UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS PRESENÇA DE PARVOVÍRUS E CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 EM FETOS NATIMORTOS E MUMIFICADOS EM DUAS GRANJAS COMERCIAIS NO MUNICÍPIO DE TAPURAH, ESTADO DE MATO GROSSO Andréia Tirloni Cuiabá-MT 2010

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3 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS PRESENÇA DE PARVOVÍRUS E CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 EM FETOS NATIMORTOS E MUMIFICADOS EM DUAS GRANJAS COMERCIAIS NO MUNICÍPIO DE TAPURAH, ESTADO DE MATO GROSSO Discente: Andréia Tirloni Orientador: Profº. Dr. João G. Caramori Jr. Co-Orientadora: Profª. Drª. Valéria Dutra Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Cuiabá-MT 2010

4 3 FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome do Autor: TIRLONI, Andréia Título: Presença de parvovírus e circovírus suíno tipo 2 em fetos natimortos e mumificados em duas granjas comerciais no município de Tapurah, Estado de Mato Grosso Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Data: Banca Examinadora Profº Dr. João Garcia Caramori Júnior Instituição: Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT Assinatura: Julgamento: Profºa Dr. Francisco Rafael Soto Instituição: Universidade de São Paulo USP Assinatura: Julgamento: Profº Dra. Gerusa Salles Corrêa Instituição: Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT Assinatura: Julgamento:

5 4 AGRADECIMENTO Agradeço a Deus por sempre estar ao meu lado. Aos meus pais, Assis e Rosani, exemplo de vida que não negaram esforços para a educação de seus filhos. As minhas irmãs, Adriane e Ariana, que de uma maneira ou outra me ampararam nas horas que mais precisei. Ao meu irmão André que juntos aprendemos a gerenciar uma suinocultura. Ao meu esposo, Ricardo, que sempre me acompanhou nesta jornada acadêmica, me apoiando e incentivando a minha carreira. Deus colocou no meu caminho esta pessoa maravilhosa, compreensiva e companheira, muito obrigada! Aos meus amigos do mestrado, foram muito importante neste período, sempre que precisei estavam dispostos a me ajudar. E em especial ao João Xavier de Oliveira Filho que me ajudou durante o experimento, sempre com palavras de incentivo e não deixando desistir. A Lívia Saab Muraro colegas desde faculdade, valeu a parceria! Ao meu orientador, João Garcia Caramori Júnior, que não negou esforços para me orientar e na realização da pesquisa. Mesmo na correria do seu dia a dia mostrou ser uma pessoa incrível. Nos momentos que esteve presente fizeram diferença em minha vida. Muito obrigada! A profa Caroline Argenta Pescador que incentivou o experimento e me ajudou no que precisei para a realização do mesmo. A profa Valéria Dutra e o prof Luciano Nakazato que cederam o laboratório de Biologia Molecular para a realização das análises e pelos ensinamentos. Ao técnico do laboratório Manuel pela ajuda na preparação das lâminas histológicas. A todos que de uma maneira ou de outra me ajudaram na realização desta etapa da minha vida.

6 5 RESUMO Presença de parvovírus e circovírus suíno tipo 2 em fetos natimortos e mumificados em duas granjas comerciais no município de Tapurah, Estado de Mato Grosso Doenças reprodutivas são uma das principais causas de perdas econômicas em criações industriais de suínos em todo o mundo. Dentre as manifestações clínicas mais freqüentes estão a presença de fetos natimortos e mumificados durante o parto. Estes podem ser por causa infecciosa ou não infecciosa. Vários estudos tem demonstrado a presença do parvovírus suíno e circovírus suíno tipo 2 como um dos agentes causadores destas perdas. No presente trabalho, objetivou identificar a presença do parvovírus (PPV) e do circovírus suíno tipo 2 (PCV2) em matrizes suínas que apresentaram fetos natimortos e mumificados em duas granjas comerciais de ciclo completo em Tapurah, estado de Mato Grosso. Foram coletadas 44 amostras sendo 29 da granja A e 15 da granja B. As amostras foram submetidas a histologia e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Nested- PCR para PCV2 e PPV, respectivamente. A presença de parvovírus suíno corresponde a 29/44 (65,9%) de matrizes positivas sendo 18/29 (62,1%) matrizes da granja A e 11/15 (73,3%) matrizes da granja B. PCV2 foi encontrado em apenas uma matriz 1/44 (2,3%). No exame histológico nenhuma alteração foi encontrada. As análises estatísticas foram realizadas através de análises descritivas dos dados. Com isso o PPV pode ser considerado como o principal agente causador de falhas reprodutivas nas granjas estudadas. Palavras-Chaves: Mumificados, natimortos, PCV2, PPV, suínos

7 6 ABSTRACT Presence of porcine parvovirus and porcine circovirus 2 in stillborn and mummification in two commercial swine farms in Tapurah, Mato Grosso State Reproductive diseases are a major cause of economic losses in industrial pig farms around the world. Among the most frequent clinical manifestations are the presence of mummified fetuses and stillborn during farrowing. These may be due to infectious or noninfectious. Several studies have shown the presence of porcine parvovirus and porcine circovirus type 2 as a causative agent of these losses. The present study aimed to identify the presence of parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2) in sows that had stillborn and mummified fetuses in two commercial farms in Tapurah complete cycle, Mato Grosso State. We collected 44 samples and 29 of the farm A and farm 15 B. The samples were subjected to histology and Polymerase Chain Reaction (PCR) and nested PCR for PCV2 and PPV, respectively. The presence of porcine parvovirus corresponds to 29/44 (65,9%) of positive sows and 18/29 (62,1%) sows of the farm A and 11/15 (73,3%) sows the farm B. PCV2 was found in only one sow 1/44 (2,3%). Histologically there were no changes. Statistical analysis was performed by descriptive analysis of data. With this, the PPV can be regarded as the major causative agent of reproductive failure in the studied farms. Keywords: Mummification, stillborn, swines, PCV2, PPV

8 7 LISTA DE TABELAS Tabela 01. Classificação das 44 fêmeas suínas de acordo com as granjas e com os grupos de produção de fetos... Tabela 2. Quantidade e porcentagem de fêmeas positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV) através da técnica 29 de PCR e nested- PCR, respectivamente... Tabela 3. Quantidade e porcentagem de fêmeas com fetos positivos e negativos para o diagnóstico de parvovírus (PPV) através da técnica 29 nested- PCR, de acordo com cada granja... Tabela 4. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested- PCR em fêmeas do grupo I (fetos natimortos) criadas em diferentes granjas Tabela 5. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested-pcr em fêmeas suínas do grupo II (fetos mumificados) criadas em diferentes granjas Tabela 6. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested-pcr em fetos de fêmeas suínas do grupo III (fetos natimortos e mumificados) criadas em diferentes granjas Pg. 28

