Kit CISH de HER2 SP T-Light da Zymed ( ) (Bom para 20 lâminas)

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1 Kit CISH de HER2 SP T-Light da Zymed ( ) (Bom para 20 lâminas) I. UTILIZAÇÃO PREVISTA Para utilizar em diagnóstico in vitro O kit CISH de HER2 SP T-Light da Zymed destina-se a detectar a amplificação do gene HER2 em secções de tecidos fixados com formol e embutidos em parafina (FFPE) usando hibridização cromogénica in situ (CISH ). A interpretação deve ser feita dentro do contexto do historial clínico do paciente por um patologista qualificado. II. RESUMO E EXPLICAÇÃO Antecedentes HER2 O gene humano HER2, ou c-erbb-2, e o gene equivalente na ratazana, neu, têm sido identificados como protooncogenes (2-4) que partilham homologia com o seu parente próximo, o oncogene v-erbb. (2) O gene HER2 está localizado no cromossoma 17 (17q12-21) e codifica uma proteína de tipo receptor de membrana 185 kda. O HER2 tem actividade de tirosina quinase e partilha homologia com (mas de forma distinta) o receptor do factor de crescimento epidérmico (conhecido como EGFr, HER1, ou c-erbb-1). (3) A amplificação do gene HER2 ou a sobre-expressão da proteína HER2 foram identificados em 10 a 34% dos cancros invasivos da mama, de acordo com uma série de 52 estudos publicados com mais de pacientes usando diversas metodologias. (5) A identificação do gene HER2 e o estado da proteína são importantes para determinar o prognóstico de doentes com diagnóstico de cancro invasivo da mama, bem como para seleccionar um subgrupo deles com metástases e sobre-expressão e/ou amplificação de HER2 para terapia com Trastuzumab (Herceptin, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EUA), (5-7) um anticorpo monoclonal da proteína HER2. Descobriu-se que o Trastuzumab é uma terapia eficaz não só em doentes cujos tumores apresentam amplificação do gene HER2 e/ou sobre-expressão da proteína HER2. (10) Portanto, os métodos de avaliação do estado do gene e da proteína HER2 que sejam exactos, uniformes e simples têm-se tornado cada vez mais importantes. Tecnologia de sonda de subtracção (SPT ) A SPT da Zymed é uma tecnologia detida e patenteada pela Zymed que cria sondas específicas para eliminar sequências repetitivas (por ex., elementos Alu e LINE) encontrados em ácidos nucleicos humanos. Consequentemente, as sondas SPT da Zymed são inerentemente específicas e não necessitam de bloqueios de sequências repetitivas, conforme necessário para sondas citogenéticas de ADN tradicionais. A tecnologia SPT da Zymed permite a avaliação de aberrações genéticas utilizando a detecção cromogénica. Descrição e especificidade da sonda de ADN A sonda de HER2 SP T-Light da Zymed (Reagente A) é uma sonda de ADN de cadeia dupla que foi marcada com digoxigenina. É fornecida como um líquido em tampão de hibridização. Foi demonstrado que contém o gene HER2 por PCR, e que se liga especificamente ao locus do gene HER2 no cromossoma 17q12-21 por metafase FISH em linfócitos normais. As sequências repetitivas de ácido nucleico foram quantitativamente retiradas da sonda pela tecnologia SPT. Procedimento do princípio de CISH TM (hibridização cromogénica in situ) A hibridização cromogénica in situ (CISH TM ) permite a detecção da amplificação de genes, translocações de cromossomas e número de cromossomas usando reacções de peroxidase convencionais sob microscópio de campo brilhante em tecidos (4-5 µm de espessura) fixados em formol e embebidos em parafina (FFPE). A essência da CISH TM é a capacidade de sondas marcadas de ácido nucleico de hibridizar (ligar-se a), in situ, secções específicas de ácido nucleico complementar na amostra. Os resultados de hibridização da sonda podem então ser visualizados no contexto da morfologia do tecido circundante. Assim, os patologistas podem visualizar a morfologia do tecido e as aberrações dos genes simultaneamente.

