PICOLO & CURY, 2004; NUNES et al., 2007), fazendo com que uma perspectiva seja criada para o uso deste fármaco em outras espécies animais.

23 23 3 Material e métodos O presente estudo foi realizado nas dependências do Hospital Veterinário Roque Quagliato das Faculdades Integradas de Ourinhos - FIO, após aprovação junto ao Comitê de Ética local sob protocolo número 002/ Extrapolação da dose de Crotalfina por alometria A dosagem da Crotalfina para os equinos (0,01 µg/kg) foi estabelecia por meio de extrapolação alométrica (PACHALY, 2006) a partir da dose realizada em ratos de aproximadamente 200 g, (0,048 µg/kg) sendo o equino o animal alvo e rato o animal conhecido (BRIGATTE, 2013). A partir do peso metabólico, da taxa metabólica basal e específica dos animais conhecido e alvo, foi possível a identintificação da dosagem da crotalfina. A dosagem final desta alometria realizada a partir da informação de doses utilizadas e que não houve efeitos colaterias marcantes em estudos realizados com ratos e cavalos. 3.2 Diluição da crotalfina A partir da dosagem estabelecida pelo método alométrico, a solução inicial em forma liofilizada que se apresentava na temperatura de -20 C foi diluída em capela de fluxo laminar, mantida por 30 minutos com luz UV antes de início do processo. Em seguida o bico de Bunsen foi aceso dentro da capela, com o auxílio de um acendedor automático. Para esta diluição o manipulador se apresentava paramentado com luvas estéreis, touca e máscara, com a finalidade de não possuir contaminação durante o procedimento. O frasco com a solução contendo 1mg (liofilizado) foi diluída em 1 ml de água estéril, adicionado com uma seringa agulhada. Em seguida a diluição final permaneceu 1:10 e mantendo a concentração final de 100µg/mL. Estes 10mL foram divididos em 10 alíquotas em eppendorfs sendo cada uma de 1 ml. Todas as alíquotas foram mantidas isoladas em um freezer mantido -20 C sendo a temperatura verificada a cada 12 horas todos os dias. Após descongelada a alíquota foi utilizada e descartada.

24 Animais Foram utilizados seis equinos fêmeas, de variadas raças, com idade entre 3 e 15 anos (média 8 anos), com peso médio de 415 kg, pertencentes à Fazenda Experimental das Faculdades Integradas de Ourinhos- FIO. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e colheita de sangue venoso pela jugular, para exames laboratoriais (hemograma completo), com o intuito da confirmação do estado de higidez. Foi considerado como critério de exclusão os animais que apresentassem alterações hematológicas, alterações clínicas, submetidos a tratamento em andamento ou fêmeas gestantes. Após confirmação da sanidade dos animais, os mesmos foram alocados em três grupos de maneira aleatória, por crossover e encoberta, como descrito abaixo: GA (grupo acepromazina) - dose 0,05 mg/kg - IV GC (grupo crotalfina) - dose 0,01 µg/kg - IV CX (grupo xilazina) - dose 1 mg/kg - IV 3.4 Parâmetros avaliados Foram avaliados os parâmetros frequência cardíaca (FC) em batimentos por minuto (bpm), frequência respiratória (f) em movimentos por minuto (mpm), temperatura retal (TR) em graus Celsius ( o C), altura da cabeça ao solo (AC) em centímetros (cm) e ataxia. Para tanto foram considerados os momentos, onde os números refletem os minutos a partir do momento do tratamento: Momento basal (Mb): imediatamente antes do tratamento; Momento 1 (M1): um minuto após o tratamento; Momento 5 (M5): cinco minutos após o tratamento; Momento 10 (M10): dez minutos após o tratamento; Momento 15 (M15): quinze minutos após o tratamento; Momento 30 (M30): trinta minutos após o tratamento; Momento 60 (M60): sessenta minutos após o tratamento.

25 25 Foto 7: Fita métrica no tronco para aliação da altura da cabeça do animal. Fonte: Arquivo pessoal, A altura da cabeça foi avaliada por meio de uma fita métrica fixada no tronco de contenção, a partir do lábio inferior do animal (Foto 7). A ataxia e o escore de sedação foram realizados por meio de uma tabela com pontuações (tabela 1). Tabela 1: Representação em escala numérica descritiva para mensuração dos graus de ataxia. Grau- ataxia Descrição 0 Nenhuma ataxia aparente. 1 Ataxia leve, animal estável, mas balança discretamente. 2 3 Ataxia moderada, o animal balança e se apóia frequentemente no tronco de contenção. Ataxia intensa, o animal balança e se apóia no tronco constantemente, cruza membros torácicos e/ou pélvicos podendo flexioná-los na articulação do carpo ou tarso.