9 8 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) Etiologia Epidemiologia e transmissão Sinais clínicos Diagnóstico Controle Parvovírus suíno (PPV) Etiologia Epidemiologia e transmissão Sinais clínicos Diagnóstico Controle MATERIAL E MÉTODOS Local do experimento Animais utilizados Coleta e envio das amostras... 24

10 9 3.4 Exame histopatológico Extração do DNA das amostras Reação em cadeia da polimerase (PCR) Análises estatísticas RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO A... 47

11 9 1 INTRODUÇÃO O Brasil é o quarto maior produtor da carne suína, com um total de 3,1 milhões de toneladas produzidas em 2008, e também o quarto maior exportador. No ano de 2009 exportou 607,49 mil toneladas, um crescimento de 14,75% em relação ao ano de Os principais destinos das exportações brasileiras foram: Rússia (266,52 mil toneladas); Hong Kong (122,13 mil t); Ucrânia (57,29 mil t); Angola (30,39 mil t); e Argentina (28,57 mil t). O Estado de Santa Catarina é o maior produtor e exportador nacional e o estado de Mato Grosso é o quinto estado que mais exporta no Brasil (ABIPECS, 2010). O Brasil possui cerca de mil matrizes alojadas e o estado de Mato Grosso possui 80 mil matrizes com uma produção de 152 mil toneladas em 2009, sendo considerado o sexto maior produtor de suínos ficando atrás dos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Paraná, Minas Gerais e São Paulo (ABIPECS e EMBRAPA, 2010). A produção industrial mato grossense apresenta um aumento expressivo da produção e exportação de carne suína no cenário nacional em consequência dos avanços tecnológicos e investimentos dentro da cadeia suinícola nesses últimos anos. Por outro lado, este crescimento da atividade faz com que o estado enfrente desafios sanitários presentes na suinocultura mundial. Dentre esses, destacam-se os problemas reprodutivos manifestados clinicamente pela fêmea suína, sua relação com o sistema de manejo e características do rebanho (CLARK, 1996). Distúrbios reprodutivos em suínos são ocorrências comuns em criações comerciais em todo o mundo. Os sinais clínicos a eles associados são decorrentes de doença na fêmea reprodutiva e/ou o comprometimento do feto. As fêmeas manifestam a doença reprodutiva pela falha na concepção, reabsorção embrionária e retorno de cio, mumificação fetal, aborto em diversas fases da gestação, parto com poucos leitões (leitegadas pequenas), partos prematuros ou atrasados, presença de

12 10 número excessivo de fetos natimortos, nascimento de leitões débeis e ocorrência de elevada mortalidade de leitões na maternidade (DIAL et al., 1992; CLARK, 1996). A natimortalidade na suinocultura industrial é considerada uma das principais causas de perdas de leitões causando significativo prejuízo econômico. Suínos natimortos são tipicamente classificados em dois tipos distintos, baseados no tempo da morte fetal, tais como: Natimortos pré-parto (tipo I), o qual a causa da morte fetal é atribuída a infecção intra-uterina por agentes infecciosos e natimortos intra-parto (tipo II) que geralmente está associado a uma etiologia não infecciosa como a anóxia fetal, a sua principal causa (HERPIN et al., 2001; LUCIA Jr. et al., 2002). A presença de natimortos é um problema prevalente na suinocultura intensiva apesar do uso de produtos farmacológicos durante a parição (STRAW et al., 2000). Estudos recentes indicam um aumento da mortalidade intra parto devido ao uso de oxitocina nas porcas no início da parição (MOTA-ROJAS et al., 2002, 2005). Dentre as causas infecciosas de natimortalidade pré-parto, o parvovírus suíno e o circovírus suíno tipo 2 têm-se destacado por apresentar distribuição mundial (BOGDAN et al., 2001; PENSAERT et al., 2004; PESCADOR et al., 2007; ROCHA et al., 2008). O PCV2 tem demonstrado forte associação com falhas reprodutivas, como os abortos, retornos ao cio, mumificação e mortes embrionárias e fetais (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005; MATEUSEN et al., 2007). No Brasil, estudos sobre mumificação e natimortalidade em fetos suínos têm demonstrado uma infecção de 17% de infecção pelo parvovírus suíno (MORENO et al., 2007) e 50,3% pelo PCV2 e 6,2% co-infecção com o parvovírus (ROCHA et al., 2008) através da técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase). Pescador et al. 2007, relatou uma infecção de 5,78% para circovírus através da técnica de PCR e imunohistoquímica e co-infecção com parvovírus suíno 2,47% através da PCR. Este trabalho teve por objetivo identificar o Parvovirus suíno e Circovirus suíno tipo 2 e correlacionar estes agentes com a ocorrência de natimortos e mumificados através da técnica de PCR em duas granjas comerciais de ciclo completo do município de Tapurah, Estado do Mato Grosso.

13 11 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Circovirus suíno tipo 2 (PCV2) Etiologia Os vírus incluídos na família Circoviridae são vírus pequenos, icosaédricos e não envelopados (TISCHER et al., 1982). De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICVT), a família Circoviridae está composta por dois gêneros. O primeiro é o gênero Circovirus, onde estão incluídos o PCV1, o PCV2 (ALLAN e ELLIS, 2000), o Circovirus do pombo (CoCV), o Circovirus do canário (CaCV), o Circovirus do ganso (GoCV) e o vírus da Doença do bico e penas dos psitacídeos (PBFDV) (TODD, 2004). O outro é o gênero Gyrovirus, no qual está inserido o vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV) (TODD, 2004). Além disso, o Circovirus apresenta semelhanças com outros dois vírus humanos, o TT vírus (TTV) e o TTVlike minivírus (TLMV) (BIAGINI, 2004). Em 1991 foi descrita, no Canadá, uma doença desconhecida até então, a qual foi denominada Síndrome Multissistêmica do Definhamento do Suíno (SMDS) (HARDING, 1996). São descritos dois tipos virais, o Circovirus Suíno Tipo 1 (PCV1), o vírus contaminante da linhagem celular, o qual é apatogênico para suínos, e Circovirus Suíno Tipo 2 (PCV2) como o causador da SMDS (ALLAN et al., 1998). Estudos retrospectivos realizados com soros revelaram a presença do vírus desde 1969 na Bélgica, 1973 na Irlanda do Norte e 1985 no Canadá e Espanha (MAGAR et al., 2000; SEGALÉS e DOMINGO, 2002). Da mesma forma, a análise de tecidos de suínos parafinizados determinou a presença do vírus desde 1970 na