2 Os resultados da coloração de CISH TM podem ser claramente visualizados com um microscópio de campo brilhante normal e uma lente seca de 40x. Uma vez que o sinal DAB é permanente, os resultados podem ser armazenados durante um período longo, originando um registo de teste permanente. Com a metodologia de imunodetecção CISH TM, a análise de resultados é rápida e fácil. A vantagem mais importante do CISH TM é que a detecção de aberrações genéticas, bem como a verificação da histopatologia, podem ser efectuadas simultaneamente. Os tumores com amplificação do gene HER2 apresentam-se tipicamente como grandes aglomerados de cópias de genes intranucleares positivos para a peroxidase, como numerosos pequenos sinais individuais positivos de peroxidase, ou como uma mistura de aglomerados e de cópias individuais de genes. Os tumores com baixa amplificação de HER2 revelam tipicamente 6 a 10 cópias de genes por núcleo. Os tumores com o estado normal do gene HER2 apresentam tipicamente 1 a 2 pontos por núcleo, enquanto que os tumores com polissomia do cromossoma 17 revelam 3 a 5 cópias do gene HER2 por núcleo. III. REAGENTES FORNECIDOS O kit CISH de HER2 SP T-Light da Zymed é um kit completo que inclui todos os reagentes e tampões necessários, em formas convenientes prontas a usar, incluindo os reagentes de pré-tratamento de tecidos, a sonda de HER2, reagentes de detecção e solução de contracoloração. O sistema de detecção da peroxidase usa o método altamente sensível de detecção de polímero HRP que é propriedade da Zymed e o DAB para o desenvolvimento do sinal. O kit também inclui lâminas de controlo fixadas com formol e embutidas em parafina que têm, de cada lado, tanto as linhagens de células de cancro da mama altamente amplificadas de HER2, como as não amplificadas. Um componente chave deste kit é o guia de interpretação totalmente a cores que serve para ajudar a fazer a interpretação dos resultados do CISH TM para HER2. Reagente A. 0,4 ml de sonda de HER2 marcada com digoxigenina SP T-Light (pronta a usar) Reagente B. 1 L de solução de pré-tratamento térmico, ph 7,0 (pronta a usar) Reagente C. 500 ml de tampão SSC (pronto a usar) Reagente D. 100 ml de hematoxilina de Mayer (pronta a usar) Reagente E. 1 pacote de pó de PBS (para 1 l de PBS) Reagente F. 5 ml de reagente de pré-tratamento enzimático (pronto a usar) Reagente G. 3 ml de CAS-Block TM (pronto a usar) Reagente H. 3 ml de anticorpo anti-digoxigenina de rato (pronto a usar) Reagente I. 3 ml de anticorpo HRP anti-rato polimerizado (pronto a usar) Reagente J1. 1 ml de tampão de substrato concentrado (20x) Reagente J2. 1 ml de solução de DAB concentrada (20x) Reagente J3. 1 ml de água oxigenada a 0,6% (20x) Reagente K. 4 ml de solução de montagem Histomount TM Reagente L. 2 lâminas de processo de controlo de células, fixadas com formol e embebidas em parafina, contendo cada uma tanto as linhagens de células de cancro da mama HER2 não amplificadas como as altamente amplificadas.