26 26 4 ESTATÍSTICA Após a coleta de dados, os mesmos foram tabulados no Microsoft Excel e copiados para o Programa GraphPad Prism 5 para a análise estatística. Inicialmente, todas as variáveis foram submetidas ao teste de normalidade de Shapiro- Wilk sob 5% de significância. Variáveis que apresentaram distribuição normal (temperatura retal) foram analisadas por meio de análise de variância com medidas repetidas seguidas de teste de Tukey e as variáveis que não apresentaram distribuição normal (frequência cardíaca, frequência respiratória, distância da cabeça ao solo e ataxia) foram analisadas por teste de Friedman seguido de teste de Dunn. Todos os testes foram realizados sobre 5% de significância, ou seja, os dados foram consideradosestatisticamente significantes quando p<0,05.

27 27 5 RESULTADOS 5.1 Frequência cardíaca Os valores de FC no GX foram reduzidos em 70% e 65% em relação ao basal (40 ± 8) em M5 e M10 respectivamente. Ainda no valor da frequência cardíaca houve diferença entre os grupos do GX, para o GA em M10 (Tabela 2). 5.2 Altura da cabeça A AC no GA reduziu comparado ao basal (127 ± 8) 21,25%, 19,68% e 27,55% nos momentos M10, M30 e M60 respectivamente. No GC, a AC reduziu 14,17% em M10 e 14,96% em M5, comparado ao basal (127 ± 7), e em GX, comparado ao basal (126 ± 3), reduziu 57,93%, 58,73% e 53,96%, respectivamente em M5, M10 e M15 (Tabela 2). 5.3 Temperatura retal A TR no M1 (37,2 ± 0,2) em GA diferiu de M15 (36,6 ± 0,5), M30 (36,5 ± 0,6) e M60 (36,5 ± 0,8). Entre grupos, a TR no GC no M30 (37,4 ± 0,6) e M60 (37,4 ± 0,4) diferiu de GA, e no GX, os valores de M15 (37,5 ± 0,4) diferiram de GA (Tabela 2). 5.4 Frequência respiratória Não houve alterações entre grupos e momentos (Tabela 2). Tabela 2 Parâmetros fisiológicos avaliados em seis éguas antes (MB) e após serem submetidas à sedação com Acepromazina (GA) IV, Crotalfina (GC) IV ou Xilazina (GX) IV antes (MB) durante 60 minutos (M1 a M60). Variável FC (bpm) f (mpm) AC (cm) TR ( C) Grupo Momentos de avaliação MB M1 M5 M10 M15 M30 M60 GA 43 ± ± ± 7 43 ± 8 41 ± 8 40 ± 8 37 ± 5 GC 39 ±17 38 ± ± 9 40 ± 7 39 ± 6 35 ± 5 37 ± 11 GX 40 ± 8 a 29 ± 8 ab 28 ± 7 b 26 ± 6 * b 28 ± 7 ab 28 ± 4 ab 34 ± 7 ab GA 21 ± 2 20 ± 6 17 ± 5 16 ± 4 15 ± 3 16 ± 5 15 ± 4 GC 22 ± ± 7 25 ± ± ± 6 21 ± 7 24 ± 8 GX 23 ± 4 19 ± 7 17 ± 3 15 ± 5 14 ± 6 14 ± 3 17 ± 4 GA 127 ± 8 a 113 ± 16 ab 110 ± 9 ab 100 ± 23 b 103 ± 16 ab 102 ± 13 b 92 ± 20 b GC 127 ± 7 a 114 ± 7 ab 111 ± 7 ab 109 ± 7 b 108 ± 9 b 110 ± 10 ab 118 ± 11 ab GX 126 ± 3 a 86 ± 43 ab 53 ± 42 b 52 ± 37 b 58 ± 26 b 66 ± 33 ab 108 ± 9 ab GA 37,1 ± 0,3 ab 37,2 ± 0,2 a 36,8 ± 0,4 abc 36,7 ± 0,6 bc 36,6 ± 0,5 c 36,5 ± 0,6 c 36,5 ± 0,8 c GC 37,1 ± 0,6 37,2 ± 0,5 37,3 ± 0,6 37,3 ± 0,5 37,3 ± 0,6 37,4 ± 0,6 * 37,4 ± 0,4 * GX 37,3 ± 0,3 37,6 ± 0,3 37,4 ± 0,4 37,4 ± 0,4 37,5 ± 0,4 * 37,1 ± 0,6 37,1 ± 0,7 * Difere significativamente do GA em um mesmo momento segundo teste de Dunn ou Tukey (p<0,05). Letras diferentes representam diferenças entre momentos segundo teste de Dunn ou teste de Tukey (p<0,05). FC = frequência cardíaca em batimentos por minuto; f = frequência respiratória em movimentos por minuto; AC= altura de cabeça até o chão em centímetros e TR= temperatura retal em graus C.