14 12 Inglaterra (GRIERSON et al., 2004), 1986 na Espanha e Suíça (RODRÍGUEZ- ARRIOJA et al., 2003; STAEBLER et al., 2005), 1989 no Japão (MORI et al., 2000), e 1993 na Tailândia (KIATIPATTANASAKUL-BANLUNARA et al., 2002). No Brasil, a SMDS foi diagnosticada primeiramente em 2001 em Santa Catarina (CIACCI-ZANELLA et al., 2001), contudo, estudos retrospectivos indicaram a presença do vírus desde 1988 (CIACCIZANELLA et al., 2004). Atualmente, o PCV2 se encontra amplamente distribuído nos estados brasileiros, tais como, como Rio Grande do Sul (PESCADOR et al., 2003), Paraná, São Paulo (CASTRO et al., 2003), Rio de Janeiro (FRANÇA et al., 2005), Espírito Santo (CHIARELLI et al., 2005), Minas Gerais (PINTO et al., 2003; BARBOSA, 2005), Mato Grosso (OLIVEIRA FILHO et al., 2009) e Pernambuco (BARBOSA et al., 2009). O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) está associado a diversas enfermidades em suínos, nos quais se destacam a síndrome da refugagem multissistêmica (SRM) (HARDING e CLARK, 1997), falhas reprodutivas (WEST et al., 1999), a síndrome da dermatite e nefropatia suína (PDNS) (ROSELL et al., 2000), o complexo de doenças respiratórias dos suínos (KIM et al., 2003), enterite granulomatosa, epidermite exsudativa, linfadenite necrotizante e tremor congênito (ELLIS et al., 2004; HARDING, 2004; SEGALÉS, ROSELL e DOMINGO, 2004; CHAE, 2005) Epidemiologia e transmissão A transmissão do PCV2 pode ocorrer de forma horizontal ou vertical (BALASCH et. al., 1999; ELLIS et al., 1999; PENSAERT et al., 2004; PARK et al., 2005). A via oronasal tem sido utilizada em estudos de reprodução experimental da SRM (BALASCH et al., 1999; ELLIS et al., 1999). O PCV2 tem sido detectado em secreções nasais, saliva, fezes e soro de suínos, o que indica a disseminação horizontal (KRAKOWKA et al., 2000; SEGALÉS et al., 2005). Ha et al. (2008) demonstraram que a transmissão do PCV2 também pode ocorrer pelo leite da matriz

15 13 lactante. Entretanto, estudos têm demonstrado diferenças nas concentrações virais em animais com ou sem a manifestação clínica da SRM. Neste sentido, Segalés et al. (2005) demonstraram que a excreção viral foi significativamente maior em animais com a manifestação clínica da SRM. Recentemente, a transmissão vertical, associada com falhas reprodutivas tem sido reportada (PENSAERT et al., 2004; MALDONADO et al., 2005). O PCV2 tem sido encontrado em fetos abortados e natimortos ocasionando miocardite (WEST et al., 1999; BRUNBORG et al., 2007). Estudos assinalam a possibilidade de que existam outras vias de contágio, como o sêmen (LAROCHELLE et al., 2000; GAVA et al., 2008). No entanto, em condições naturais a infecção pelo PCV2 em causar problemas reprodutivos em suínos é um tanto controverso. Alguns pesquisadores sugerem que seja um evento raro (LADEKJAER MIKKELSEN et al., 2001; MALDONADO et al., 2005) enquanto outros encontraram a infecção em 13% dos fetos abortados e natimortos (KIM et al., 2004) Sinais Clínicos Alguns estudos reproduziram de forma experimental a transmissão vertical do PCV2 com a ocorrência de aborto (SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005). Autores relataram que o PCV2 pode atravessar a barreira placentária (KIM et al., 2004; PARK et al., 2005). Mateusen et al. (2007) e como conseqüência disso pode causar retorno ao cio, inclusive regular quando infecções transplacentárias ocorrerem em estágios iniciais de gestação. Entretanto, Sanchez et al. (2001) não observaram interrupção da gestação após inoculação intra-fetal com o PCV2. Segundo esses autores, estas diferenças observadas no curso da gestação podem estar relacionadas, entre outras, a via de inoculação e a virulência das cepas virais. Entretanto, há estudos que demonstraram o potencial do PCV2 em causar morte

16 14 fetal (SANCHEZ et al., 2001; JOHNSON et al., 2002; MATEUSEN et al., 2004; SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005). A mumificação ou natimortalidade fetal depende do período gestacional nas quais os fetos foram expostos ao PCV2. Fetos infectados antes de 75 dias de gestação apresentaram maiores chances de mumificação fetal enquanto fetos infectados após esta idade se apresentaram natimortos ou fracos ao nascimento (SANCHEZ et al., 2001). Estudos demonstraram que alguns fetos infectados durante a gestação podem nascer vivos e indicam potencial destes em carrear o vírus para a vida pós-natal (SANCHEZ et al., 2001; JONHSON et al., 2002; SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005). No entanto, o desenvolvimento da SRM nestes leitões fracos ao nascimento não está determinado Diagnóstico Para confirmação do diagnóstico do PCV2 associado à falha reprodutiva é necessário, entre outros, a identificação do PCV2 em órgãos fetais. O isolamento viral a partir de fetos pode apresentar baixa sensibilidade (PARK et al., 2005) enquanto que bons resultados foram relatados por técnicas tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridização in situ e/ou imunohistoquímica (JONHSON et al., 2002; PARK et al., 2005). Segundo Kim e Chae (2004), a PCR é a reação mais sensível para detecção do PCV2 e PPV quando comparada a imunohistoquímica e a hibridização in situ. A identificação do PCV2 nos fetos natimortos, mumificados e abortados podem sugerir que este vírus seja o causador da morte fetal, no entanto, técnicas que permitam a quantificação viral no tecido, como o PCR em tempo real, pode ser importante nesta confirmação, uma vez que as titulações detectadas podem ser comparadas às titulações virais utilizadas nos estudos de infecções experimentais com danos aos fetos (SANCHEZ et al., 2003; PARK et al., 2005).