3 IV. REAGENTES/MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Reagentes/materiais auxiliares Zymed Cat. N.º 1. Lâminas SuperFrost Plus OU Adesivo de lâmina HistoGrip TM [Opcional] Controlo positivo de tecido: secção de tecido FFPE com amplificação do gene HER2 3. [Opcional] Controlo negativo de tecido: secção de tecido FFPE sem amplificação do gene HER2 4. Água desionizada ou destilada (dh 2 O) 5. Xileno 6. Etanol (EtOH) a 70%, 85%, 95% e 100% 7. Lamelas de cobertura, cola de borracha, agulha 18G ½ e seringa de 5 ml OU 8. [Opcional] Lamelas UnderCover (18x18 mm) [Opcional] Lamelas UnderCover (22x22 mm) Água oxigenada (H 2 O 2 )a 30% 11. Metanol a 100% 12. Tween 20 a 50% Equipamento 1. Temporizador 2. Pipeta (p20, p1000) 3. Pontas de pipeta 4. Prateleira de lâminas 5. Placa quente, folha de alumínio e frasco de 1 litro 6. Aquecedor de lâminas 7. Incubadora a 37 C 8. Bloco de aquecimento com visor de temperatura digital e caixa de lâminas de humidade OU Termociclador por PCR com um bloco para lâminas 9. Banho-maria (capaz de manter um nível de temperatura de C) 10. Jarros de ligação e jarros de coloração 11. Microscópio de campo brilhante V. ARMAZENAGEM Armazene a sonda de HER2 SP T-Light (Reagente A) a 20 C Armazene os reagentes B, C e D à temperatura ambiente. Armazene os outros componentes (Reagentes E-L) a 2 a 8 C Tenha em atenção que a 20 C, a sonda de HER2 SP T-Light (Reagente A) não congela, já que permanece num estado aquoso, de maneira que não haverá problemas associados com a congelação/descongelação. Não utilize kits que tenham ultrapassado a data de validade impressa na embalagem. Se os produtos forem armazenados em condições diferentes das especificadas nos folhetos das embalagens, as condições de armazenagem devem ser verificadas pelo utilizador. VI. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO A. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS Secções de tecido embebidas em parafina: i. Os tecidos fixados em formol tamponado neutro durante horas antes de embeber em parafina são adequados para utilização. As secções de tecido (4-5 µm de espessura) devem ser montadas em lâminas para microscópio tratadas com HistoGrip TM ou Superfrost/Plus. ii. Lâminas secas ao ar, ou secas a 37 C e depois aquecidas 2-4 horas a 60 C. B. PREPARAÇÃO DE REAGENTES

4 PBS (Soro fisiológico com tampão de fosfato) Acrescente 1 pacote de pó PBS (Reagente E) a 1 L de dh 2 O. Misture. Tampão PBS/Tween 20 (0,025%) Acrescente 1 parte de Tween-20 a 50% a 1999 partes de PBS. Misture. Solução de substrato-cromogénio (DAB) Para fazer DAB, acrescente 1 gota de cada reagente (J1, J2, J3) a 1 ml de dh 2 O. Misture bem. Esta solução deverá ser preparada imediatamente antes da sua utilização. Séries de álcool Prepare etanol a 70%, 85%, 95% e 100%. H 2 O 2 a 3% em metanol absoluto Acrescente 1 parte de H 2 O 2 a 30% a 9 partes de metanol. C. PROTOCOLO CISH STANDARD PARA AMOSTRA DE TECIDO FFPE Todos os reagentes, à excepção do Reagente A (sonda de HER2), deverão ser estabilizados à temperatura ambiente (TA) (20 a 25 C) antes da respectiva utilização. A sonda de HER2 pode ser usada fria e sem estabilização à temperatura ambiente. Cada incubação deverá ser efectuada à TA (20-25 C), a não ser que seja indicado de forma diferente. Ao longo de todo o procedimento, é importante que a secção de tecido não desidrate, a não ser que indicado em contrário. 1. Pré-tratamento (apenas para secções de tecido FFPE) a) Desparafinação: Mergulhe em xileno. 2 vezes, 5 min. cada Embeba em EtOH a 100%. 