28 28 Além dos parâmetros cardiorrespiratórios e dos demais já citados, foram observados outros sinais como: trocas de apoio, micção, defecação, bocejos, flatulências, sudorese. A média de troca de apoio dos animais foi maior no GA e menor no GX, respectivamente 25,5 e 16,5. A sudorese no grupo xilazina foi negativa em 66,6% dos animais, já nos grupos acepromazina e crotalfina a sudorese foi negativa em 100% dos animais. A ptose labial foi observada em 83,3% dos animais no grupo xilazina. Já no grupo acepromazina foi obtido em 50% dos animais. No grupo crotalfina apenas um animal apresentou este parâmetro positivo (figura 8). Figura 8- Animal apresentando ptose labial. Fonte: Arquivo pessoal, No grupo xilazina foi observado 83,3% de micção dos animais. No grupo acepromazina 50% dos animais tiveram flatulências e bocejos durante o período de avaliação após a admnistração da medicação. No grupo crotalfina 100% dos animais

29 29 defecou após a aplicação da medicação, durante o período de avaliação e nos grupos xilazina e acepromazina apenas um animal defecou.

30 30 6 DISCUSSÃO Diversos fármacos podem ser utilizados para sedação em equinos, porém, a maioria deles proporciona algum efeito indesejável, fazendo com que a escolha do protocolo seja feita cautelosamente de acordo com o quadro do animal. Sendo assim, neste experimento, foi realizado um estudo comparativo entre a acepromazina, xilazina e a crotalfina. A escolha dos fármacos avaliados foi realizada considerando os fatores: facilidade de compra para uso na rotina, possibilidade de novas alternativas de associações e preço do medicamento. Muir & Mason (1993), ao avaliar o efeito da acepromazina na frequência cardíaca, notaram um aumento significativo, assim como foi observado neste estudo. Não foi observado nenhum indício de excitação nas éguas do grupo acepromazina e crotalfina, porém, a sedação observada com estes agentes não foi a esperada. Castro (1981) determinou que a dosagem de acepromazina (0,3 mg/kg iv), utilizada em seu estudo, em 11 de 20 animais testados apresentaram excitação discreta ou marcante. No presente estudo a dose utilizada foi bastante inferior à utilizada pelo autor e talvez por isso, não tenha sido observado aumento significativo da ataxia. A dose mais baixa de acepromazina utilizada neste estudo foi retirada da literatura mais recente, utilizada por Natalini, Em um estudo de SHORT (1998), afirmou que os efeitos tranquilizantes e sedativos da acepromazina se manifestaram mais acentuadamente (efeito máximo) entre 15 a 20 minutos após a administração de dosagens entre 0,02 e 0,06 mg/kg iv. No presente estudo observou-se efeito máximo mensurável entre 10 e 60 minutos, na média da distância da cabeça ao solo, na dose de 0,05 mg/kg. Opostamente, foi observado resultados esperados em relação aos animais tratados com os a-2 agonistas, proporcionando sedação adequada, como os relatos de CLARKE et al.(1991) e ENGLAND et al. (1992). Os alfa 2 agonistas causam sedação mais confiável do que os fenotiazínicos, além de serem analgésicos, o que não acorre com a acepromazina (MUIR & HUBBELL, 1991).