17 15 O exame histopatológico pode ser realizado em tecidos de fetos abortados e natimortos desde que não apresentem estágio avançado de autólise (PARK et al., 2005). Entretanto, as lesões histopatológicas descritas não são patognomônicas do PCV2, sendo necessária à utilização de outras técnicas para confirmação (WEST et al., 1999; O CONNOR et al., 2001). Não há um consenso na literatura sobre o órgão ou órgãos de eleição para detecção do PCV2 em fetos (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003; PARK et al., 2005; BRUNBORG et al., 2007). Estudos demonstraram o coração de fetos como o órgão de maior título viral independente do período gestacional (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003). Outros autores destacaram a miocardite como a principal lesão histopatológica em fetos (WEST et al., 1999; O CONNOR et al., 2001; BRUNBORG et al., 2007). Entretanto, Park et al. (2005), sugerem tonsilas, baço e linfonodos de fetos, como órgãos de maiores concentrações do PCV2. Segundo Sanchez et al. (2003) o tropismo do PCV2 modifica de cardiomiócitos, hepatócitos e macrófagos na fase pré-natal para macrófagos na vida pós-natal. Desta forma, a seleção dos órgãos de fetos em estudos de detecção da freqüência do PCV2 pode gerar diferenças nos resultados. Para diagnosticar problemas reprodutivos associado com PCV2 alguns critérios devem ser seguidos e estar relacionado tais como ao aumento do número de abortos e ou fetos natimortos ou mumificados, juntamente com lesões de fibrose e ou miocardite necrotizante e detecção de PCV2 nas lesões (SEGALÉS et al., 2006) Controle As medidas preventivas para o PCV2 tem como objetivo principal o controle da SMDS bem como as vacinas disponíveis no mercado. Apesar dos estudos apresentados nesta revisão terem demonstrado o potencial do PCV2 em causar

18 16 falha reprodutiva, não foram encontradas na literatura discussões sobre medidas preventivas. Entre elas estão a implantação dos 20 pontos de Madec que tem sido eficaz na diminuição da mortalidade em explorações afetadas com a SMDS (MADEC et al., 2000). As recomendações incluem procedimentos como all-in-all-out, desinfecção, evitar mistura de lotes, isolamento e/ou eutanásia de animais doentes, manutenção da temperatura adequada, fluxo de ar nas instalações, utilização adequadas de tratamentos antiparasitários e vacinação (GRAU ROMA et al., 2010). Estas medidas estariam diminuindo a excreção viral do PCV2 no ambiente. 2.2 Parvovirus suíno (PPV) Etiologia A família Parvoviridae, subfamília Parvovirinae, fazem parte do gênero Parvovirus, que inclui vírus que infectam mamíferos e aves, sendo em geral, espécie-específicos. As partículas virais são compostas por proteínas (60 subunidades) e DNA de fita simples, com aproximadamente 5,0Kb. As proteínas estruturais a eles associadas são VP1 (83kDa), VP2 (64kDa) e VP3 (60kDa) (MOLITOR, JOO, COLLETT, 1983), essa última originada da clivagem proteolítica de vinte resíduos da região aminoterminal da VP2. Cada vírion contém poucas subunidades de VP1, sendo a VP2 e VP3 as proteínas predominantes. A simplicidade estrutural e ausência de envoltório e constituintes lipídicos contribuem para a alta resistência destes vírus à inativação pelo éter e clorofórmio; sua estabilidade em ph 3 a 9 e a 56ºC por 60 minutos. Essas características fazem dos PPV um dos vírus mais resistentes quando fora de seus hospedeiros (FIELDS et al., 1996). O PPV também codificam uma proteína não estrutural denominada NS-1 com aproximadamente 84 kda, e apresenta uma provável atividade sobre a replicação e

19 17 regulação para o início da transcrição viral atuando na ligação covalente e nãocovalente ao DNA como helicase, endonuclease de sítio específico, ATPase, além de outras funções (FIELDS et al., 1996). Sítios de afinidade da NS-1 têm sido identificados ao longo do genoma viral, em particular nas regiões de origem da transcrição (ori). Um efeito citotóxico da NS-1 é atribuído aos parvovírus autônomos, sendo que a atividade desta proteína parece estar, pelo menos em parte, relacionada com esse efeito (VANACKER e ROMMELAERE, 1995) Epidemiologia e Transmissão Através da técnica sorológica de Inibição da Hemaglutinação (IH) realizado em 608 fêmeas não vacinadas no Estado de Minas Gerais em 1982, identificou uma soroprevalência de 55,3% para PPV (GOUVEIA, GOMEZ, REIS, 1984). Neste mesmo trabalho os autores mostram também uma correlação de 78,1% entre a presença de anticorpos e o relato de sinais clínicos associados a problemas reprodutivos (mumificação fetal, retorno de cio e leitegadas pequenas). Bersano et al. (1993), também relatam a detecção de anticorpos para PPV em 96,12% das porcas examinadas em 25 granjas do Estado de São Paulo sem histórico de vacinação. A infecção transplacentária por PPV pode ocorrer já no início do período gestacional (MENGELING, 1975). Em que matrizes infectadas por via oral, os vírus levam de 23 a 32 dias para atravessarem a placenta (JOO et al., 1976). Em marrãs expostas ao PPV pelas vias intranasal e oral, para verificar a infecção transplacentária e sua conseqüência nos fetos, vírus e antígeno viral foram detectados em embriões de fêmeas necropsiadas dias após a exposição, indicando a passagem transplacentária já com menos de 20 dias (MENGELING, PAUL, BROWN, 1980).