3 vezes, 3 min. cada Lave em dh 2 O. 3 vezes, 2 min. cada (Se o passo seguinte não puder ser efectuado imediatamente, seque as lâminas ao ar após embebê-las em EtOH a 100% três vezes em vez de lavar as lâminas em dh 2 O três vezes.) b) Pré-tratamento térmico (O passo mais crítico para uma execução de CISH com êxito): As lâminas/amostras devem ser fervidas ou aquecidas a uma temperatura superior a 98 C durante 15 min. em solução de pré-tratamento térmico CISH (Reagente B). Recomendamos que seja usada a placa quente para este passo. (Para protocolos que usem equipamento diferente, contacte os serviços técnicos: Zymed Technical Service através do i. Coloque as lâminas nas prateleiras de lâminas. ii. Aqueça a solução de pré-tratamento térmico (Reagente B) num copo sobre uma placa quente, até que esteja a ferver de forma contínua, e a = 98 C. Para impedir a evaporação do tampão, este frasco deve ser coberto com uma tampa de vidro ou com uma folha de alumínio. iii. Coloque as lâminas na solução a ferver, tape o frasco e ferva durante 15 min. iv. Transfira as lâminas imediatamente para dh 2 O à TA (20-25 C) e lave três vezes, 2 min. cada. c) Digestão por enzima (Um passo crítico para uma execução de CISH com êxito): Para a maior parte dos tecidos da mama, 10 min. a digestão por enzima à temperatura ambiente produzirá os melhores resultados de CISH (acrescente pepsina à TA na secção do tecido). Podem ser necessários diferentes períodos de incubação de enzimas (5-15 min.), dependendo do tipo de tecido e do método de fixação. i. Estabilize o reagente de pré-tratamento enzimático (Reagente F) à TA (20 a 25 C). ii. Adicione Reagente F suficiente para recobrir a secção de tecido e incube durante 10 min. à TA. iii. Lave em dh 2 O três vezes, 2 min. cada. d) Desidratação em séries de etanol graduado: EtOH a 70% 2 min.

5 EtOH a 85% EtOH a 95% EtOH a 100% EtOH a 100% 2 min. 2 min. 2 min. 2 min. e) Seque as lâminas ao ar. 20 min. f) Marque as lâminas com etiqueta e lápis. 2. Desnaturação e hibridização (Utilize uma máquina PCR com bloco de lâminas, OU um bloco de aquecimento com visor de temperatura digital e a câmara de lâminas de humidade com incubadora de 37 C) a) Acrescente 15 µl de sonda de HER2 (Reagente A) ao centro da lamela de cobertura. (Dependendo da dimensão do tecido, podem ser necessárias mais ou menos sondas). b) Coloque as lamelas de cobertura, com o lado da sonda para baixo, na área da amostra do tecido apropriada na lâmina. c) Vede a lamela de cobertura para evitar a evaporação durante a incubação. Utilize uma seringa de 5 ml contendo cola de borracha e encimada com uma agulha de 18G ½, aplique cuidadosamente uma camada fina de cola de borracha nas bordas da lamela de cobertura, sobrepondo ligeiramente na lamela. Deixe secar a cola de borracha (cerca de 10 min.) para impedir que a lamela de cobertura deslize da lâmina. OU Utilize lamelas Zymed UnderCover retirando a fita/papel da traseira da lamela de cobertura e colandoa na área apropriada da lâmina, cobrindo a amostra de tecido. Pressione as extremidades da fita para vedar. (Quando utilizar lamelas Zymed UnderCover, NÃO PRESSIONE NO CENTRO DAS LAMELAS DE COBERTURA). d) Desnature a sonda através da incubação das lâminas a C durante 5 min. (Para efectuar isto, coloque as lâminas no bloco da caixa de lâminas de uma máquina PCR configurada para C, ou num bloco de aquecimento a C com visor de temperatura digital e deixe incubar durante 5 min). e) Coloque as lâminas no bloco de lâminas de uma máquina PCR configurada para 37 C e deixe incubar durante >10 horas (durante a noite). OU Coloque as lâminas numa câmara de humidade configurada para 37 C durante mais de 10 horas (durante a noite). 3. Lavagem escassa: a) Prepare dois jarros Coplin contendo tampão SSC (Reagente C), um à temperatura ambiente (TA), e o outro aquecido a 75 C. (Aumente a temperatura em 1 C por lâmina para mais do que 2 lâminas, mas não exceda 80 C.) b) Após a hidribização, retire cuidadosamente a cola de borracha. Retire a lamela de cobertura. (Se usar uma lamela Zymed UnderCover, retire simplesmente a fita da parte de trás da lâmina para retirar a lamela de cobertura). Não permita que a secção de tecido seque. c) Enxagúe rapidamente as lâminas no jarro que contém SSC à TA e depois mergulhe as lâminas durante 5 min. no frasco que contém SSC a 75 C. d) Lave as lâminas em dh 2 O. 3 vezes, 2 min. cada 4. Procedimento de imunodetecção: a) Mergulhe as lâminas em H 2 O 2 a 3% em metanol absoluto. 