INDUÇÃO IN VITRO DE CALOS EM EXPLANTES FOLIARES DE PEQUIZEIRO (Caryocar brasiliense Camb.) 1

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1 INDUÇÃO IN VITRO DE CALOS EM EXPLANTES FOLIARES DE PEQUIZEIRO (Caryocar brasiliense Camb.) 1 RESUMO - Com o objetivo de promover a indução in vitro de calos, segmentos foliares de plantas jovens de pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.) foram submetidos a diferentes concentrações de ANA e BAP, em meio WPM suplementado com 3% de sacarose e 0,65% de ágar. Os explantes foram mantidos na presença e ausência de luz, em sala de crescimento, com temperatura de ± 27 o C. A melhor indução de calos foi observada em explantes mantidos na ausência de luz e inoculados em meio contendo a combinação de ANA (10,74µM) e BAP (2,22µM e 4,44µM). Objetivando-se também FLÁVIA DE SOUZA LIMA LANDA 2 RENATO PAIVA 3 PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA 4 JÚLIO SÍLVIO DE SOUSA BUENO FILHO 5 promover o subcultivo dos calos produzidos, foram utilizadas diferentes concentrações de ANA (5,37µM e 10,74µM), BAP (1,11µM e 2,22µM), acrescentandose ainda ao meio de cultura água de coco, extrato de malte, extrato de levedura e caseína hidrolizada. Os calos foram mantidos na ausência de luz, em sala de crescimento, com temperatura de ±27 o C. Os resultados indicaram que o uso de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de malte proporcionou a maior média de peso de matéria fresca de calos. TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Pequi, Caryocar brasiliense, calos, cultura de tecidos IN VITRO CALLUS INDUCTION OF Caryocar brasiliense Camb. LEAF EXPLANTS ABSTRACT - With the objective to promote in vitro callus induction, young leaf segments of Caryocar brasiliense Camb. were inoculated in WPM medium supplemented with 3% sucrose, 0.65% agar and different concentrations of NAA and BAP. The explants were maintained in a growth room in the presence or absence of light at a temperature of ±27 C. The best callus induction was observed in explants maintained in the abscence of light and inoculated in medium containing the combination of NAA (10.74 µm) and BAP (2.22 or 4.44 µm). With the objective to promote callus subculture, the WPM medium was supplemented with different concentrations of NAA (5.37 and µm), BAP (1.11 and 2.22 µm), coconut water, malt extract and hydrolized casein. The callus was maintained in a growth room in the absence of light at a temperature of ±27 C. The results indicated that the use of 5.37 µm NAA µm BAP mg/l malt extract provided the highest average weight of callus fresh matter. INDEX TERMS: Pequi, Caryocar brasiliense, callus, tissue culture. INTRODUÇÃO O cerrado é um bioma típico da zona tropical e ocupa mais de 50% do território do Estado de Minas Gerais (Silveira, 1989). Levantamentos florísticos realizados em regiões de cerrado mostraram enorme riqueza em espécies, apesar da homogeneidade fisionômica da vegetação (Silva Júnior, 1984). 1. Parte da Dissertação de Mestrado apresentada à UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS(UFLA), pela primeira autora, para obtenção do grau de Mestre em Agronomia, área de concentração Fisiologia Vegetal. 2. Bióloga 3. Professor Adjunto, Departamento de Biologia/UFLA, Caixa Postal 37, Lavras - MG 4. Professor Adjunto, Departamento de Agricultura/UFLA 5. Professor Adjunto, Departamento de Ciências Exatas/UFLA

2 57 Dentre as espécies vegetais ocorrentes no cerrado, pode-se citar o pequi (Caryocar brasiliense), espécie arbórea de grande interesse socioeconômico. Além de apresentar um fruto de alto valor nutritivo e madeira de boa qualidade, o pequizeiro é explorado de forma extrativista, para subsistência e para indústrias (Chévez Pozo, 1997). Além disso, essa espécie apresenta dificuldades no processo de propagação, pois suas sementes possuem dormência (Miranda, 1986; Melo e Gonçalves, 1991). A cultura de tecidos pode ser considerada uma importante técnica para propagação e vem sendo utilizada com sucesso em várias espécies. A propagação por meio da cultura de tecidos pode ser feita por via direta ou indireta (via indução e formação de calos), podendo esta última ser considerada como método potencial de propagação, caso as variações genéticas (mutações) não atinjam valores percentuais elevados (Pierik, 1985). Pesquisas com calos formados a partir de fragmentos de