Conjunto SPOT-Light HER2 CISH

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1 Conjunto SPOT-Light HER2 CISH Cat. n exames com lamelas de 24 mm x 30 mm Uso pretendido Para utilização de diagnóstico in vitro O conjunto SPOT-Light HER2 CISH destina-se a determinar quantitativamente a amplificação do gene HER2 em secções de tecido de carcinoma mamário fixadas em formalina e incluídas em parafina (formalin-fixed, paraffinembedded, FFPE), utilizando hibridação cromogénica in situ (chromogenic in situ hybridization, CISH) e microscopia de campo claro. Este exame deve ser realizado num laboratório de histopatologia. O conjunto SPOT-Light HER2 CISH está indicado como auxiliar na avaliação de doentes para os quais está a ser considerado o tratamento com Herceptin (trastuzumab). Os resultados destinam-se a ser utilizados como adjuvantes da informação clínico-patológica a ser presentemente utilizada como parte do tratamento de doentes com cancro da mama. A interpretação dos resultados do exame tem de ser efectuada no contexto do historial clínico do doente e por um patologista devidamente qualificado. Resumo e explicação O gene humano HER2, ou c-erbb-2, e o gene murino equivalente, neu, foram identificados como sendo protooncogenes (1-3) que partilham homologia com o oncogene de relação próxima v-erbb (1). O gene HER2 localiza-se no cromossoma 17 (17q ) e codifica uma proteína semelhante a um receptor de membrana, de 185 kda. A proteína codificada pelo HER2 tem actividade de tirosina quinase e partilha homologia com o receptor do factor de crescimento epidérmico (conhecido como EGFr, HER1, ou c-erbb-1), embora seja distinta deste (2). Foi identificada a amplificação do gene HER2 ou a sobre-expressão da proteína HER2 em 18-30% dos cancros da mama humanos (8-9). A identificação do estado de amplificação do gene HER2 é importante para a determinação do prognóstico de doentes diagnosticados com cancro da mama invasivo, bem como na selecção de doentes elegíveis para a terapêutica com trastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suíça e Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EUA) (4-6). O trastuzumab é um anticorpo monoclonal específico para a proteína HER2. O trastuzumab mostrou ser uma terapêutica eficaz apenas em doentes cujos tumores apresentam amplificação do gene HER2 e/ou sobre-expressão da proteína HER2 (7,11). Numa fase precoce do cancro da mama, um ciclo curto de trastuzumab administrado concomitantemente com docetaxel ou vinorelbina mostrou ser eficaz em mulheres com cancro da mama que têm um gene HER2/neu amplificado (12). Outros estudos mostraram ainda que o estado de HER2 previa a sensibilidade ou resistência a certos regimes de quimioterapia (13). Por conseguinte, os métodos exactos, consistentes e directos para a avaliação do estado do gene HER2 e da proteína HER2 têm-se revestido de uma importância cada vez maior. PI Rev 0.0 Página 1 de 27

2 Princípios do procedimento A técnica CISH utiliza sondas de ADN marcadas com digoxigenina que são específicas para o lócus genético do HER2 no cromossoma 17q para hibridar com os ácidos nucleicos complementares presentes na amostra de cancro da mama. A sonda de HER2 marcada é feita com tecnologia de sonda por subtracção (Subtraction Probe Technology, SPT ), uma tecnologia exclusiva e patenteada que cria sondas específicas, reduzindo significativamente as sequências repetitivas (por ex., elementos Alu e LINE) encontradas nos ácidos nucleicos humanos. Através de PCR, a sonda mostrou conter o gene HER2 e mostrou ainda ligar-se especificamente ao lócus genético do HER2 no cromossoma 17q através de FISH metafásica em linfócitos normais. Consequentemente, as sondas SPT da Invitrogen são inerentemente específicas e não necessitam do bloqueio repetitivo de sequências, como acontece com as sondas de ADN citogenéticas tradicionais. A técnica CISH permite a avaliação de aberrações genéticas sob microscopia de campo claro, utilizando detecção cromogénica. Os resultados da coloração CISH podem ser claramente visualizados com microscopia normal de campo claro e com uma objectiva de 40x a seco. O estado de amplificação do gene HER2 pode ser visualizado no contexto da morfologia do tecido circundante. Após a desparafinização, as amostras são pré-tratadas com um passo de recuperação a quente, seguido de digestão enzimática. As amostras são, então, desidratadas e secas ao ar, antes da adição da sonda HER2. Após a adição da sonda e da lamela à amostra, a combinação é desnaturada e hibridada por mais de dez horas ou de um dia para o outro. Em seguida, a amostra é lavada para remover a sonda não hibridada, e o sinal é detectado cromogenicamente através de adição sequencial de anticorpo ao conjugado de digoxigenina com polímero de peroxidase de rábano (horseradish peroxidase-polymer, HRP). A cor é desenvolvida através da reacção do HRP ligado com o cromogénio DAB e o substrato de H 2 O 2. Por último, faz-se a contracoloração da amostra com hematoxilina de Mayer, para identificar a morfologia tecidular e cobre-se com uma lamela. O sinal do gene HER2 é identificado através de um único ponto castanho-escuro, quando presente num baixo número de cópias ou de agrupamentos castanhos quando o sinal se apresenta sob a forma de muitas cópias. As áreas de células tumorais podem ser facilmente identificadas sob uma objectiva de baixa ampliação de um microscópio de campo claro e as cópias do gene HER2 podem ser quantificadas utilizando a objectiva de 40x. Utilizando microscopia de campo claro com uma objectiva de 40x, localizam-se as células tumorais e quantificam-se as cópias do gene HER2. A DAB forma um precipitado corado, pelo que os resultados podem ser arquivados e revistos posteriormente. Materiais fornecidos O conjunto SPOT-Light HER2 CISH contém todos os reagentes necessários para a realização do procedimento CISH em tecidos fixados com formalina e incluídos em parafina. Os materiais listados a seguir são suficientes para um total de vinte exames e até duas execuções com as duas lâminas de controlo, utilizando amostras de tecido cobertas com lamelas de 24 mm x 30 mm. Podem ser realizados mais exames se forem utilizadas lamelas mais pequenas. O conjunto SPOT-Light HER2 CISH é enviado em blocos refrigerados. Os blocos refrigerados devem estar ainda frios aquando da recepção da encomenda, para garantir que a embalagem não foi exposta a temperaturas elevadas. Contudo, alguns componentes podem permanecer descongelados sem que tal afecte o desempenho do conjunto. Consulte Conservação dos reagentes para obter informações relativas à conservação destes componentes aquando da recepção. Reagente A. Solução de pré-tratamento a quente 1 l, contendo tampão Tris-EDTA (pronto a utilizar) Reagente B. Reagente de pré-tratamento enzimático 5 ml, contendo solução de pepsina com azida sódica a 0,05% e detergente (pronto a utilizar) CUIDADO: perigoso Reagente C. Sonda HER2 0,4 ml de sonda SPOT-Light HER2 marcada com digoxigenina em tampão de hibridação contendo formamida (pronto a utilizar) CUIDADO: perigoso Reagente D. Tampão SSC 500 ml, contendo citrato de sódio salino (saline sodium citrate, SSC) (pronto a utilizar) PI Rev 0.0 Página 2 de 27