10 min. b) Lave em PBS/Tween 20 (0,025%). 3 vezes, 2 min. cada c) Acrescente CAS-Block TM (Reagente G): 2 a 3 gotas por lâmina à TA. Embeba. 10 min. b) Absorva o reagente de bloqueio.não ENXAGÚE. c) Acrescente anticorpo anti-dig de rato (Reagente H): 2 a 3 gotas por lâmina à TA. Embeba. 30 min. d) Lave em PBS/Tween 20 (0,025%). 3 vezes, 2 min. cada e) Acrescente anticorpo HRP-anti-rato polimerizado (Reagente I): 2 a 3 gotas por lâmina à TA. 30 min. f) Lave em PBS/Tween 20 (0,025%). 3 vezes, 2 min. cada

6 g) Durante a lavagem, prepare DAB acrescentando uma gota de cada reagente (J1-J3) a 1 ml de dh 2 O. h) Acrescente solução de substrato-cromogénio (DAB): 2-3 gotas/lâmina. Embeba. 30 min. i) Coloque as lâminas na prateleira de lâminas. j) Lave com água corrente da torneira. 2 min. 5. Contracoloração e cobertura com lamela a) Faça a contracoloração do tecido com hematoxilina (Reagente D). 6 seg. a 1 min. O período de contracoloração está dependente dos tecidos utilizados. A contracoloração escura não é recomendada, visto que pode obscurecer os sinais de coloração positiva. b) Lave com água corrente da torneira. 2 min. c) Desidrate em séries de EtOH graduado. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%) 2 min. cada graduação d) Mergulhe em xileno. 2 vezes, 2 min. cada e) Ponha uma lamela de cobertura, usando solução de montagem Histomount (Reagente K). 6. Microscópio de campo brilhante Examine os resultados de hibridização e a morfologia do tecido simultaneamente utilizando um microscópio de campo brilhante e uma objectiva seca de 40x. D. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DE CISH TM (Consulte o Apêndice A para ver as Figuras A-G.) 1. Sinais de CISH TM No CISH TM, um gene HER2 individual apresenta-se como um único e pequeno ponto (Figura D). A amplificação do gene HER2 é tipicamente visível como grandes aglomerados de genes coloridos por DAB (Figura A), múltiplos pontos individuais dentro do núcleo (Figura B), ou aglomerados mistos e múltiplos pontos nucleares (Figura C). Tabela 1: Visualização de sinais Ampliação Sinal de CISH 10x Os sinais individuais são escassamente visíveis e facilmente observados. 20x Os sinais individuais são pequenos mas claramente perceptíveis. 40x Os sinais individuais são identificados facilmente. 60x ou Não necessário. 100x 2. Controlo positivo O controlo positivo de tecido, que é um tecido que se sabe que contém amplificação do gene HER2, se for usado, deverá ser examinado primeiro para ter a certeza de que todos os reagentes estão a funcionar correctamente. A presença de grupos de genes, ou de 6 sinais individuais, com os núcleos de uma célula única é indicativa de reactividade positiva esperada. Se o controlo positivo não conseguir demonstrar a presença de aglomerados ou de 6 sinais por núcleo, os resultados obtidos para a amostra ensaiada deverão ser considerados inválidos. Geralmente, a presença de não mais do que duas cópias de genes nos núcleos da contrapartida do tecido normal do controle de tecido positivo, confirma que os reagentes da sonda e da imunodetecção não são reagentes cruzados com os componentes celulares ou do tecido. Se não ocorrer coloração não específica nos núcleos da contrapartida de tecido normal do controle de tecido positivo, os resultados obtidos para as amostras deverão ser considerados inválidos. Se ocorrer coloração não específica, geralmente mostra uma aparência de coloração difusa. Ocasionalmente, a coloração esporádica fora dos núcleos pode ser observada em secções de tecido que foram excessivamente fixadas com formol. A coloração não específica não deverá ser confundida com sinais positivos de CISH TM.