caules, folhas e raízes são realizadas principalmente para determinar as condições de cultura que os explantes requerem para sobreviver e crescer (Siqueira e Inoue, 1992), para estudar o desenvolvimento celular, explorar produtos provenientes do metabolismo primário e secundário, obter suspensão celular e propagação, com a formação de gemas ou embriões somáticos. Com este trabalho objetivou-se promover o estabelecimento in vitro do pequizeiro (C. brasiliense Camb.), pela indução e formação de calos, utilizando segmentos foliares como explantes, além de identificar o meio mais adequado para o subcultivo de calos formados. MATERIAL E MÉTODOS 1) Indução de calogênese Foram utilizados como explantes segmentos foliares de tamanho aproximado de 1 cm 2, provenientes de mudas de pequi com 4 meses de idade, produzidas a partir de sementes coletados no município de Montes Claros (MG). As folhas permaneceram em água corrente por 16h antes de sofrerem o processo de desinfestação. Esse processo consistiu em lavá-las 2 vezes com água destilada com 2-3 gotas de detergente neutro, seguido de imersão rápida em álcool etílico 70% (v/v), imersão em hipoclorito de sódio 30% (v/v) de produto comercial, por 15 minutos, e 4 lavagens com água destilada autoclavada. As folhas permaneceram em água destilada até o momento da inoculação. O meio de cultura utilizado foi o WPM (Lloyd e McCown, 1980), suplementado com 3% de sacarose, 0,65% de ágar, ANA (ácido naftalenoacético) nas concentrações de 0,0 e 10,74 µm, combinados com 0,0; 2,22 e 4,44µM de BAP (benzilaminopurina), com ph ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da autoclavagem. Os explantes foram mantidos na ausência e presença de luz (fotoperíodo de 16h luz), em sala de crescimento com temperatura de 27 º C. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado contendo 12 repetições por tratamento. Ao final de 60 dias, foi realizada avaliação visual, que consistiu em observar a ocorrência de calos, coloração, grau de oxidação e enraizamento, além da obtenção da percentagem de crescimento de calos, pela fórmula: %cresc. = PF - PI x 100 PI em que, PF = peso final PI = peso inicial. 2) Subcultivo de calos I Os calos formados na ausência de luz em meio contendo 10,74 µm ANA e 2,22µM BAP (experimento anterior) foram divididos em 2 e 4 fragmentos e submetidos aos seguintes tratamentos: 1) meio acrescido de 10,74 µm ANA + 2,22µM BAP (controle); 2) meio sem reguladores de crescimento; 3) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP; 4) meio acrescido de 50 ml.l -1 de água de coco; 5) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de malte; 6) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 50 ml.l -1 de água de coco; 7) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de levedura; 8) meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de caseína hidrolizada. O meio básico usado foi o WPM (Lloyd e McCown, 1980) contendo 3% de sacarose, 0,65% de ágar e ph ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da autoclavagem. Após a inoculação, o material foi mantido em sala de crescimento com temperatura de 27 º C, na ausência de luz. Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000

3 58 O delineamento experimental adotado foi o de blocos casualizados com 5 repetições. A avaliação foi realizada ao final de 30 dias, em que foram observados a ocorrência de crescimento, grau de oxidação e formação de raízes e/ou brotações. A avaliação da ocorrência de crescimento foi realizada por meio de um critério de notas, sendo 0 = ausência de crescimento; 1 = pouco crescimento (formação de calos sem ocupar toda a superfície do explante) e 2 = muito crescimento (formação de calos ocupando toda a superfície do explante inoculado e suas adjacências). A análise dos dados foi realizada pelo Proc GLM (General Linear Models Procedure) do programa estatístico SAS (SAS Institute, 1993). 3) Subcultivo de calos II Com base nos resultados do experimento anterior, foram produzidos calos em meio WPM suplementado com 10,74µM ANA + 2,22µM BAP, 3% de sacarose, 0,65% de ágar e ph ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da autoclavagem. Esses foram divididos em 2 e 4 fragmentos e submetidos aos seguintes tratamentos: 1) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP; 2) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de malte; 3) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de malte; 4) meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg.l -1 de extrato de malte. O meio básico utilizado foi o WPM contendo 3% de sacarose, 0,65% de ágar, 100 mg.l -1 de PVP-40, ph ajustado para 5,8 ± 0,1. Após a inoculação, o material foi mantido no escuro, em sala de crescimento, com temperatura de 27 º C. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados com 12 repetições. Trinta dias após a inoculação, foi realizada a avaliação final do experimento, que consistiu em verificar o aumento de matéria fresca, subtraindo-se da matéria fresca final a matéria fresca inicial. A porcentagem de crescimento dos calos formados também foi calculada de acordo com a fórmula: % cresc. = PF - PI x 100 PI em que, PF = peso final PI = peso inicial. Os dados foram submetidos ao Proc. GLM (General Linear Models Procedure) do programa estatístico SAS (SAS Institute, 1993) para análise. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1) Indução de calogênese A presença de calos foi detectada 20 dias após a inoculação, tanto nos explantes mantidos na presença quanto na ausência de luz. Observou-se que, para esse mesmo período, a formação de calos nos explantes mantidos sob iluminação foi maior em relação aos mantidos no escuro. A partir do vigésimo dia de inoculação, os explantes mantidos na presença de luz apresentaram desenvolvimento inferior em relação aos explantes mantidos na ausência de luz, os quais permaneceram em melhores condições até a avaliação final aos 60 dias. Resultados semelhantes foram encontrados por Wickremesinhe e Arteca (1993), em que calos de Taxus spp., mantidos num regime de 16h luz/8h escuro, apresentaram pior aspecto visual e menor quantidade de calos formados, quando comparados com os calos mantidos na ausência de luz. Explantes mantidos na presença apenas de BAP, nas concentrações de 2,22µM e 4,44µM, mostraram pequena formação de calos, sugerindo que o BAP, utilizado isoladamente, é capaz de induzir a formação de calos a partir de segmentos foliares de pequizeiro. O efeito do BAP na formação de calos também foi demonstrado em segmentos foliares de castanheira-do-brasil (Camargo, 1997) e de caquizeiro (Tao e Sugiura, 1992). Porém, quando essa citocinina estava associada ao ANA (meio suplementado com 2,22µM BAP + 10,74µM ANA; meio acrescido de 4,44µM BAP + 10,74µM ANA), os calos formados apresentam-se maiores, indicando interação entre esses reguladores de crescimento (Figura 1). Quando adicionaramse ao meio apenas 10,74µM ANA, não houve alteração em relação ao controle, indicando que esse regulador de crescimento isoladamente não tem efeito na indução de calos a partir de segmentos foliares de pequizeiro, efeito esse também observado por Rey e Mroginski (1996), trabalhando com Aeschynomene spp. Observouse também que nos tratamentos contendo ANA e BAP, os explantes apresentaram comportamentos diferenciados como enrugamento da folha, formação de raiz diretamente do explante, calos duros e com raíz e coloração variando entre o branco, marrom e acinzentado (Figura 2). Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000

4 59 O enraizamento ocorreu naturalmente a partir do 45o dia após a inoculação, somente nos explantes mantidos no escuro. A rizogênese em calos também foi igualmente observada por Paiva Neto (1996) trabalhando com tecido foliar de moreira (Chlorophora tinctoria). A porcentagem de formação de calos está apresentada na Tabela 1. Observa-se que todos os explantes mantidos no escuro apresentaram formação de calos superior em relação aos explantes mantidos na presença de luz, com exceção do tratamento cujo meio não foi acrescido de reguladores de crescimento (controle) e o meio acrescido apenas de 10,74mM ANA. FIGURA 1 - Aspecto visual dos explantes foliares de Caryocar brasiliense mantidos na presença (A) e ausência (B) de luz 60 dias após a inoculação, em meio suplementado com 4,44 M BAP e 10,74 M ANA. UFLA, Lavras/MG, FIGURA 2 - Comportamento diferenciado de explantes foliares de Caryocar brasiliense cultivados em meio contendo ANA e BAP. UFLA, Lavras/MG, Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p , dez., 2000