20 18 A doença ocorre quando as fêmeas apresentam baixos títulos de anticorpos adquirem o vírus durante a gestação e, como o PPV apresenta avidez por células em divisão, o feto e o envoltório fetal podem ser atingidos. Fêmeas multíparas apresentam menores problemas causados pelo vírus devido ao seu desenvolvimento de imunidade ativa (MENGELING et al., 2000). O uso da vacina não impede a infecção das fêmeas pelo PPV, pois, em um estudo realizado por Józwik et al., 2009, comprovou a presença do vírus tanto em fêmeas vacinadas e não vacinadas desafiadas pelo agente. As vias de transmissão mais comuns são a oronasal e a transplacentária no qual o PPV mantém sua infectividade por meses em secreções e excretas de animais com infecção aguda (BROWN, PAUL, MENGELING, 1980; MENGELING, 1992). Acredita-se que utensílios e ambientes contaminados por PPV são de importância na sua manutenção e transmissão, dada sua alta estabilidade. Apesar de todos os animais de um rebanho serem suscetíveis à infecção com PPV, fêmeas e machos jovens são apontados como os mais sensíveis e o distúrbio reprodutivo acaba por ser mais evidenciado pelas marrãs (LIEBERMANN et al., 1988; OBALDIA, 1991; HUYSMAN et al., 1992). Apesar de seu poder patogênico em suínos estar limitado a embriões e fetos, a infecção pelo PPV em fêmeas gestantes pode apresentar variações quanto à manifestação clínica, na dependência do período gestacional (dias) em que ocorrer a infecção primária, sendo que, no início da gestação, ocorre morte embrionária seguida de reabsorção fetal, em infecções mais tardias (terço médio da gestação, ao redor de 35 a 75 dias) ocasiona morte dos fetos resultando em mumificação fetal, a partir do período em que o feto torna-se imunocompetente, por volta dos 70 dias de gestação, ele é capaz de produzir anticorpos próprios e sobreviver a infecção (JOO et al., 1976; MENGELING e CUTLIP, 1976). Infecções em cachaços e em fêmeas não prenhes em geral não causam sinais clínicos. Porém, estes animais são também responsáveis pela circulação dos vírus na granja. Na epizooetiologia da parvovirose são consideradas como vias de eliminação, além do feto propriamente dito, as fezes, urina, secreções e saliva dos animais infectados (LIEBERMANN et al., 1988).

21 Sinais clínicos A parvovirose é uma síndrome de distribuição mundial de alta prevalência, caracterizada por morte embrionária, mumificação, natimortos e leitegadas de tamanho reduzido quando atinge fêmeas não imunes em gestação (SOBESTIANSKY e BARCELLOS, 2007). Na granja, sinais importantes para a identificação de parvovirose são atrasos na parição e períodos entre partos prolongados (MENGELING et al., 2000). As manifestações estão diretamente relacionadas com o período gestacional que a fêmea foi infectada, podendo também levar ao aborto. Floss (1993) relata que aproximadamente 38% dos abortos diagnosticados em suínos seriam atribuídos a causas infecciosas. Kirkbride e McAdaragh (1978), analisando 824 casos de abortos em suínos nos Estados Unidos da América (EUA), concluíram pela participação de agentes bacterianos em 16,5% dos casos e de agentes virais em 22% deles. Destes, 4,9% foram positivos para parvovírus suíno (PPV). Posteriormente, a análise de fetos mortos de cem leitegadas também dos EUA, mostrou uma prevalência de 33% do antígeno de PPV nos pulmões desses animais, com o uso do teste de imunofluorescência direta (MENGELING et al., 1991). Estudo etiológico realizado em fetos abortados e natimortos de criações na Suíça relatam PPV em 29,2% dos casos, valor, inclusive, superior àquele por causas de origem bacteriana (BROLL et al., 1993). Neste caso os autores utilizaram como métodos a imunoeletromicroscopia e a detecção de anticorpos específicos ou imunofluorescência indireta. No Brasil, Moreno et al., (2007) examinou 1727 fetos natimortos, mumificados e abortados e observaram 17% positivos para PPV. Apesar da identificação de PPV há vários anos em criações do Brasil, para o qual é recomendado o uso rotineiro de programas vacinais nas fêmeas de criações industriais, a ocorrência de fetos mumificados, o sinal clínico mais típico associado à parvovirose, tem ocorrências acima dos níveis considerados aceitáveis (2%) em criações tecnificadas (MENGELING, 1992). Com relação ao aborto, onde uma freqüência de até 3% é considerada aceitável, são encontrados índices mais

22 20 elevados em granjas comerciais, da mesma forma que a natimortalidade acima de 5%. Por se tratar de granjas tecnificadas, estes índices sugerem a interferência de agentes infecciosos (GOUVEIA, GOMEZ, REIS, 1984; RODRIGUEZ et al., 2003). Até recentemente, dado o reconhecimento do envolvimento de PPV em fêmeas gestantes e seus problemas reprodutivos, muitas investigações centravamse na detecção desses vírus. Porém, pesquisas envolvendo circovírus suíno tipo 2 associados com a Síndrome Multisistêmica do Definhamento do Leitão Desmamado Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), demonstram a presença tanto desses vírus como também dos PPV em vários casos clínicos de campo. Nesses casos, a confirmação se deu tanto pelo isolamento dos dois vírus, como também por imunohistoquímica (ELLIS et al., 1999) Diagnóstico A técnica de inibição da hemaglutinação (IH) para os parvovírus passou a ser utilizada após 1966, quando foi descoberta a capacidade destes em hemaglutinar hemácias de determinadas espécies (BRAILOVSKY, 1966) e através da realização de diluições seriadas pode determinar o título viral (JOO et al., 1976). Atualmente, este método segue sendo utilizado como método padrão ouro (standard) para a detecção de anticorpos em laboratórios de referência no Brasil. A utilização de testes sorológicos para pesquisa de anticorpos específicos para PPV é prática comum em fêmeas de granjas de suínos no Brasil, com o objetivo de detectar e/ou quantificar a imunidade humoral, estudar sua disseminação, além do monitoramento sorológico de um rebanho (RODRIGUEZ et al., 2003). Contudo, em rebanhos onde é praticada a vacinação, a IH não é eficaz na diferenciação de anticorpos vacinais daqueles oriundos da infecção. Já o uso da proteína recombinante não estrutural NS1 de PPV em testes imunoenzimáticos, permite essa diferenciação, por reagir apenas com anticorpos gerados em animais naturalmente infectados (QING et al., 2006).