7 As lâminas de controlo incluídas (Reagente L) são duas secções de 3-4 µm cortadas de blocos de células FFPE preparadas a partir de 2 linhagens de células de cancro da mama diferentes. Estas lâminas deverão ser usadas como controlos do procedimento. A linhagem de células A não é amplificada e terá 2 pontos por núcleo. Um pequeno número de células terá 3 a 5 pontos por núcleo devido à mitose. A linhagem de células B é amplificada e aparecerá como grandes aglomerados DAB no núcleo. O passo de pré-tratamento térmico deverá ser executado durante 15 minutos, enquanto que o passo de digestão enzimática deverá ser executado durante 10 minutos à temperatura ambiente, para obter resultados óptimos. Se a lâmina de controlo (Reagente L) for negativa, então este resultado será uma indicação de que ocorreu um erro durante o procedimento CISH TM. Se a lâmina de controlo for positiva, mas as lâminas de ensaio forem ou negativas, ou com sinais fracos, então o passo de digestão enzimática deverá ser ajustado. Consulte a Secção VIII. Indicações de procedimentos e Resolução de problemas, na página 8, para mais informações. Reagente L. HER2 CISH TM Lâmina de controlo A B Imagem 1. A lâmina de controlo de HER CISH TM (Reagente L) com a linhagem de células A não amplificadas e a linhagem de células B altamente amplificadas. Note que as linhagens de células não estão desenhadas à escala e são mais pequenas do que indica o 3. Avaliação do estado do gene HER2 por CISH Tabela 2: Determinação do estado do gene HER2 por CISH. As figuras correspondem ao Guia de Interpretação incluído (Apêndice A). Amplificação Amplificação baixa Sem amplificação Mais do que 10 cópias, ou grandes aglomerados do gene HER2 presente em cada núcleo em mais do que 50% das células cancerosas. Veja as Figuras A, B e C. 6 a 10 cópias do gene HER2, ou um pequeno aglomerado de genes HER2, presente por cada núcleo em mais do que 50% das células cancerosas. Veja a Figura F. A sonda centromérica do cromossoma 17 marcada com biotina SP T-Light pode ser usada em casos de baixa ampliação do HER2, para confirmar que 6 a 10 cópias do gene HER2 (<5% dos casos) são devidas à amplificação do gene HER2 e não à polissomia do cromossoma 17. Veja a Figura G. 1 a 5 cópias do gene HER2 presentes por núcleo em mais do que 50% das células cancerosas. Veja as Figuras D e E. A presença de 3 a 5 cópias do gene HER2 por núcleo é devida à polissomia do cromossoma 17. O CISH TM com a sonda centromérica do cromossoma 17 não é necessário para confirmar este resultado. Veja a Figura E. Ocasionalmente, a presença de 3 a 5 cópias do gene HER2 é observada em conjunto com 1 a 2 cópias do cromossoma 17cen em mais de 50% das células cancerosas (a razão HER2/Crom.17cen será 2). Isto é devido à duplicação do cromossoma arm 17q, (9) conforme demonstrado pelo CGH (hibridização genómica comparativa). Veja o Apêndice A para um fluxograma dos resultados da interpretação do CISH TM do HER2. A polissomia, ou cópias múltiplas de um cromossoma total, é um acontecimento frequente no cancro humano. Devido ao facto que a polissomia do cromossoma 17 e/ou a duplicação do cromossoma arm 17q nos cancros normalmente produz 3 a 5 cópias do gene HER2 por núcleo, e esta observação pode ser confundida com a amplificação do HER2, (1,8,9) a sonda centromérica da Zymed para o Cromossoma 17 (Cat. N.º ) e o kit de detecção centromérica de CISH TM (Cat. N.º ) podem ser usados em alguns casos de baixa amplificação do HER2 como confirmação, para distinguir a amplificação do gene HER2 da polissomia, quando 6 a 10 cópias do gene HER2 são observadas por núcleo. (1,8)