5 60 TABELA 1 - Formação de calos em explantes foliares de pequizeiro mantidos na presença e ausência de luz em meio suplementado com ANA e BAP. UFLA, Lavras/MG, Porcentagem de calos Reguladores de crescimento Presença de luz Ausência de luz Sem reguladores 0 0 2,22µM BAP 16,66 33,33 4,44µM BAP 8,33 41,66 10,74µM ANA ,74µM ANA e 2,22µM BAP 66,66 83,33 10,74µM ANA e 4,44µM BAP 58,33 91,33 2) Subcultivo de calos I e II As maiores médias de matéria fresca de calos (Figura 3) foram observadas para o meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg/l extrato de malte, meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg/l caseína hidrolizada e o meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP. Esses três tratamentos também foram os que apresentaram calos com melhor aspecto visual. Os tratamentos cujos meios não foram suplementados com reguladores de crescimento ou suplementados apenas com 50 ml/l água de coco apresentaram as menores médias de peso de matéria fresca, indicando que a adição de ANA e BAP ao meio de cultivo é fundamental para o subcultivo dos calos de pequizeiro. O meio suplementado com 5,37µM ANA + 1,11µM BAP + 50 ml/l água de coco e o meio acrescido de 5,37µM ANA + 1,11µM BAP mg/l extrato de levedura, apesar de não diferirem estatisticamente dos outros tratamentos empregados, apresentaram calos com aspecto oxidado e/ou necrosado. A coloração dos calos formados variou entre branco acinzentado, branco amarelado a marrom. Oxidação dos calos foi observada em pequeno grau e houve a formação de brotações e raízes (Figura 4). Segundo Caldas, Haridsan e Ferreira (1990) e Pierik (1985), misturas complexas como extrato de levedura, água de coco, extrato de malte e caseína hidrolizada podem ser usadas para incrementar os meios nutritivos para a cultura de tecidos de plantas. Indução e manutenção de calos utilizando-se água de coco e caseína hidrolizada também foram demonstradas por Baumert et al. (1992) e Rajbhandari e Stomp (1997). Camargo (1997) observou que a taxa de crescimento dos calos de castanheira-do-brasil, quando subcultivados, foi semelhante para os meios contendo reguladores de crescimento e água de coco, sendo significantemente superiores ao meio sem reguladores de crescimento. Esses resultados vêm, de certa forma, confirmar os resultados obtidos neste experimento, em que a diferença significativa encontrada foi entre o tratamento contendo reguladores de crescimento e extrato de malte e os tratamentos sem reguladores de crescimento. A formação de estruturas como raízes e/ou brotações em calos também foi observada em explantes de Aeschynomene spp. (Rey e Mroginski, 1996); em castanheira-do-brasil (Camargo, 1997) e em Bauhinia purpurea (Kumar, 1992). A porcentagem de crescimento dos calos subcultivados em meios suplementados com diferentes concentrações de extrato de malte é demonstrada na figura 5. Na presença de extrato de malte, a formação de calos foi maior quando utilizou-se a concentração de 1000 mg/l. Embora o uso do extrato de malte no meio de cultura tenha proporcionado a formação de calos com melhor aspecto visual, a maior percentagem de crescimento de calos foi obtida na ausência de extrato de malte. Pela análise de variância (Tabela 2), Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000

6 61 FIGURA 3 - Peso médio de matéria fresca (g) para calos de explantes foliares de pequizeiro, submetidos a 10,74 M ANA + 2,22 M BAP (T1); meio sem reguladores de crescimento (T2); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP (T3); 50 ml/l água de coco (T4); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l extrato de malte (T5); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP + 50 ml/l água de coco (T6); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l extrato de levedura (T7); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l caseína hidrolizada (T8). Tratamentos com a mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de significância. UFLA, Lavras/MG, FIGURA 4 - Aspecto visual de brotações (A) e raízes (B), indicadas pelas setas, formadas a partir de calos de pequizeiro subcultivados na presença de ANA, BAP, extrato de malte e caseína hidrolizada. UFLA, Lavras/MG, Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p , dez., 2000