23 21 Estudos das alterações histomorfológicas em tecidos podem ser feitos em fetos em bom estado de conservação, preferencialmente naqueles com mais de 60 dias de gestação. Mesmo não representando alterações patognomônicas, no caso de animais positivos para PPV o achado histomorfológico mais freqüente é o infiltrado linfoplasmocitário, tanto em rim, como em cérebro e miocárdio. Também é digno de nota, a presença de células de citoplasma amplo no pulmão, possivelmente oriundas da descamação epitelial nos alvéolos ou representando macrófagos residentes (BROLL et al., 1993; BANKS, 1993). Casos de miocardite não supurativa em leitões foram associados a infecções por PPV em exame de miocárdios com lesão inflamatória testados por hibridização in situ (BOLT et al., 1997). A infecção cardíaca pode ter relação com o nascimento de leitões débeis. Técnicas imunohistoquímicas utilizando anticorpos monoclonais são altamente específicas e, além de permitirem a detecção do antígeno viral em tecidos fixados e processados adequadamente, permitem a observação de alterações histológicas decorrentes da infecção viral (KATZ e DEUSEN, 1985). A partir de 1991, testes por reações em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores para a região codificadora da VP2 de PPV, tanto em cultivos celulares como em tecidos de fetos experimentalmente infectados, foram estabelecidos (MOLITOR et al., 1991). Posteriormente, foi aplicada uma Nested-PCR, desenvolvida com iniciadores direcionados para a amplificação do gene da proteína NS1, mais conservada entre os diferentes PPV, que foi eficaz na detecção do genoma viral em diferentes tecidos de fetos (SOARES et al., 1999). PPV têm sido isolados de diversos tecidos de animais infectados, com maior freqüência para pulmões e tecidos linfóides de fetos mumificados (MOLITOR, JOO, COLLETT, 1983; BERSANO et al., 1995). O tecido pulmonar tem sido o de escolha para análises pelo fato de ser facilmente coletado, mesmo de fetos mumificados, como também por apresentar menor autofluorescência, quando examinado por testes de fluorescência (MENGELING, 1992). Porém, outros tecidos devem ser explorados nas pesquisas do antígeno viral, pois contêm tanto quanto, ou mais vírus que o pulmão, logo após a exposição do animal. Acredita-se, inclusive, que a morte fetal seja conseqüência da ampla disseminação dos vírus no organismo (MENGELING e CUTLIP, 1976; WILHELM et al., 2005). Por outro lado, em trabalho

24 22 recente realizado no Brasil, foi observada, através da PCR, uma maior incidência PPV no pulmão e coração de fetos natimortos, mumificados e abortados (WOLF, et al., 2008). A Nested-PCR realizada do soro representa uma alternativa prática para verificar se há vírus circulando nas criações suinícolas, tendo em vista que ainda não há um sistema comercial que possibilite discernir entre anticorpos originados de vacina ou do desafio a campo (STRECK, 2009). Atualmente novos métodos de detecção estão sendo desenvolvidos. A PCR em tempo real, além de poder ser mais sensível e específica do que a PCR convencional, possui uma vantagem adicional à capacidade de quantificação e leitura automatizada. Porém o custo elevado do equipamento esta retardando a sua difusão no Brasil (STRECK, 2009) Controle A vacinação é a principal medida a ser adotada, cujo objetivo é estimular a imunidade do plantel para evitar as infecções dos embriões ou fetos. Józwik et al. (2009) estudaram uso de vacinas inativadas para parvovirose em fêmeas suínas e o resultado foi que a vacina não impede a infecção e que mesmo fêmeas vacinadas e não vacinadas tiveram um padrão semelhante de excreção do vírus através das fezes. As vacinas disponíveis atualmente no mercado continuam sendo importantes para a proteção individual contra a PPV. No entanto, a necessidade de revacinar todas as porcas regularmente em intervalos de 4-6 meses, tem se mostrado necessário.

25 23 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Local do experimento Este estudo foi realizado em duas granjas comerciais de produção de suínos, sendo a granja A com 1040 matrizes e a granja B com 820, no município de Tapurah, estado de Mato Grosso, no período de abril a outubro de As granjas possuíam ciclo completo de produção, manejo tudo dentro - tudo fora (all-in all-out) e inseminação artificial. O protocolo de vacinação para as matrizes, consistia em apenas a aplicação da vacina tríplice (Leptospirose, Parvovirose e Erisipela), sendo duas doses nas marrãs e dose reforço 7 a 15 pós parto, não utilizando vacinação para PCV2 nas matrizes. As granjas, no entanto, apresentavam alterações em pelo menos um dos parâmetros reprodutivos: 1) retorno de cio acima de 10%; 2) leitegadas com menos de 10 leitões nascidos vivos; 3) natimortalidade acima de 5%; 4) ocorrência de fetos mumificados acima de 2%. 3.2 Animais utilizados As fêmeas escolhidas na coleta não apresentavam sintomas da infecção por agentes infecciosos relacionados as falhas reprodutivas. Foram utilizadas 44 fêmeas suínas as quais pariram fetos natimortos e/ou mumificados, sendo assim considerou-se a fêmea suína parida como a unidade experimental deste estudo.

26 Coleta e envio das amostras Foram coletadas amostras de 29 fêmeas que apresentaram fetos natimortos e/ou mumificados da granja A e 15 da granja B, perfazendo um total de 44 fêmeas. Os dados referentes ao número de fetos de cada fêmea estão no anexo A. Os fetos foram armazenados em sacos plásticos identificados, congelados em freezer a -20ºC e enviados em caixas isotérmicas até o Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) para posterior diagnóstico laboratorial. 3.4 Exame histopatológico Os fetos foram necropsiados, pesados e medidos para estimar a idade do feto. Fragmentos de cérebro, pulmão, timo, coração, fígado, baço, rim, cólon, cordão umbilical e músculo estriado esquelético foram coletados e fixados em formalina tamponada a 10%. Os materiais foram emblocados em parafina e processados de acordo com os métodos convencionais para análise histopatológica e corados pela hematoxilina e eosina (Allen, 1992), sendo posteriormente analisados em microscopia óptica. 3.5 Extração do DNA das amostras Para a extração de DNA utilizou-se fragmentos de coração e pulmão de cada feto. Estas amostras foram identificadas conforme a apresentação dos fetos e da

27 25 procedência da granja e separadas de acordo com os seguintes grupos: grupo I: amostras de fetos provenientes de fêmeas que pariram natimorto; grupo II: amostras de fetos de fêmeas que pariram apenas mumificados; grupo III: amostras de fetos de fêmeas que parariam natimortos e mumificados. Após a coleta dos órgãos (coração e pulmão) de cada fetos estes foram reunidos num pool representativo de cada fêmea perfazendo um total de 100mg de cada órgão para posterior extração de DNA. A técnica utilizada nesta extração foi a de digestão por proteinase K associado ao Fenol - Clorofórmio descrita por (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). A digestão do tecido foi realizada através de Tampão de Lise (100mM de NaCl, 10mM Tris ph 8,0, 25 mm EDTA, 0,5% SDS e 0,1 mg/ml Proteinase K) a 55ºC de 16 a 18 horas. O DNA extraído são tratado duas vezes com Fenol : Clorofórmio (2:1:1), precipitação com 0,3M de Acetato de sódio e etanol (100%) refrigerado (dois volumes). O DNA precipitado foi lavado duas vezes com etanol 70% e ressuspendido em água ultrapura (50µl). O DNA extraído foi mantido a -20ºC até o momento do uso. 3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Circovírus suíno Tipo 2 (PCV-2) A amplificação de fragmentos de DNA do PCV2 foi realizada seguindo a metodologia descrita por Fenaux et al., (2000) com iniciadores específicos para amplificar uma região da ORF 2 (fase aberta de leitura 2) do PCV2. Os oligonucleotídeos utilizados nas amplificações foram: PCV2 For 5 CAC GGA TAT