3 Reagente E1. Pó PBS 3 embalagens, cada uma suficiente para 1 l de PBS Reagente E2. Tween 20 (50%) 2 ml, Tween 20 em solução a 50% Reagente F. CAS-Block TM 3 ml, contendo tampão, estabilizador e azida sódica a 0,1% (pronto a utilizar) CUIDADO: perigoso Reagente G. Anticorpo murino antidigoxigenina 3 ml, contendo BSA, tampão e azida sódica a 0,1% (pronto a utilizar) CUIDADO: perigoso Reagente H. Conjugado de polímero HRP e antimurino de cabra 3 ml, contendo estabilizador, tampão, sulfato de gentamicina a 0,005% e Proclin 300 a 0,1%, (pronto a utilizar) Reagente I1. Tampão de substrato DAB (20x) 1 ml, concentrado contendo tampão Reagente I2. Solução de DAB, (20x) 1 ml, concentrado contendo metanol a 85% p/v CUIDADO: inflamável e tóxico Reagente I3. Peróxido de hidrogénio (20x) 1 ml, H 2 O 2 a 0,6% Reagente J. Hematoxicilina de Mayer 100 ml (pronto a utilizar) Reagente K. Histomount TM Mounting Solution (solução de montagem) 4 ml (pronto a utilizar) CUIDADO: altamente inflamável e perigoso Lâmina de controlo L. Lâminas com células de controlo para o procedimento 2 lâminas, cada uma com duas (2) linhas celulares fixadas com formalina e incluídas em parafina (FFPE), colocadas lado a lado: A) HER2 não amplificado (MCF-7), e B) HER2 amplificado (SK-OV-3) [Recomendam-se as linhas celulares não amplificadas com resultados contabilizáveis para um controlo óptimo do ensaio.] PI Rev 0.0 Página 3 de 27

4 REAGENTES/MATERIAIS E EQUIPAMENTO NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Reagentes/materiais auxiliares Invitrogen Cat. n. 1. Lâminas SuperFrost Plus OU Adesivo para lâminas Histogrip TM Controlo tecidular positivo: secção de tecido de carcinoma mamário FFPE (ductal, tubular, lobular ou de tipo misto) com amplificação do gene HER2 previamente confirmada com CISH ou FISH 3. Controlo tecidular negativo: secção de tecido de carcinoma mamário FFPE (ductal, tubular, lobular ou de tipo misto) com amplificação do gene HER2 previamente confirmada com CISH ou FISH 4. Água desionizada ou destilada (dh 2 O) 5. Xileno 6. Etanol (EtOH) a 70%, 85%, 95% e 100% 7. Lamelas, cola rubber cement, agulha de 18G ½ e seringa de 5 ml OU 8. Lamelas UnderCover TM (18 x 18 mm) Lamelas UnderCover TM (22 x 22 mm) Peróxido de hidrogénio a 30% (H 2 O 2 ) 11. Metanol a 100% Equipamento 1. Temporizador 2. Pipeta (20 µl, 1000 µl) 3. Pontas de pipeta 4. Suporte para lâminas 5. Placa térmica, folha de alumínio e copo graduado de 1 l 6. Aquecedor de lâminas 7. Incubadora a 37 C 8. Dispositivo para ciclos térmicos ( thermal cycler ) de PCR com um bloco para lâminas OU Bloco de aquecimento com termómetro digital e incubadora a 37 C (± 1 C) e caixa para lâminas com humidade 9. Banho de água (capaz de manter um intervalo de temperatura de C) com um termómetro calibrado 10. Copos de misturadora e copos de coloração 11. Microscópio de campo claro com objectivas de 20x e 40x Precauções Para utilização de diagnóstico in vitro Para utilizadores profissionais, com formação adequada. Não utilize o conjunto após o prazo de validade impresso no rótulo. Caso o produto seja conservado em condições diferentes das especificadas no folheto informativo, as condições de conservação terão de ser verificadas pelo utilizador. Não comer, fumar ou aplicar produtos cosméticos nos locais onde os materiais do conjunto estão a ser manuseados. Devem observar-se as Boas Práticas Laboratoriais Universais. Nenhum método de exame disponível pode oferecer uma garantia completa de eliminação do potencial risco biológico. Manusear todos os materiais num nível 2 de Segurança Biológica, conforme recomendado para qualquer material humano potencialmente infeccioso no manual dos centros para controlo de doenças/institutos nacionais de saúde dos EUA (Centers for Disease Control/National Institutes for Health). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 a Edição, Abril de Não pipetar reagentes com a boca e evitar o contacto da pele e das mucosas com as amostras e reagentes. Caso os reagentes entrem em contacto com a pele ou as mucosas, enxaguar as áreas afectadas com água em abundância. Os reagentes B, F e G contêm azida sódica a 0,1%; o reagente H contém sulfato de gentamicina a 0,005% e Proclin a 0,1%; o reagente I2 contém metanol a 85% p/v; e o reagente I3 contém peróxido de hidrogénio a 0,6%. Nas concentrações do produto, estes reagentes não exigem rotulagem quanto a riscos. Consulte a MSDS específica para cada componente para obter informações adicionais. O reagente B contém pepsina e esta enzima pode causar reacções alérgicas em contacto com a pele. Utilize um banho de água de temperatura calibrada, bloco de aquecimento e forno de hibridação para obter resultados óptimos. PI Rev 0.0 Página 4 de 27

5 Alguns dos reagentes deste conjunto contêm azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir com o chumbo ou com o cobre das canalizações para formar azidas metálicas explosivas, sobretudo se acumulada. Ao eliminar reagentes com azida sódica, irrigue com grandes quantidades de água para evitar a acumulação de riscos químicos na canalização. Alguns reagentes deste conjunto contêm Proclin, azida sódica ou peróxido de hidrogénio. Estes reagentes estão classificados como perigosos, uma vez que são irritantes para a pele e para as mucosas. Estas substâncias são fornecidas na forma diluída para os componentes deste conjunto, o que pode, por conseguinte, minimizar significativamente, embora não completamente, os riscos de exposição. Evite o contacto com a pele, os olhos e o vestuário. Consulte a MSDS específica para cada componente para obter informações adicionais. O tetracloreto de 3,3 -diaminobenzidina (DAB) pode ser perigoso se ingerido, inalado ou absorvido através da pele, das mucosas e das vias aéreas superiores e pode ser irritante para os olhos, a pele, as membranas mucosas e o tracto repiratório superior. O DAB tem suspeita de carcinogenicidade; consulte os regulamentos federais, estaduais, e/ou os regulamentos locais quanto às recomendações para a respectiva eliminação. Evitar a evaporação do reagente I2. O metanol evapora-se facilmente. Tome medidas para evitar a evaporação, tais como a vedação do recipiente e o fecho da tampa imediatamente após a utilização. A evaporação do metanol pode causar a precipitação do DAB, podendo afectar os resultados da coloração. Evitar a evaporação por a hibridação, garantindo que as lâminas se encontram adequadamente vedadas e que existe humidade suficiente na câmara de hibridação. O pré-tratamento enzimático pode variar, consoante a fixação e a espessura do tecido. Para a maioria das secções de tecido (4 5 µm) fixados com formalina tamponizada neutra a 10%, o óptimo são 5 minutos de pré-tratamento enzimático. Para tecidos com fixação desconhecida, deve realizar-se uma titulação enzimática (por ex., 2 min., 5 min. e 10 min.), sendo o tempo óptimo de digestão ajustado com base nos resultados iniciais. Reagente C A sonda HER2 marcada contém formamida, que é perigosa. R21 Perigoso em contacto com a pele R22 Perigoso se ingerido R61 Pode causar danos a fetos em desenvolvimento S24 Evitar o contacto com a pele S36 Utilizar vestuário de protecção adequado S37 Utilizar luvas adequadas S39 Utilizar protecção para os olhos/rosto Reagente I2 A solução de DAB contém metanol, que é inflamável e tóxico. Consulte a MSDS para obter informações adicionais. R10 Inflamável R23/24/25 Tóxico por inalação, em contacto com a pele e se ingerido S45 Em caso de acidente, ou se não se sentir bem, procure auxílio médico imediatamente S36 Utilizar vestuário de protecção adequado S37 Utilizar luvas adequadas Reagente K A Histomount Mounting Solution contém tolueno, que é altamente inflamável e perigoso se inalado. Consulte a MSDS para obter informações adicionais. R11 Altamente inflamável R20 Perigoso por inalação S2 Manter fora do alcance das crianças S16 Manter afastado de fontes de ignição Não fumar S25 Evitar o contacto com os olhos S29 Não deitar para a canalização S33 Tomar medidas de precaução contra descargas estáticas Todos os reagentes designados como estando prontos a utilizar foram diluídos para a concentração óptima. A diluição adicional poderá afectar adversamente os resultados do ensaio. Os tempos de incubação, reagentes e temperaturas foram optimizados. O uso de diferentes tempos de incubação, reagentes ou temperaturas pode afectar adversamente os resultados do ensaio. Não se recomenda o uso de fixadores ou espessuras diferentes para o tecido, pois tal poderia afectar adversamente os resultados do ensaio. Consultar os regulamentos locais quanto à eliminação de componentes potencialmente tóxicos. Minimizar a contaminação microbiana para evitar a coloração não específica. Utilizar precauções alargadas ao manusear reagentes. Utilizar luvas descartáveis, bata e óculos de segurança ao manusear substâncias com suspeita de carcinogenicidade. PI Rev 0.0 Página 5 de 27