8 VII. CONTROLO DE QUALIDADE A variação nos procedimentos de processamento de tecido e técnicos no laboratório do utilizador pode produzir variações significativas nos resultados, sendo necessária uma execução regular de controlos internos adicionalmente aos procedimentos seguintes. A cor e natureza do sinal positivo dependerão do método de detecção utilizado. Consulte o folheto da embalagem do kit de detecção para obter uma descrição do sinal positivo esperado. Controlo de tecido positivo (amplificação): Os materiais de controlo de tecido positivo externos deverão ser retirados de amostras de autópsias/biópsias/cirurgias recentes que tenham sido fixadas, processadas e implantadas da mesma forma que a amostra. As amostras de tecido processadas de forma diferente da amostra validam apenas a execução do reagente e não verificam as técnicas de preparação do tecido. Os controlos de tecido positivo são indicativos de tecidos preparados correctamente e de técnicas de coloração correctas. Um controlo de tecido positivo para cada conjunto de condições de testes deverá ser incluído em cada processamento. Os tecidos usados para os materiais de controlo positivo deverão ser seleccionados a partir de amostras com níveis bem caracterizados de amplificação do gene HER2. Aproximadamente 25% dos tecidos de cancro da mama contêm amplificação do gene HER2; esta pode ser uma fonte útil de tecidos para controlo positivo. Os controlos de tecidos positivos conhecidos deverão apenas ser utilizados para monitorizar a execução correcta dos tecidos processados e de reagentes de testes, em vez de uma ajuda na interpretação dos resultados de amostras. Se os controlos de tecidos positivos não demonstrarem coloração positiva, os resultados obtidos para as amostras deverão ser considerados inválidos. VIII. INDICAÇÕES DE PROCEDIMENTOS E RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS 1. Ao longo de todo o procedimento, é importante que a secção de tecido não desidrate, a não ser que indicado em contrário. 2. Pré-tratamento térmico (O passo mais crítico para uma execução de CISH com êxito): A amostra deve ser fervida ou aquecida acima de 98 C durante 15 min. em solução de pré-tratamento térmico (Reagente B). Consulte a página Digestão por enzima (Um passo crítico para uma execução de CISH com êxito): Podem ser necessários diferentes períodos de incubação de enzima (5-15 min.), dependendo do tipo de tecido e do método de fixação. Para a maior parte dos tecidos da mama, uma digestão por enzimas durante 10 min. à temperatura ambiente (TA) produzirá os melhores resultados de CISH. Certifique-se de que aquece o reagente de prétratamento enzimático (Reagente F) à TA antes de o acrescentar à secção de tecido. O pré-tratamento por enzima da amostra deverá ser avaliado imediatamente no final do protocolo de CISH TM. Se os núcleos não estiverem contracoloridos e houver ausência ou um sinal muito fraco de CISH TM, isto pode ser devido à perda nuclear como resultado de uma digestão excessiva. Se os núcleos estiverem fortemente contracoloridos, mas se estiver ausente um sinal de CISH TM nos núcleos, isto pode ser devido a uma subdigestão durante o pré-tratamento por pepsina. Como alternativa, o pré-tratamento por enzima pode também ser efectuado a 37 C durante 3 minutos se não forem obtidos resultados óptimos. 4. A desnaturação da sonda a uma temperatura inferior à recomendada pelo protocolo pode resultar num sinal fraco ou ausente de CISH TM. 5. A hibridização efectuada durante períodos mais curtos ou as lavagens escassas efectuadas a temperaturas superiores às recomendadas pelo protocolo podem produzir uma diminuição ou a perda completa do sinal de CISH TM. 6. Contacte o seu distribuidor local ou a Zymed Laboratories, Inc. através do endereço de correio electrónico ou através do número para obter assistência técnica ou literatura do produto adicionais. IX. SEGURANÇA E PRECAUÇÕES 1. Utilize grandes precauções quando manusear reagentes. Use luvas descartáveis, bata e óculos de segurança quando manusear cancerígenos suspeitos. 2. Não utilize este produto após a data de validade. 3. 3,3 -Diaminobenzidina tetracloreto (DAB) pode ser perigoso se for engolido, inalado ou absorvido através da pele e pode ser irritante para os olhos, pele, membranas mucosas e vias respiratórias superiores. DAB é um potencial agente cancerígeno; consulte os regulamentos federais, estatais e/ou locais para recomendações de eliminação. 4. A azida sódica a 0,1% (NaN 3 ) usada como conservante neste kit é tóxica se for ingerida. A azida sódica pode reagir com canalizações de chumbo e cobre e formar azidas metálicas altamente explosivas. Para impedir a acumulação nas canalizações, enxagúe com grandes quantidades de água durante a eliminação.