28 26 TGT AGT CCT GGT 3 e PCV2 Rev 5 CCG TAC CTT CGG ATA TAC TGT 3, no qual resulta em um produto de amplificação de 494pb, que foram fracionados através de eletroforese em de gel agarose (1,0%) corados com brometo de etídeo e analisados em transluminador. A reação da PCR foi realizada em volume final de 20µl com 20 pmol de cada primer, 0,84 mm de MgCl 2, 10% de Tampão PCR, 0,2 mm de DNTP, 2,5U de Taq DNA polimerase e 0,4 µl do DNA a ser testado. A reação foi realizada em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 1 minuto, 35 ciclos de 1 minuto segundos a 94ºC (desnaturação do DNA); anelamento dos oligonucleotídeos a 56ºC por 1 minuto e 1 minuto a 72ºC de extensão; e uma extensão final de 5 minutos a 72ºC. Para o controle positivo da reação, foi utilizada amostra de um animal com Circovirose comprovada através de exames clínicos, patológicos e da PCR, com identidade comprovada através do sequenciamento do genoma viral pelo Laboratório de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Já para o controle negativo das reações, foi utilizada água ultra pura. Parvovirus suíno (PPV) A detecção do PPV foi baseada na técnica de PCR e Nested PCR descrita por (KIM e CHAE, 2004). Para estas, foram utilizadas as sequências de oligonucleotídeos: For 5 AAA TGA ATC TGG GGG TGG GG - 3 (posição dos nucleotídeos: ), e o Rev 5 CCA GTC CGC TGG ATT GAA CC 3, amplificando uma região de 316 pb. Os oligonucleotídeos utilizados na Nested PCR foram: For 5 TAC TTG GGG GAG GGC TTG GT 3 (posição dos nucleotídeos é ). A sequência de oligonucleotídeos reverso utilizado na reação de Nested - PCR é a mesma utilizada no PCR convencional e a região amplificada pelo

29 27 Nested - PCR é de 219pb. Este foi fracionado através de eletroforese em de gel agarose (1,5%) corados com brometo de etídeo e analisados em transluminador. A amplificação do DNA foi realizada em uma reação final de 20µl contendo 1.25 mm MgCl 2, 10% de Tampão PCR, 0.2 mm de cada DNTP, 1 mm de cada oligonucleotídeos iniciador, 2.5 U de Taq DNA polimerase e 0,3 µl do DNA a ser testado. Ambas as reações foram feitas em um termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial de 1 minuto a 95ºC; 30 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores a 69,5ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. O PCR é finalizado com uma extensão final de 72ºC por 5 minutos. Para o controle positivo da reação, foi utilizada amostra de pulmão de um feto infectado pelo PPV confirmada pela técnica de IFD e por Nested-PCR (cedida pelo Laboratório de Patologia da University of Nebraska Lincon - UNL). Já para o controle negativo das reações, foi utilizada água ultra pura. Tanto para o diagnóstico de PPV e PCV2 a fêmea foi considerada positiva quando pelo menos um tecido (coração ou pulmão) resultasse da amplificação positiva nas reações da PCR. 3.7 Análises estatísticas dados. As análises estatísticas foram realizadas através de análises descritivas dos

30 28 4 RESULTADOS Nas análises histológicas nenhuma alteração significativa foi encontrada. Apenas a presença de aspiração de mecônio no interior dos alvéolos e brônquios pulmonares. Dado este que esta sendo avaliado com a relação ao uso da ocitocina em fêmeas durante o parto e a presença de aspiração de mecônio pelos fetos levando a asfixia fetal consequentemente a natimortalidade. Os resultados da tabela 1 mostram a classificação das fêmeas de acordo com cada grupo e por granjas. Das 44 fêmeas avaliadas, 21/44 (47,7%) fêmeas apresentaram fetos natimortos (grupo I), 12/44 (27,3%) mumificados (grupo II) e 11/44 (25,0%) apresentaram fetos natimortos e mumificados (grupo III). Na granja A observou-se que das 29 matrizes 15/29 (51,7%), 7/29 (24,1%) e 7/29 (24,1%) apresentaram fetos natimortos, mumificados e natimortos - mumificados, respectivamente. E a granja B, 6/15 (40,0%) apresentaram fetos natimortos, 5/15 (33,3%) mumificados e 4/15 (26,7%) natimortos - mumificados. Tabela 1. Classificação das 44 fêmeas suínas de acordo com as granjas e com os grupos de produção de fetos. G I G II G III Granja A (29*) 15 (51,7%) 7 (24,1%) 7 (24,1%) Granja B (15*) 6 (40,0%) 5 (33,3%) 4 (26,7%) Total (44*) 21 (47,7%) 12 (27,3%) 11 (25,0%) G I: fêmeas que pariram fetos natimortos G II: fêmeas que pariram fetos mumificados G III: fêmeas que pariram natimortos e mumificados *número de fêmeas suínas Os resultados dos agentes pesquisados através da técnica de PCR e nested- PCR para PCV2 e PPV, respectivamente, estão na tabela 2. A porcentagem de fêmeas que pariram fetos natimortos e mumificadas positivas para o diagnóstico de PPV foram 29/44 (65,9%). E apenas uma fêmea 1/44 (2,3%) foi positiva para PCV2. Sendo que a mesma matriz foi positiva para PPV e PCV2 pertencente a granja A.