6 Conservação de reagentes O conjunto SPOT-Light HER2 CISH deve conservar-se a uma temperatura de 2-8 C. Conservar o reagente J à temperatura ambiente (15-30 C). Nota: o reagente B pode ser afectado adversamente se for exposto a temperaturas elevadas. Conservar este reagente a 2-8 C imediatamente após a utilização. Não conservar este reagente à temperatura ambiente. Conservar o PBS com tampão Tween 20 em utilização à temperatura ambiente (15-30 C) por um período de até uma semana. Não utilize o conjunto após o prazo de validade impresso no rótulo. Caso o produto seja conservado em quaisquer condições que não as especificadas no folheto informativo, as condições de conservação terão de ser verificadas pelo utilizador. Não existem sinais visíveis que indiquem a instabilidade deste produto; portanto, é importante avaliar as lâminas de controlo. Contacte a Assistência Técnica caso suspeite de algum problema com este conjunto. PI Rev 0.0 Página 6 de 27

7 Instruções de utilização A. Preparação das amostras Secções de tecido incluídas em parafina: São adequados para utilização os tecidos fixados em formalina tamponada neutra por 6-48 horas antes da inclusão em parafina. Os fixadores que não a formalina tamponada neutra a 10% não foram optimizados para este protocolo e não são adequados para utilização. As secções de tecido (com 4-5 µm de espessura) têm de ser montadas em lâminas para microscópio Superfrost Plus ou então tratadas com HistoGrip. Sempre que possível, utilize secções de tecido de espessura normalizada para assegurar a coloração uniforme da detecção através de CISH e dos reagentes de contracoloração 28. Secar as lâminas ao ar, ou secar a 37 C, e em seguida colocar na estufa por 2-4 horas a 60 C. Os tecidos adequadamente fixados e incluídos irão permanecer conservados indefinidamente antes do seccionamento e montagem das lâminas, se conservados num local fresco e seco (15-30 C) 26,27. As secções de tecido com espessura de 2-3 µm poderão dar falsos resultados baixos relativamente às cópias do gene. B. Procedimento CISH normal para as secções de tecido FFPE Notas relativas ao procedimento Todos os reagentes, excepto o reagente C (sonda HER2) devem ser equilibrados à temperatura ambiente (15-30 C) antes da utilização. A sonda HER2 pode ser utilizada a frio, sem equilibrar à temperatura ambiente. Cada incubação deve ser realizada à temperatura ambiente (15-30 C), a menos que haja indicação em contrário. Ao longo de todo o processo, a menos que haja indicação em contrário, é importante que a secção de tecido não seque entre os passos. Ao longo do procedimento são necessárias múltiplas lavagens. Para cada lavagem tem de ser utilizada solução fresca. As lâminas de controlo devem ser executadas juntamente com cada execução das lâminas de exame do doente e têm de ser tratadas da mesma forma que as amostras em exame para todos os passos. A menos que haja indicação em contrário, todos os passos são executados à temperatura ambiente (15-30 C). Este procedimento precisa de mais de oito horas para completar: em seguida é apresentada uma divisão prática, a começar no dia 1 com a desparafinização, passando pela desnaturação e hibridação (de um dia para o outro), e prosseguindo no dia 2 com a lavagem adstringente e até à microscopia de campo claro. Os reagentes Invitrogen fornecidos com o conjunto são necessários para o procedimento CISH. O uso de outros reagentes pode resultar em valores elevados de fundo, ou numa diminuição ou perda do sinal CISH. A substituição de qualquer dos reagentes fornecidos como componentes do conjunto pode tornar nulos os resultados do ensaio. Procedimento do dia 1 1. Preparação dos reagentes Xileno (dois recipientes de lâminas), EtOH a 100% (três recipientes de lâminas) o Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30 C) ou até que tenham sido processadas cem lâminas. Série de álcool etílico (EtOH) PI Rev 0.0 Página 7 de 27