31 31 As observações realizadas neste estudo em relação à ataxia são contrárias às descritas por ROSCOE (2007) que não obteve diferenças significativas na ataxia apresentada pelo uso da xilazina isolada em equinos. Como altura da cabeça, os autores descrevem que utilizaram como parâmetros marcações realizadas na parede da altura em relação ao solo (QUEIROZ NETO et al.,2001; CHRISTOVÃO et al., 2006; CARREGARO et al., 2007). O utilizado neste estudo foi a fita métrica com as marcações a partir do solo. Sistema parecido com o descrito pelo autor. Roscoe (2007) e Christovão et al. (2006) mencionam que cavalos muito calmos podem mascarar o efeito das medicações administradas. Neste estudo podemos dizer que metade das éguas utilizadas eram calmas, podendo se enquadrar nestes animais citados pelos autores, que disfarçam o efeito do fármaco, desde o Mb. Elfenbein et al.,(2009); Steffey, et al., (2000), citaram que assim como ocorreu neste estudo a sudorese em animais que receberam xilazina foi presente. Muir; Hubbell, (1991); Wilson et al., (2002) Booth & Mcdonald, (1992) relataram que a ptose labial ocorreu com o uso da acepromazina e da xilazina em equinos, como aconteceu no estudo. A coloração das mucosas e o tempo de preenchimento capilar não foram alterados desde o basal até o final da avaliação assim como os relatos de ROSCOE (2007). No estudo realizado não foi avaliada a motilidade gastrointestinal, porém 100% das éguas defecaram com a administração da crotalfina, diferente dos demais grupos que apenas uma em cada grupo apresentou este parâmetro. GUIRRO, 2008 apresentou que após a administração da crotalfina apenas 83% dos animais defecou, confirmando o apresentado por THURMON et al. (1996) que concluiu que opioides podem aumentar a motilidade intestinal. Entretanto ROGER et al. (1994) houve diferença do encontrado pelo autor, que menciona os opioides de receptores agonista kappa alteram menos na taxa de defecação. Em geral os animais que receberam crotalfina não mudaram de comportamento, não apresentando grau acima de 0 de ataxia e não apresentaram diminuição da altura da cabeça ao solo. Sendo que éguas agitadas e calmas mantiveram seu comportamento. Em tese os agonistas de receptores k causam mais sedação que excitação (KAMERLING et al., 1988). O aparecimento de bocejos após

32 32 a aplicação da crotalfina ocorreu em 50% das éguas avaliadas neste estudo. O mesmo ocorreu no experimento realizado por GUIRRO (2008). Não há relato na literatura de número de trocas de apoio em animais que foram submetidos a sedação. Alguns pontos relevantes que limitaram o estudo foram o baixo número de animais que participaram do projeto (se houvessem mais animais, o estudo seria mais completo), o manejo das éguas deveria ser diferente, pois, nenhuma delas estava habituada a permanecer ao longo de uma hora no tronco de contenção após passar por um período de jejum, fazendo com que a metade das éguas permanecessem agitadas durante o período de avaliação.

33 33 7 CONCLUSÃO Após a análise clínica e estatística dos dados obtidos por meio deste estudo, podese concluir que: - Não houve alterações cardiorrespiratórias e sedativas consideráveis ao uso da Crotalfina, quando comparado aos demais fármacos sedativos habituais da rotina veterinária, utilizados neste trabalho. - Dentre os fármacos já utilizados na rotina em equinos (Acepromazina e Xilazina), a Xilazina obteve um maior nível de sedação do que o obtido pela acepromazina e da hipótese da crotalfina. -A defecação dos animais é um item a ser mais estudado com o uso da Crotalfina. Seu uso sugeriu o aumento da motilidade gastrointestinal, porém mais estudos necessitam ser realizados para que possamos afirmar esta questão. - Animais já acostumados com a contenção no tronco e um pouco menos agitados facilitaria a interpretação dos efeitos sedativos em todos os grupos de fármacos. - Existe a necessidade da realização de mais estudos sobre a crotalfina, seus sítios de ação bem como sua farmacocinética e farmacodinâmica.

34 34 8 REFERÊNCIAS ANDRADE, M.M.J. Antiinflamatórios esteroidais. In: SPINOSA, H.S.; GORNIAK, S.L.; BERNARDI, M.M. Farmacologia aplicada a Medicina Veterinária. 3a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p ARGUEDAS, M.G.; HINES, M.T.; PAPICH, M.G.; FARNSWORTH, K.D.; SELLON, D. C. Pharmacokinetics of butorphanol and evaluation of physiologic and behavioral effects after intravenous and intramuscular administration to neonatal foals. J Vet Intern Med., 2008, v. 22, p BOOTH, N.H., MCDONALD, L.E. Farmacologia e terapêutica em veterinária. 6.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,cap. 16: Analgésicos não narcóticos. 1992, p BOSCAN, P. et al. Evaluation the effects of the opioide agonist morphineon gastrointestinal tract function in horses. American Journal of Veterinary Research, 2006, v.39, p BRIGATTE, P. et al. Peripheral kappa and delta opioid receptors are involved in the antinociceptive effect of crotalphine in a rat model of cancer pain / Pharmacology, Biochemistry and Behavior, p BRIGATTE, P. et al. Tolerance to the antinociceptive effect of Crotalus durissus terrificus snake venom in mice is mediated by pharmacodynamic mechanisms. Toxicon 39, 2001, CARREGARO, A.B.; LUNA, S.P.L.; MATAQUEIRO, M. I.; QUEIROZ NETO, A. Effects of buprenorphine on nociception and spontaneous locomotor activity in horses. Am J Vet Res., 2007, v.68, n.3, p

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