31 29 Tabela 2. Quantidade e porcentagem de fêmeas positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV) através da técnica de PCR e nested- PCR, respectivamente. PPV PCV2 (PCV2 e PPV) Positivas 29 (65,9%) 1 (2,3%) 1 (2,3%) Negativas 15 (34,1%) 43(97,7%) 43 (97,7%) A porcentagem de fêmeas de cada granja que pariram fetos natimortos e/ou mumificados positivos para PPV através da técnica de nested-pcr estão na tabela 3. A granja A resultou em 18/29 (62,1%) fêmeas com fetos positivos para PPV e a granja B 11/15 (73,3%). Tabela 3. Quantidade e porcentagem de fêmeas com fetos positivos e negativos para o diagnóstico de parvovírus (PPV) através da técnica nested- PCR de acordo com cada granja. Positivos Negativos Granja A (29) 18 (62,1%) 11 (37,9%) Granja B (15) 11 (73,3%) 4 (26,7%) Total (44) 29 (65,9%) 15 (34,1%) Para o diagnóstico de PPV e PCV2 de acordo com cada granja e grupos os dados estão descritos nas tabelas 4, 5 e 6. Em relação ao grupo de fêmeas que pariram apenas natimortos (tabela 4), a granja A mostrou 11/15 (73,3%) fêmeas positivas para PPV, e na granja B todas as fêmeas 6/6 (100%) foram positivas. A presença do PCV2 em fetos natimortos e mumificados somente foi diagnosticado na granja A, sendo apenas uma fêmea positiva 1/15 (6,7%).

32 30 Tabela 4. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested- PCR em fêmeas do grupo I (fetos natimortos) criadas em diferentes granjas. Parvovírus Circovírus Natimortos Natimortos Positivo Negativo Positivo Negativo Granja A(15*) 11 (73,3%) 4 (26,7%) 1 (6,7%) 14 (93,3%) Granja B (6*) 6 (100,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 6 (100,%) *quantidade de fêmeas que apresentaram fetos do grupo I Na tabela 5 estão as fêmeas do grupo II, sendo 2/7 (28,6%) da granja A e 2/5 (40%) da granja B positivas para o diagnóstico de PPV. E em relação aos resultados de PCV2 em fetos mumificados, nenhuma fêmea apresentou resultados positivos. Tabela 5. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested PCR em fêmeas suínas do grupo II (fetos mumificados) criadas em diferentes granjas. Parvovírus Circovírus Mumificados Mumificados Positivo Negativo Positivo Negativo Granja A 2 (28,6%) 5 (71,4%) 0 7 (100,0%) (7*) Granja B (5*) 2 (40,0%) 3 (60,0%) 0 5 (100,0%) *quantidade de fêmeas que apresentaram fetos do grupo II

33 31 A tabela 6 mostra os resultados da análise dos fetos natimortos e mumificados das fêmeas do grupo III. Sendo 5/7 (71,4%) procedentes da granja A e 3/4 (75,0%) da granja B pariram fetos natimortos e mumificados positivos para PPV. E nenhuma fêmea deste grupo foi positiva para PCV2. Tabela 6. Quantidade e porcentagem de amostras positivas e negativas para o diagnóstico de circovírus (PCV2) e parvovírus (PPV), através da técnica de PCR e nested- PCR em fetos de fêmeas suínas do grupo III (fetos natimortos e mumificados) criadas em diferentes granjas. Parvovírus Circovírus Mumificados Mumificados Positivo Negativo Positivo Negativo Granja A 5 (71,4%) 2 (28,6%) 0 7 (100,0%) (7*) Granja B (4*) 3 (75,0%) 1 (25,0%) 0 4 (100,0%) *quantidade de fêmeas que apresentaram fetos do grupo III 5 DISCUSSÃO Os agentes virais têm sido apontados como causa de falhas reprodutivas em suínos dentre eles estão incluídos o vírus da doença de Aujeszky, os enterovírus, o vírus da peste suína clássica, o vírus da encefalomiocardite, o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos entre outros. Estes vírus são associados com a morte fetal devido a um ataque direto no feto ou placenta (CHRISTIANSON, 1992). Além destes agentes, o PCV2 e o PPV também se destacam como causadores de distúrbios reprodutivos (THACKER et al., 1988; DEE, 1995; WEST et al., 1999; MENGELING et al., 2000; O CONNOR et al., 2001; SOBESTIANSKY e BARCELLOS, 2007), e a associação destes agentes tem sido relatada em vários países, como no: Canadá (WEST et al., 1999; O CONNOR et al., 2001), Itália (

34 32 GARBARINO et al., 2003), Alemanha (ALTHERR et al., 2003), Dinamarca (LADEKJAER-MIKKELSEN et al., 2001), Coréia (KIM e CHAE, 2004), Índia (SHARMA e SAIKUMAR, 2010) e no Brasil (PESCADOR et al., 2007; ROCHA et al., 2008). Porém no estado de Mato Grosso apenas Oliveira Filho et al. (2009) descreveram a ocorrência do PCV2 em 58,21% suínos abatidos no estado. Considerando o crescimento relevante da atividade suinícola no estado de Mato Grosso, observa-se a importância de um conhecimento sanitário específico. Dentro deste contexto, há a necessidade de realizar diagnósticos para verificar a presença destes agentes no plantel suíno, para que possamos implantar programas de controle. A co-infecção de PCV2 e PPV tem sido relacionado em ocorrência de falhas reprodutivas no Brasil, possivelmente pelo possível sinergismo que ocorre entre esses vírus com valores de 2,47% a 6,2 % (PESCADOR et al., 2007; ROCHA et al., 2008), respectivamente. Os dados encontrados em nossa pesquisa estão semelhantes aos valores anteriores onde a presença da co-infecção de PPV e PCV2 foi detectada em apenas uma matriz suína, pertencente ao G1 da granja A. No entanto neste feto natimorto não foi encontrado nenhuma lesão típica de necrose e fibrose do miocárdio usualmente relatada com a infecção de PCV2 (WEST et al., 1999; O CONNOR et al., 2001). Maldonado et al. (2005) na análise de 293 fetos abortados e natimortos na Espanha, encontraram somente um feto positivo para PCV2 pela técnica de PCR e também não encontrou nenhuma lesão no miocárdio. A baixa presença do PCV2 nas granjas estudadas indicam que o PCV2 não seja o principal responsável por natimortalidade e presença de fetos mumificados em fêmeas reprodutivas. Isto pode ser explicado devido a maioria das matrizes do rebanho produzirem elevados níveis de anticorpos contra este agente (SANCHEZ et al., 2001; SEGALÉS et al., 2003; MALDONADO et al., 2005). No entanto estudos referentes a sorologia das matrizes para a infecção de PCV2 não foi pesquisado. No presente estudo, os resultados encontrados na verificação da presença de PPV em matrizes que pariram fetos natimortos e/ou mumificados foram de 29/44