8 o Prepare recipientes separados com EtOH a 70%, 85%, 95% e 100%. o Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30 C) ou até que tenham sido processadas cem lâminas. Rotule adequadamente cada reagente de lavagem e anote a ordem de utilização no procedimento, mantendo essa ordem. 2. Desparafinização Nota: prepare reagentes suficientes para cada recipiente de lâminas necessário para a quantidade de lâminas na execução. Cada lavagem necessita de um volume distinto de reagente. Se o passo seguinte não puder prosseguir imediatamente, deixe as lâminas secarem ao ar após mergulhar em EtOH a 100% três vezes, em vez de lavar as lâminas três vezes em dh2o. a) Mergulhe em xileno 2 vezes, 5 min. cada b) Mergulhe em EtOH a 100% 3 vezes, 3 min. cada c) Lave em dh2o 3 vezes, 2 min. cada A desparafinização completa é necessária para obter resultados óptimos e reproduzíveis. 3. Pré-tratamento a quente Nota: as lâminas têm de ser fervidas ou aquecidas a uma temperatura 98 C por 15 min. na solução de prétratamento a quente (reagente A). As lâminas não devem ser sobreaquecidas, certificando-se de que a temperatura permanece entre 98 C e 100 C. Recomendamos o uso da placa térmica para este passo. (Para protocolos que utilizem um forno de pressão com um medidor de pressão e temperatura, ou um forno de microondas com um medidor de temperatura, contacte a Assistência Técnica da Invitrogen através do endereço electrónico techsupport@invitrogen.com). A solução de pré-tratamento a quente (reagente A) pode ser utilizada até duas vezes antes de ser eliminada. a) Coloque as lâminas no suporte para lâminas. b) Aqueça a solução de pré-tratamento a quente (reagente A) num copo graduado, numa placa térmica, até que esteja a ferver regularmente e a temperatura registe 98 C. Para evitar que o tampão evapore, o copo graduado deve ser coberto com uma tampa de vidro ou folha de alumínio. c) Coloque as lâminas na solução a ferver, cubra o copo graduado, comece a medição do tempo quando a temperatura atingir os 98 C ou quando aparecerem novamente as bolhas da fervura, e ferva por 15 min. Certifique-se de que a temperatura permanece entre 98 C e 100 o C. d) Transfira as lâminas imediatamente para dh2o à temperatura ambiente (15-30 C). e) Lave três vezes em dh2o, 2 min. cada. 4. Digestão enzimática Nota: para a maioria dos tecidos mamários, 5 min. de digestão enzimática à temperatura ambiente (15-30 C) irão produzir resultados óptimos de CISH. O tempo de digestão deve ser ajustado com base nos resultados iniciais com 5 min. de tempo de digestão. Pode ser necessário um tempo de incubação enzimática diferente, consoante a espessura do tecido e o método de fixação. Um estudo de digestão enzimática indicou que o tempo de digestão enzimática pode variar entre 2-20 min. e irá produzir um sinal adequado de CISH para a avaliação de HER2 num conjunto de amostras arquivadas de tecido mamário. Num estudo de concordância para suportar o uso de CISH vs. FISH, que utilizou amostras de tecido de cancro da mama que tinham sido processadas nos doze meses anteriores à data do estudo, o tempo de digestão enzimática de 5 min. produziu sinais CISH óptimos para a avaliação do gene HER2 (28). a) Equilibre o reagente de pré-tratamento enzimático (reagente B) à temperatura ambiente (15-30 C). b) Adicione reagente B suficiente para cobrir a secção de tecido e incube por 5 min. à temperatura ambiente (15-30 C). c) Lave em dh2o três vezes, 2 min. cada. 5. Desidratação em série graduada de etanol: a) EtOH a 70% 2 min. b) EtOH a 85% 2 min. c) EtOH a 95% 2 min. d) EtOH a 100% 2 min. e) EtOH a 100% 2 min. PI Rev 0.0 Página 8 de 27

9 6. Secar as lâminas ao ar 20 min ou até estarem secas. Rotule as lâminas com um lápis, se necessário. 7. Desnaturação e hibridação Nota: use um dispositivo para PCR com ciclos térmicos, com um bloco para lâminas ou um bloco de aquecimento com indicação de temperatura e uma câmara de humidade para as lâminas com uma incubadora a 37 C, ou instrumentos semelhantes. Certifique-se de que a humidade das câmaras é mantida adequadamente. A hibridação realizada por períodos temporais mais curtos pode resultar num sinal mais fraco. A desnaturação da sonda a uma temperatura inferior à recomendada pode resultar num sinal CISH fraco ou ausente. A alteração dos tempos de incubação pode resultar ou num sinal mais fraco ou em coloração de fundo. a) Adicione 15 µl de sonda HER2 (reagente C) ao centro da lamela de 22 x 22 mm. Dependendo da dimensão do tecido, poderá ser necessária uma quantidade maior ou menor de sonda. Use o seguinte volume de sonda, com base na dimensão da lamela: 18 mm x 18 mm 10 µl 22 mm x 22 mm 15 µl 24 mm x 30 mm 20 µl b) Coloque a lamela, com o lado da sonda virado para baixo, na área apropriada da amostra de tecido sobre a lâmina. Podem utilizar-se as lamelas CISH UnderCover Slips da Invitrogen, em vez de uma lamela normal. Ao utilizar CISH UnderCover Slips, descole o revestimento de papel e coloque o lado com a lamela exposta (de onde acabou de retirar o papel) sobre a área apropriada da lâmina, de modo a cobrir a amostra de tecido. Devem premir-se os bordos da fita adesiva, de modo a vedar a lamela e evitar a evaporação. NÃO EXERCER PRESSÃO SOBRE O CENTRO DA LAMELA. c) Ao utilizar uma lamela normal, esta deve ser vedada de modo a evitar a evaporação por a incubação. A vedação pode conseguir-se utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha de 18G ½. Encha a seringa com a cola rubber cement e aplique uma camada fina nos bordos da lamela, passando ligeiramente para a lâmina. d) Deixe a cola secar (~10 min.) para evitar que a lamela deslize para fora da lâmina. e) A desnaturação e a hibridação podem ser realizadas utilizando um dispositivo de PCR com ciclos térmicos com bloco para lâminas ou um bloco de aquecimento com indicação digital da temperatura, juntamente com uma caixa com humidade para lâminas e uma incubadora a 37 C. 1) Se utilizar um dispositivo de PCR com ciclos térmicos: desnature a 95 ºC (± 1 ºC) por 5 min., seguido de incubação de um dia para o outro (10-18 h) a 37 ºC (± 1 ºC). 2) Se utilizar um bloco de aquecimento e uma câmara de humidade com incubadora a 37 C: desnature a 95ºC (± 1 C) por 5 min., seguido de incubação de um dia para o outro (10-18 h) a 37 ºC (± 1 C) numa câmara de humidade. Procedimento do dia 2 8. Preparação dos reagentes PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato) o Adicione uma embalagem de pó PBS (reagente E1) a 1 l de dh 2 O. Misture. PBS/tampão Tween 20 (Tween a 0,01%) o Adicione dez gotas de Tween 20 a 50% (reagente E2) a 1 l de PBS (da solução preparada tal como indicado anteriormente). Misture. o Conserve à temperatura ambiente (15-30 C) por um período de até uma semana. Solução cromogénica de substrato (DAB) o Prepare esta solução imediatamente antes de utilizar. o Adicione 1 gota de cada reagente (I1, I2, I3) a 1 ml de dh 2 O. Misture bem. H 2 O 2 a 3% em metanol absoluto o Adicione 1 parte de H 2 O 2 a 30% a 9 partes de metanol. o Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30 C) ou até que tenham sido processadas cem lâminas. Xileno (2 suportes de lâminas) o Cubra bem e conserve por até uma semana à temperatura ambiente (15-30 C) ou até que tenham sido processadas cem lâminas. PI Rev 0.0 Página 9 de 27