9 5. Evite o contacto deste reagente com os olhos e membranas mucosas. Se o reagente entrar em contacto com áreas sensíveis, enxagúe com quantidades abundantes de água. 6. Este produto não está em conformidade com os critérios da Administração de Segurança e Saúde no Trabalho (OSHA, Occupational Safety & Health Administration) no que se refere a substâncias perigosas e, por isso, não necessita de uma Folha de Dados de Segurança de Material (MSDS). 7. Consulte os regulamentos locais no que se refere à eliminação de componentes potencialmente tóxicos. 8. As amostras e todos os materiais que entrem em contacto com estas devem ser manuseados como se fossem capazes de transmitir infecções e devem ser descartados com os cuidados adequados. Nunca pipete com a boca. Evite o contacto de sondas e de amostras de tecido com a pele e as membranas mucosas. 9. Reduza a contaminação microbiana para evitar coloração não específica. 10. A utilização de períodos de incubação, concentrações ou temperaturas diferentes do especificado pode produzir resultados errados. O utilizador deve validar quaisquer dessas alterações. X. LIMITAÇÕES 1. O CISH TM é um procedimento de vários passos que exige formação especializada em termos de selecção dos reagentes apropriados, selecção, fixação e processamento de tecidos, preparação da lâmina de CISH TM e interpretação dos resultados de coloração. 2. A coloração do tecido e das células está dependente do manuseamento e do processamento da amostra de tecido antes da coloração. A fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento incorrectos, ou contaminação com outros tecidos ou fluidos podem produzir artefactos, resultados falsos-positivos ou falsos-negativos. Os resultados inconsistentes podem ser devidos a variações nos métodos de fixação e de implantação ou a irregularidades inerentes na amostra de tecido. 3. A contracoloração excessiva ou incompleta pode comprometer a interpretação correcta de resultados. 4. Quaisquer desvios dos procedimentos de testes recomendados podem invalidar os resultados declarados esperados; os controlos apropriados devem ser empregues e documentados. Os utilizadores que não cumpram os procedimentos de teste recomendados devem aceitar a responsabilidade da interpretação dos resultados de amostras sob aquelas circunstâncias. 5. Os reagentes podem demonstrar reacções inesperadas em tecidos não testados anteriormente. A possibilidade de reacções inesperadas, mesmo em grupos de tecidos testados, não pode ser completamente eliminada devido à variabilidade biológica dos tecidos. 6. Os resultados falsos-positivos podem ser produzidos pela ligação não imunológica de proteínas de detecção ou de produtos de reacção de substrato. Podem também ser causados pela actividade de pseudoperoxidase (eritrócitos) ou actividade de peroxidase endógena (citocromo c). XI. BIBLIOGRAFIA 1. Tanner M, Gancberg D, DiLeo A, y col. Chromogenic in situ hybridization: A practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 157(5): , King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 229(4717): , Schechter AL, Hung MC, Vaidyanathan L, y col. The neu gene: An erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 229: , Semba K, Kamata N, Toyoshima K, y col. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factorreceptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. PNAS 82(19): , Ross JS, Fletcher JA. HER-2/neu (c-erb-b2) gene and protein in breast cancer. Am J Clin Pathol 112:S53-S67, Shak S. 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