7 62 FIGURA 5 - Crescimento de calos de explantes foliares de pequizeiro, em percentagem, na presença de diferentes concentrações de extrato de malte 5,37 M ANA + 1,11 M BAP (T0); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l extrato de malte (T1); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l extrato de malte (T2); 5,37 M ANA + 1,11 M BAP mg/l extrato de malte (T3). UFLA, Lavras/MG, TABELA 2 - Análise de variância do ganho de matéria fresca de calos cultivado na presença de diferentes concentrações de extrato de malte. UFLA, Lavras/MG, Fonte GL QM F Bloco 3 0,1147 NS Tratamento 3 0,0807 NS Resíduo 39 0,096 Total 45 CV= 46,88% observa-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Esse resultado indica que, mesmo com o aumento na sua concentração, o ex- trato de malte adicionado ao meio de cultivo não fa- vorece um maior crescimento dos calos em relação ao meio de cultivo sem extrato de malte. CONCLUSÕES a) É possível promover o estabelecimento in vitro do pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.) pela formação de calos a partir de segmentos foliares; Ciênc. agrotec., Lavras, v. 24, (Edição Especial), p , dez., 2000

8 63 b) A manutenção dos explantes foliares na ausência de luz induz a formação de calos com melhor aspecto visual; c) A formação de calos pode ser obtida em meio WPM suplementado com 2,22µM BAP + 10,74µM ANA, bem como com 4,44µM BAP + 10,74µM ANA; d) Substâncias complexas, como extrato de malte e caseína hidrolizada, adicionadas ao meio WPM, favorecem o subcultivo de calos de pequizeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAUMERT, A.; GRÖGER, D.; KUZOVKINA, I.N.; REISCH, J. Secondary metabolites produced by callus cultures of various Ruta species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v.28, p , CALDAS, L.S.; HARIDSAN, P.; FERREIRA, M.E. Meios nutritivos. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. (ed.) Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP/EMBRAPA- CNPH, 1990, p CAMARGO, I.P. de. Estudos sobre a propagação da castanheira-do-brasil (Bertholletia excelsa Humb. & Bonpl.). Lavras: UFLA, p. (Tese - Doutorado em Fitotecnia). CHÉVEZ POZO, O.V. O pequi (Caryocar brasiliense): uma alternativa para o desenvolvimento sustentável do cerrado do Norte de Minas Gerais. Lavras: UFLA, p. (Dissertação - Mestrado em Administração Rural). KUMAR, A. Micropropagation of a mature leguminous tree - Bauhinia purpurea. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague,. v.31, p , LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially - feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. International Plant Propagators Society Proceedings, v.30, p , MELO, J.T. de; GONÇALVES, A.N. Inibidores de germinação no fruto e em sementes de pequi (Caryocar brasiliense Camb.). Planaltina: EMBRAPA - CPAC, p. (Boletim de pesquisa, n.34). MIRANDA, J. de M. Contribuição ao estudo da cultura do piqui (Caryocar sp.): propagação e concentração de nutrientes. Areia: Universidade Federal da Paraíba, p. (Tese de mestrado). PAIVA NETO, V.B. de. Comportamento in vitro de tecido foliar e segmento nodal de moreira (Chlorophora tinctoria (L.) Gaudichaud). Lavras: UFLA, p. (Dissertação - Mestrado em Fisiologia Vegetal). PIERIK, R.L.M. Plantenteelt in kweekbuizen. 2. herz druk. Wageningen: Ponsen & Looijen, p. RAJBHANDARI, N.; STOMP, A.M. Embryogenic callus induction in fraser fir. HortScience, Alexandria, v. 32, n. 4, p , July REY, H.Y.; MROGINSKI, L.A. Regeneration of plants from callus tissue of Aeschynomene spp. (Leguminosae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague,.v.45, n.3, p , June SAS INSTITUTE INC. SAS Procedures Guide for computers, 6. ed. Cary NC: SAS Institute Inc., n.3, 373p. SILVA JÚNIOR, M.C. da. Composição florística, estrutura e parâmetros fitossociológicos do cerrado e sua relação com o solo na Estação de Experimentação de Paraopeba, Minas Gerais. Viçosa: UFV, p. (Tese de mestrado). SILVEIRA, F.A. da. Abelhas silvestres (Hymenoptera: Apoidea) e suas fontes de alimento no cerrado na Estação de Experimentação de Paraopeba, Minas Gerais. Viçosa, UFV, p. (Tese de mestrado). SIQUEIRA, E.R. de; INOUE, M.T. Propagação vegetativa do coqueiro através da cultura de tecidos. Pesquisa Agropecuária Brasileira. Brasília, v. 27, n. 4, p , Abr TAO, R.; SIGIURA, A. Adventitious bud formation from callus cultures of japanese persimmon. HortScience, Alexandria, v. 27, n. 3, p , Mar WICKREMESINHE, E.R.M.; ARTECA, R.N. Taxus callus cultures: initiation, growth optimization, characterization and taxol production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague,.v.35, p , Ciênc. agrotec., Lavras, v.24 (Edição Especial), p.56-63, dez., 2000