10 9. Lavagem adstringente Nota: a utilização de temperaturas superiores às recomendadas pelo procedimento poderá originar uma diminuição ou perda completa do sinal CISH. As lavagens a uma temperatura demasiado baixa podem resultar em elevado ruído de fundo. Tem de utilizar-se um termómetro calibrado para garantir que é atingida e mantida a temperatura exacta do banho de água. a) Ligue o banho de água a 70 ºC (±1 C) e aqueça-o até à temperatura pretendida. b) Prepare dois copos de misturadora contendo tampão SSC (reagente D), um à temperatura ambiente, o outro aquecido a 70 C. c) Descole a cola da lamela UnderCover Slip. Não deixe a secção de tecido secar. d) Para retirar a lamela sem rasgar o tecido: mergulhe previamente as lâminas em SSC à temperatura ambiente por ~2-3 min., até que as lamelas deslizem facilmente. Em seguida, prossiga para o passo seguinte. e) Enxagúe as lâminas brevemente no copo que contém SSC à temperatura ambiente (15-30 C), e em seguida mergulhe as lâminas por 5 min. no copo para misturadora que contém SSC no banho de água a 70 ºC (±1 C). f) Lave as lâminas em dh2o 3 vezes, 2 min. cada. 10. Imunodetecção a) Mergulhe as lâminas em H2O2 a 3% em metanol a 100% por 10 min. b) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada. c) Adicione CAS-Block TM (reagente F): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e incubar por 10 min. à temperatura ambiente (15-30 C). d) Seque o reagente F com papel de laboratório. Não enxagúe. e) Adicione anticorpo murino antidigoxigenina (reagente G): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 C). f) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada. g) Adicione conjugado de polímero HRP e antimurino de cabra (reagente H): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 C) numa câmara de humidade. h) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada. i) Durante a lavagem, prepare a solução de cromogénio substrato: adicione uma gota de cada reagente (reagentes I1, I2, I3) a 1 ml de dh 2 O. j) Adicione solução de cromogénio substrato (DAB): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 C) numa câmara de humidade. k) Coloque as lâminas no suporte para lâminas. l) Lave com água corrente da torneira por 2 min. 11. Contra-coloração e montagem Nota: faça a contracoloração brevemente, por 3-5 seg. e examine o tecido ao microscópio, sem a lamela. Faça a contracoloração por mais 3-5 seg. se pretender uma coloração nuclear mais intensa. O tempo de contracoloração depende dos tecidos utilizados. Não se recomenda uma contracoloração escura, uma vez que pode obscurecer sinais positivos de coloração. a) Faça a contracoloração do tecido com hematoxilina (reagente J): 3-5 seg. b) Lave com água corrente da torneira por 2 min. c) Desidrate numa série graduada de EtOH por 2 min. em cada graduação. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%, guardadas desde o dia 1 e utilizadas pela mesma ordem.) d) Mergulhe em xileno: 2 vezes, 2 min. cada. Esta lavagem de xileno tem de ser diferente da utilizada no dia 1. Pode ser reutilizada neste passo por um período de uma semana, ou até cem lâminas. e) Cubra com a lamela, utilizando a solução de montagem Histomount Mounting Solution (reagente K). f) Conserve as lâminas à temperatura ambiente (15-30 C) para análise futura dos resultados. Limitações do procedimento O conjunto SPOT-Light HER2 CISH pode não detectar os 5% (10) registados de cancros da mama que são positivos por imuno-histoquímica (immunohistochemistry, IHC) mas negativos para amplificação do gene HER2. CISH é um procedimento de múltiplos passos, que exige formação especializada quanto ao uso dos reagentes apropriados, selecção do tecido, fixação, processamento, preparação da lâmina CISH e interpretação dos resultados de coloração. PI Rev 0.0 Página 10 de 27

11 A coloração do tecido depende do manuseamento e processamento da amostra de tecido antes da coloração. A contracoloração excessiva ou incompleta pode comprometer a interpretação adequada dos resultados. Qualquer desvio do procedimento de exame recomendado pode invalidar os resultados esperados declarados; têm de ser empregues e documentados os controlos apropriados. Os utilizadores que se desviem do procedimento de exame recomendado têm de aceitar a responsabilidade pela interpretação dos resultados das amostras nessas circunstâncias. O conjunto SPOT-Light HER2 CISH foi optimizado apenas para a identificação e quantificação do gene HER2/neu em núcleos interfásicos, em amostras de tecido de cancro da mama humano incluído em parafina. Não foram validados outros tipos de amostras ou fixadores. A interpretação clínica de quaisquer resultados do exame deve ser avaliada no contexto do historial médico do doente e de outros resultados de exames laboratoriais de diagnóstico. Controlo de qualidade Controlos positivo e negativo numa única lâmina Lâmina de controlo L. A B Imagem 1. A lâmina de controlo L contém a linha celular A, não amplificada (MCF-7) e a linha celular B, amplificada (SK-OV-3). Nota: as linhas celulares não estão desenhadas à escala e são mais pequenas do que o indicado no diagrama. O sinal CISH deve ser castanho, distinto e fácil de avaliar. As lâminas de controlo incluídas (lâmina L) contêm duas secções de 4 µm, cortadas a partir de blocos de células FFPE preparados a partir de duas linhas celulares diferentes. Estas lâminas devem ser utilizadas como controlos para o procedimento. A linha celular A (MCF-7) é não amplificada e irá apresentar 5 sinais ou pontos por núcleo. A linha celular B (SK-OV-3) é amplificada e irá aparecer sob a forma de agrupamentos pequenos a grandes de DAB no núcleo. A lâmina de linha celular de controlo destina-se a ser executada juntamente com cada execução das lâminas de exame da doente e deve ser tratada da mesma forma que as secções de tecido. Se a lâmina de controlo (lâmina L) for negativa para ambas as linhas celulares, A e B, tal constitui uma indicação de que ocorreu um erro por o procedimento CISH. A linha celular de controlo positivo (B), conhecida para demonstrar amplificação de HER2, deve ser examinada primeiro para verificar se todos os reagentes estão a funcionar adequadamente. A presença de agrupamentos de genes, ou >5 sinais ou pontos individuais, no núcleo de uma única célula é indicador na reactividade positiva esperada. Se o controlo positivo falhar em demonstrar a presença de agrupamentos ou >5 sinais por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma, os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser considerados inválidos. A linha celular de controlo negativo ou normal (A), conhecida para demonstrar não amplificação de HER2, deve conter 5 pontos no núcleo de cada célula. Se ocorrer coloração não específica nos núcleos do controlo normal (A), os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser considerados inválidos. Se ocorrer coloração não específica, esta apresenta geralmente um aspecto de coloração difusa. Ocasionalmente, pode observar-se coloração castanha fora dos núcleos em secções de tecido com excesso de fixação em formalina. Nestes casos, os resultados devem ser interpretados cuidadosamente. A coloração não específica não deve ser confundida com sinais CISH positivos. Se utilizado, um controlo de tecido positivo, consistindo em tecido de cancro da mama conhecido para demonstrar amplificação de HER2, deve mostrar a presença de agrupamentos de genes ou >5 sinais ou pontos individuais por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma, o que indica a reactividade positiva esperada. Se o controlo de tecido positivo falhar em demonstrar a presença de agrupamentos ou >5 sinais por núcleo em >50% de células tumorais, os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser considerados inválidos. Se utilizado, um controlo de tecido negativo, consistindo em tecido de cancro da mama conhecido para demonstrar não amplificação de HER2, deve conter <5 sinais por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma. Em geral, a presença de não mais de dois sinais ou pontos nos núcleos da parte de tecido normal (células epiteliais normais ou células com estroma no tumor) do controlo positivo de tecido, confirma que a sonda e os reagentes de imunodetecção não estão a fazer reacções cruzadas com os componentes celulares ou do tecido. Se ocorrer coloração não específica nos núcleos da parte de tecido normal do controlo positivo de tecido, os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser considerados inválidos. PI Rev 0.0 Página 11 de 27

12 A variação no processamento do tecido e os procedimentos técnicos no laboratório do utilizador tem de ser validada, uma vez que pode produzir uma variabilidade significativa nos resultados, necessitando da realização regular de controlos internos para além dos procedimentos seguintes. Interpretação Avaliação da adequabilidade das lâminas Os pontos (sinais) de HER2 CISH devem ser pequenos mas claramente discerníveis, utilizando uma objectiva de 20x-40x. Os pontos irão parecer castanhos em contraste com a contracoloração. Se não houver pontos aparentes na amostra, o ensaio tem de ser repetido. Contacte a Assistência Técnica da Invitrogen através do número (apenas nos EUA ) para debater as possíveis causas do problema. Aspecto do sinal CISH consulte o anexo A, Guia de interpretação do exame HER2 CISH Os pontos HER2 CISH irão aparecer sob a forma de: Um ponto isolado (figura G). Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado, nas células normais ou de carcinoma. Um ponto isolado representa uma única cópia do gene HER2. Uma parelha (figura H). Os pontos aparecem como pares e não representam um verdadeiro agrupamento pequeno. Se dois sinais estiverem separados por uma distância inferior ao diâmetro de um sinal, estes sinais devem ser contabilizados como um único ponto. A parelha é o resultado dos cromossomas em divisão, estando cada um dos sinais localizado no par de cromatídeos irmãos 29. Um agrupamento pequeno (figura E). Um agrupamento pequeno é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem 3-5 vezes o diâmetro de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma. Um agrupamento grande (figura A). Um agrupamento grande é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem um diâmetro mais de cinco vezes superior ao de um ponto isolado. Deve ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma. Ampliação Sinal CISH 10x Os pontos isolados quase não se vêem e são facilmente ignorados. 20x Os pontos isolados são pequenos mas claramente discerníveis. 40x Os pontos isolados são facilmente identificados. 60x ou 100x Não é necessária esta ampliação. Selecção dos campos-alvo para a enumeração do sinal HER2 CISH: Utilizando as objectivas de 4x-20x, esquadrinhe a amostra com coloração CISH para identificar as áreas histopatologicamente mais representativas de carcinoma invasivo. Evite áreas de necrose, sobreposição de sinais devido a sobreposição de núcleos e núcleos com uma fraca intensidade de sinal. Evite os componentes de carcinoma intraductal (DCIS) nos carcinomas invasivos. Avalie a possível heterogeneidade intratumoral no estado do gene HER2 antes da enumeração de CISH. Se a amostra for homogénea, seleccione uma área de tecido com sinais CISH intensos para a enumeração de sinal. Prossiga para a enumeração de sinal. Se a amostra apresentar heterogeneidade intratumoral do estado do gene HER2 no componente de carcinoma invasivo, seleccione as áreas que representam cada estado do gene HER2 para a enumeração de sinal. Uma amostra de tecido é heterogénea se o estado do gene HER2 (células amplificadas e não amplificadas) variar em áreas diferentes da mesma secção de um cancro da mama primário. É necessário avaliar as células em cada área de heterogeneidade para determinar qual o estado de HER2 (amplificado ou não amplificado) que predomina em mais de 50% da secção de tumor. Prossiga para a enumeração de sinal da área onde o estado de HER2 é predominante para este tumor. Enumeração de sinal Utilize uma objectiva de 40x. Pode ser utilizada uma objectiva de maior ampliação, se necessário, mas não é preciso utilizar óleo de imersão. Consulte o anexo A, Guia de interpretação do exame HER2 CISH. Um gene HER2 individual apresenta-se sob a forma de um pequeno ponto isolado, redondo (figura G). Não conte os núcleos que se sobrepõem nem quaisquer áreas em que os núcleos não sejam visíveis. Conte apenas o sinal CISH que se encontra no interior de um núcleo. Exclua os sinais esporádicos ocasionais, que podem ser devidos a restos de derramamento de ADN HER2 provenientes da renovação das células cancerígenas, fora dos núcleos. PI Rev 0.0 Página 12 de 27

13 Não amplificação o Definida como 1-5 pontos isolados na maioria (>50%) das células do carcinoma na área de tecido seleccionada. o Não é necessário contar os pontos em trinta células. Opcional: use a folha de trabalho do anexo B, Folha de marcação de HER2 CISH para a contagem das células. Registe os resultados sob a forma da média da contagem de trinta células, para obter um diagnóstico claro de não amplificação. Amplificação o Definida como: o >5 pontos na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada, ou o Agrupamentos grandes na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada, ou o Uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos grandes na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada, ou o Uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos pequenos na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada, ou o Agrupamentos pequenos na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada. o Para qualquer dos casos descritos acima, não é necessário contar os pontos nas trinta células. Opcional: use a folha de trabalho do anexo B, Folha de marcação de HER2 CISH, para a contagem das células. Registe os resultados sob a forma da média da contagem de trinta células para obter um diagnóstico claro de amplificação. Para efeitos de contagem, conte um agrupamento pequeno como 5 pontos e um agrupamento grande como 10 pontos. o Fundamentação: a atribuição de números específicos de pontos aos agrupamentos pequenos ou grandes é arbitrária para efeitos de quantificação. As células normalmente têm duas cópias do gene HER2. As células que replicaram o seu ADN mas ainda não se dividiram têm 4 cópias do gene. Portanto, um agrupamento pequeno constitui uma indicação de amplificação e terá um número mínimo de 5 cópias do gene. Um agrupamento grande, com pelo menos o dobro do tamanho de um agrupamento pequeno, terá um número mínimo de 10 cópias do gene. Casos pouco claros de amplificação ou não amplificação Interprete com cuidado as amostras que não pertencem claramente às categorias de amplificação ou não amplificação. Estas amostras apresentam 4-6 pontos na maioria (>50%) das células de carcinoma no campo-alvo seleccionado. Quando o número médio de pontos se encontra entre os 4 e os 6 após a contagem de trinta células de carcinoma, devem contar-se outras trinta células, ficando com um total de sessenta células. Se ainda assim persistirem dúvidas, o ensaio deve ser repetido com uma nova lâmina da amostra. Registe os resultados utilizando a folha de trabalho do anexo B, Folha de marcação de HER2 CISH. 1. Conte os pontos em trinta células tumorais na área de tecido seleccionada. Se estiverem evidentes agrupamentos pequenos, consulte o n. 4, a seguir. 2. Faça a soma do número total de pontos nas trinta células e registe a média. 3. Registe o resultado com base na média de sessenta células. 4. Caso se observe uma mistura de pontos isolados e agrupamentos pequenos (devido ao agrupamento de vários pontos isolados), ou caso se observem apenas agrupamentos pequenos: Conte um agrupamento pequeno como 5 pontos. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma, da mesma lâmina, para a determinação do que representa um agrupamento pequeno. 5. Registe os resultados sob a forma da média da contagem de sessenta células para obter um diagnóstico de amplificação ou de não amplificação, de acordo com as Orientações Invitrogen. Registo dos resultados Os resultados podem ser registados utilizando a folha de trabalho do anexo B, Folha de marcação de HER2 CISH. O registo do estado de HER2 tem de ser feito de acordo com as Orientações Invitrogen, sobretudo para os casos pouco claros de amplificação ou não amplificação. PI Rev 0.0 Página 13 de 27

14 Resumo de interpretação Amplificação Não amplificação >5 pontos, ou agrupamentos grandes, ou uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos grandes, ou uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos pequenos, ou agrupamentos pequenos do gene HER2 presentes por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma na área de tecido seleccionada para enumeração. Veja as figuras A, B, C, D e E do anexo A, Guia de interpretação do exame HER2 CISH. Um agrupamento grande é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem um diâmetro mais de cinco vezes superior ao de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma. Veja o anexo A, figura A. Um agrupamento pequeno é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem 3-5 vezes o diâmetro de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma. Veja o anexo A, figura E. 1-5 pontos do gene HER2 presentes por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma na área de tecido seleccionada para enumeração. Veja o anexo A, figura F, figura G e figura H. Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado e está presente nas células normais e de carcinoma. PI Rev 0.0 Página 14 de 27

15 Valores esperados A prevalência do gene HER2 amplificado na população de mulheres com cancro da mama em geral é de 18-30% (8, 9). Ao comparar a amplificação do gene HER2 com a sobre-expressão da proteína HER2, os estudos mostraram que até 5% das doentes com cancro da mama são positivas para sobre-expressão da proteína quando testadas através de imunohistoquímica (IHC) mas negativas quanto à amplificação do gene (10). Características específicas de desempenho Desempenho clínico A segurança e eficácia do conjunto SPOT-Light HER2 CISH foram avaliadas num estudo comparativo de três exames: o conjunto SPOT-Light HER2 CISH, PathVysion FISH e HercepTest. O estudo envolveu dois conjuntos de casos: 226 casos consecutivos e sessenta casos suplementares. Os casos consecutivos foram seleccionados a partir de casos consecutivos de cancro da mama invasivo examinados na prestação de cuidados a doentes em dois centros (centros A e B). Os casos suplementares foram casos que tinham sido classificados como 2+ através de imuno-histoquímica (IHC) (utilizando o anticorpo AB8) por a prestação de cuidados a doentes no centro A. A. Casos consecutivos A tabela seguinte resume a distribuição dos resultados de CISH e FISH em relação às classificações com o HercepTest. Os exames foram considerados válidos quando a lâmina corada resultante estava aceitável para avaliação. Tabela 1: Resultados de IHC, FISH e CISH Expressão proteica, pontuação HercepTest Total Casos IHC (N) (%) 1 63,8% 8,6% 9,5% 18,1% 100% Rácio de genes com estado FISH HER2 Número de casos FISH válidos N amplificados (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 N não amplificados (%) (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Cópias de genes com estado CISH HER2 Número de casos CISH válidos N amplificados (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 N não amplificados (%) (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) % = N N Total 100%. 2 Número de casos FISH (ou CISH) válidos, com a pontuação IHC correspondente. 3 % = n Número total de casos FISH (ou CISH) válidos 100%. Resultados CISH Tabela 2: Concordância entre CISH e IHC Resultados IHC Positivos (3+) Negativos (<3+) Total Amplificados Não amplificados Total Vinte casos foram registados como resultados de exame IHC ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela. Concordância positiva = 32/38 = 84,2% (IC a 95%: 68,8%, 94,0%) Concordância negativa = 164/168 = 97,6% (IC a 95%: 94,0%, 99,4%) Percentagem total de concordância = (32+164)/206 = 95,1% (IC a 95%: 91,3%, 97,7%) Os resultados mostraram uma concordância de 95,1% (IC a 95%: 91,3% - 97,7%), indicando uma forte concordância entre o conjunto SPOT-Light HER2 CISH e o HerceptTest. PI Rev 0.0 Página 15 de 27

16 Resultados CISH Tabela 3: Concordância entre CISH e FISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Foram registados 21 casos como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela. Concordância positiva = 34/36 = 94,4% (IC a 95%: 81,3%, 99,3%) Concordância negativa = 169/169 = 100,0% (IC a 95%: 97,8%, 100,0%) Percentagem total de concordância = (34+169)/205 = 99,0% (IC a 95%: 96,5%, 99,9%) Os resultados mostraram uma concordância de 99,0% (IC a 95%: 96,5% - 99,9%), indicando uma forte concordância entre o exame do conjunto SPOT-Light HER2 CISH e o exame PathVysion HER2. Portanto, a taxa de concordância indicou que o exame do conjunto SPOT-Light HER2 CISH originou resultados equivalentes aos do exame PathVysion HER2. A seguir, apresenta-se um resumo dos dois casos discordantes entre o exame da sonda SPOT-Light HER2 e o exame da sonda PathVysion HER2. Os dados CISH e FISH são apresentados sob a forma de média e intervalo, e a coluna de IHC apresenta a pontuação do HercepTest. Número do caso HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.) Tabela 4: Casos discordantes entre FISH e CISH CISH FISH IHC Número do caso (2, 0,98%) 1 HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00-4,00) 2,65 (1,00-6,00) 2+ 1 % = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente 100%. B. Casos 2+ suplementares com IHC Foram fornecidos sessenta casos 2+ suplementares com IHC pelo centro de estudo A, que foram testados nos centros de estudo A e B. Os resultados de cada centro de estudo demonstraram que o exame do conjunto SPOT-Light HER2 CISH originou resultados que foram equivalentes aos do exame PathVysion HER2. Os resultados de correlação encontram-se resumidos nas tabelas 5 e 6. Tabela 5: Concordância entre CISH e FISH no centro de estudo A em Casos IHC 2+ Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Cinco casos foram registados como ausentes ou inválidos. Concordância positiva = 6/8 = 75,0% (IC a 95%: 34,9%, 96,8%) Concordância negativa = 46/46 = 100,0% (IC a 95%: 92,3%, 100,0%) Percentagem total de concordância = (6+46)/54 = 96,3% (IC a 95%: 87,3%, 99,6%) Tabela 6: Concordância entre CISH e FISH no centro de estudo B em Casos IHC 2+ Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Quatro casos foram registados como ausentes ou inválidos. Concordância positiva = 7/9 = 77,8% (IC a 95%: 40,0%, 97,2%) Concordância negativa = 45/47 = 95,7% (IC a 95%: 85,5%, 99,5%) Percentagem total de concordância = (7+45)/56 = 92,9% (IC a 95%: 82,7%, 98,0%) PI Rev 0.0 Página 16 de 27

17 Número do caso Tabela 7: Casos 2+ com IHC discordantes entre CISH e FISH HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.) CISH FISH IHC Número do caso Centro A (2, 3,70%) 1 HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.) CISH FISH IHC S ,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ S ,67 (1,00-7,00) 2,34 (0,50-8,00) 2+ Centro B (4, 7,14%) 1 S-171 5,20 (2,00-8,00) 1,08 (0,50-2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00-9,00) 2,23 (1,00-5,00) 3+ S ,00 (20,00-20,00) 1,25 (0,50-2,00) 0 S-183 4,13 (3,00-6,00) 2,73 (1,00-6,00) 0 1 % = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente 100%. C. Casos 2+ com HercepTest Todos os casos consecutivos e suplementares foram testados com HercepTest. Os casos que produziram pontuações 2+ com HercepTest foram combinados e testados em ambos os centros de estudo. Os resultados de cada centro de estudo demonstraram que o conjunto SPOT-Light HER2 CISH originou resultados equivalentes aos do exame PathVysion HER2. Os resultados de correlação encontram-se resumidos nas tabelas 8 e 9. Tabela 8: Concordância entre CISH e FISH nos casos 2+ com HercepTest no centro de estudo A Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Dois casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela. Concordância positiva = 3/7 = 42,9% (IC a 95%: 9,9%, 81,6%) Concordância negativa = 27/27 = 100,0% (IC a 95%: 87,2%, 100,0%) Percentagem total de concordância = (3+27)/34 = 88,2% (IC a 95%: 72,6%, 96,7%) Tabela 9: Concordância entre CISH e FISH nos Casos 2+ com HercepTest no centro de estudo B Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Dois casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela. Concordância positiva = 4/5 = 80,0% (IC a 95%: 28,4%, 99,5%) Concordância negativa = 35/36 = 97,2% (IC a 95%: 85,5%, 99,9%) Percentagem total de concordância = (4+35)/41 = 95,1% (IC a 95%: 83,5%, 99,4%) Número do caso Tabela 10: Casos 2+ com HercepTest discordantes entre CISH e FISH HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.) CISH FISH IHC Número do caso Centro A (4, 11,76%) 1 HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ B ,77 (1,00-4,00) 2,45 (1,00-5,00) 2+ S ,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ S ,67 (1,00-7,00) 2,34 (0,50-8,00) 2+ Centro B (2, 4,88%) 1 A-023 5,20 (2,00-8,00) 1,49 (0,67-3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00-4,00) 2,65 (1,00-6,00) 2+ 1 % = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente 100%. PI Rev 0.0 Página 17 de 27

18 D. Casos de polissomia Dois centros de estudo avaliaram os casos de polissomia com base nas respectivas práticas clínicas institucionais. No centro A, a polissomia do cromossoma 17 foi definida como sendo a presença de 3 sinais CEP17 em pelo menos 10% das células tumorais, enquanto no centro B o critério era a presença de 3 sinais CEP17 em pelo menos 30% das células tumorais. A frequência dos tumores com polissomia do cromossoma 17 foi de 18,68% no centro A e de 7,91% no centro B. A taxa de detecção de polissomia no mesmo conjunto tumoral variou substancialmente entre os dois centros de exame, devido à diferença na definição de polissomia utilizada em cada um deles. O nível de concordância obtido independentemente em cada centro de estudo indicou que o conjunto SPOT-Light HER2 CISH originou resultados que foram equivalentes aos do exame PathVysion HER2. Os resultados encontram-se resumidos nas tabelas 11 e 12. Tabela 11: Concordância entre CISH e FISH nos Casos de Polissomia no centro de estudo A Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Três casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela. Concordância positiva = 12/14 = 85,7% (IC a 95%: 57,2%, 98,2%) Concordância negativa = 34/34 = 100,0% (IC a 95%: 89,7%, 100,0%) Percentagem total de concordância = (12+34)/48 = 95,8% (IC a 95%: 85,8%, 99,5%) Tabela 12: Concordância entre CISH e FISH nos Casos de Polissomia no centro de estudo B Resultados CISH Resultados FISH Amplificados Não amplificados Total Amplificados Não amplificados Total Nenhum caso foi registado como resultado de exame FISH ou CISH ausente ou inválido e excluído da tabela. Concordância positiva = 12/12 = 100,0% (IC a 95%: 73,5%, 100,0%) Concordância negativa = 9/10 = 90,0% (IC a 95%: 55,5%, 99,8%) Percentagem total de concordância = (12+9)/22 = 95,5% (IC a 95%: 77,2%, 99,9%) Núme ro do caso Tabela 13: Casos de polissomia discordantes entre CISH e FISH HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.) CISH FISH IHC Número do caso Centro A (2, 4,17%) 1 HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.) CISH FISH IHC A ,07 (1,00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ S ,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ Centro B (1, 4,55%) 1 A-023 5,20 (2,00-8,00) 1,49 (0,67-3,50) 2+ 1 % = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente 100%. PI Rev 0.0 Página 18 de 27

19 E. Resumo dos resultados de comparação entre o conjunto SPOT-Light HER2 CISH e o conjunto de sonda de ADN PathVysion HER2 DNA Probe Kit Tabela 14: Resumo do conjunto SPOT-Light HER2 CISH e PathVysion HER2 DNA Probe Kit Tipo de casos Casos consecutivos Casos suplementares Casos equívocos Casos de polissomia Centro A Centro B Centro A Centro B Centro A Centro B Número de amostras % de concordância positiva % de concordância negativa % total de concordância ,4% 75,0% 77,8% 42,9% 80,0% 85,7% 100,0% 100,0% 100,0% 95,7% 100,0% 97,2% 100,0% 90,0% 99,0% 96,3% 92,9% 88,2% 95,1% 95,8% 95,5% Sensibilidade analítica A sensibilidade do conjunto SPOT-Light HER2 CISH foi testada utilizando secções de tecido de cancro da mama FFPE com estado não amplificado e amplificado de HER2, bem como as linhas celulares FFPE utilizadas nas lâminas de controlo. O gene HER2 foi detectado como sendo um ponto isolado na secção de tecido e na secção de bloco celular com gene HER2 normal. Cada amostra amplificada e não amplificada demonstrou uma coloração de intensidade 3+ e boa morfologia tecidular. Eficiência de hibridação A eficiência de hibridação foi estabelecida testando duas amostras de tecido (uma amplificada, uma não amplificada, dez secções de cada) e quatro amostras de linha celular (duas amplificadas, duas não amplificadas). Cada amostra foi analisada quanto ao número de células com sinais HER2 em relação ao número total de células analisadas ( células). A eficiência de hibridação foi estabelecida como sendo de 94,7-100%. Para a coloração CISH de 226 amostras clínicas, de três laboratórios, a taxa de insucesso em cada centro foi de 8,4% (19), 1,3% (3) e 0,9% (2) (28). Especificidade analítica Para determinar a especificidade, os estudos metafásicos foram realizados em lâminas preparadas citogeneticamente; foi realizado PCR utilizando um par primer específico para o gene HER2 no modelo da sonda de ADN HER2, e a sequenciação de ADN foi realizada para ambas as extremidades dos clones BAC utilizados na sonda de ADN HER2. A sonda SPOT-Light CISH HER2 demonstrou ligar-se especificamente ao lócus genético HER2 na banda cromossómica 17q A localização do cromossoma foi estabelecida através de FISH metafásico em linfócitos normais; o exame PCR demonstrou a banda de ADN pretendida e a sequenciação de ADN demonstrou a localização correcta do cromossoma e a cobertura do gene HER2. Limites do procedimento O procedimento SPOT-Light HER2 CISH foi testado nos extremos de cada um dos seguintes parâmetros: espessura do tecido, pré-tratamento, desnaturação, hibridação, lavagem adstringente, imunodetecção e contracoloração. Não foram observadas diferenças significativas nos resultados CISH nas seguintes condições: PI Rev 0.0 Página 19 de 27

20 Tabela 15: Limites do procedimento Intervalos aceitáveis para os parâmetros do ensaio Espessura do tecido 4-6 µm Pré-tratamento a quente Digestão enzimática C min min. Desnaturação PCR com ciclos térmicos C 2-8 min. Hibridação C h Lavagem adstringente C 2-8 min. Imunodetecção Conjugado de polímero HRP 25v60 min. Contra-coloração Cromogénio DAB min seg. Reprodutibilidade Foram testados três lotes distintos do conjunto SPOT-Light HER2 CISH em três amostras de tecido de cancro da mama e em quatro amostras de linhas celulares, com níveis diferentes do gene HER2. Não houve alteração no desempenho do ensaio nos três lotes testados. Reprodutibilidade inter-execuções (de dia para dia) O estudo realizou a avaliação da reprodutibilidade inter-execuções de CISH em três dias diferentes, utilizando amostras de cancro da mama com três tipos de estados de HER2 e com três amostras de cada tipo. O resumo é o seguinte: Tabela 16: Reprodutibilidade inter-execuções (de dia para dia) Cópias do gene N Não amplificados Não amplificados, Amplificados polissomia Média de N = 9 1,79 3,45 20,22 Desvio-padrão 9 0, ,72 CV 9 3% 4% 8% Estudo da reprodutibilidade de observador para observador Três patologistas fizeram formação para a leitura de lâminas preparadas e coradas, utilizando o conjunto SPOT- Light HER2 CISH. Para validar a competência, foram entregues a cada patologista oito lâminas pré-coradas (seis não amplificadas e duas amplificadas) fornecidas pela Invitrogen. Com ambos os tipos de casos (não amplificado e amplificado), todas as amostras (100%) foram interpretadas com exactidão. PI Rev 0.0 Página 20 de 27