Tecnologia do DNA recombinante. John Wiley & Sons, Inc.

Tecnologia do DNA recombinante John Wiley & Sons, Inc.

Tópicos Técnicas básicas usadas para identificar, amplificar e clonar genes Construção e triagem de bibliotecas de DNA Análise molecular de DNA, RNA e proteína Análise molecular de genes e cromossomos

Pontos Essenciais Os organismos transgênicos são criados pelo aproveitamento dos vetores biológicos. Os fenótipos dos organismos transgênicos podem fornecer informações sobre a função gênica. As técnicas de genética reversa começam com uma sequência gênica. A tecnologia de DNA recombinante nos seres humanos é uma via para o desenvolvimento da terapia gênica. A clonagem de plantas e animais produz indivíduos geneticamente idênticos.

A introdução de genes estranhos nos genomas cria organismos transgênicos O gene introduzido é conhecido como transgene; se o gene introduzido vier de uma espécie diferente, ele é um transgene heterólogo. Os dois principais desafios na criação de um organismo transgênico são a necessidade de: 1. introduzir DNA em uma célula de tal modo que esse DNA se integre ao genoma e 2. fornecer as sequências regulatórias adequadas para que o transgene venha a ser expresso convenientemente.

Técnicas básicas usadas para identificar, amplificar e clonar genes DNA Recombinante, clonagem gênica e técnicas de amplificação de DNA permitem isolar e caracterizar qualquer sequência de DNA de qualquer organismo.

Clonagem gênica Clonagem gênica é o isolamento e amplificação de um determinado gene. Uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA feita pela junção de uma ou mais moléculas diferentes de DNA.

Amplificação de um Gene In Vivo Um minicromossomo carregando o gene de interesse é produzido em um tubo. O minicromossomo recombinante é introduzido na célula hospedeira (ex. E. coli) e a célula hospedeira replica o minicromossomo.

Amplificação de um Gene In Vitro Pequenas sequências de DNA complementares à sequência de DNA em ambos os lados do gene interesse são sintetizadas. Essas curtas sequências de DNA são usadas para iniciar a amplificação de um gene usando DNA polimerase (PCR).

Como amplificar um gene de interesse

Enzimas de Restrição

John Wiley & Sons, Inc.

Estructura do complexo EcoRI-DNA John Wiley & Sons, Inc.

Muitas enzimas de restrição geram contas colantes John Wiley & Sons, Inc.

Como funciona a amplificação

Estrutura de dois plasmídeos

Vetores Plasmidiais Circular, dupla fita de DNA, presentes em bactérias. De 1 kb a 200 kb. Replicação autônoma. Genes de resistência à antibióticos, que podem ser usados como marcadores de seleção. John Wiley & Sons, Inc.

Vetores: Bacteriófagos Um terço (cerca de 15 kb) do cromossomo do bacteriófago contém genes necessários para lisogenia. Essa porção pode ser removida e substituída por DNA exógeno. John Wiley & Sons, Inc.

Clonagem usando o fago como vetor

Vetores: Cosmídeos Híbridos entre plasmídeos e o fage. Replicação autônoma em E. coli. Capacidade de empacotamento do fago. Aceita insertos de 35-45 kb. John Wiley & Sons, Inc.

Uso do Xgal para identificar colônias O gene de E. coli lacz codifica -galactosidase. -galactosidase converte o substrato incolor Xgal em um produto azul. Células com atividade de -galactosidase produzem colônias azuis em presença de Xgal; caso contrário, as colônias são brancas. John Wiley & Sons, Inc.

Vetores Eucarióticos Diferentes organismos usam diferentes origens de replicação e sinais regulatórios, por isso, diferentes vetores de clonagem precisam ser usados para diferentes espécies. Vetores de clonagem especiais podem replicar tanto em procariotos como em eucariotos. John Wiley & Sons, Inc.

Vetores Shuttle podem replicar em E. coli e em outras espécies John Wiley & Sons, Inc.

Yeast Artificial Chromosomes (YACs) Mini cromossomos de leveduras geneticamente modificados. Aceita insertos de DNA exógeno de 200-500 kb. Contém uma origem de replicação de levedura, centrômero de levedura, dois telômeros de levedura, um marcador selecionável e um local de policlonagem. John Wiley & Sons, Inc.

BACs e PACs Cromossomos artificiais bacterianos (BACs) foram construídos a partir de fatores de fertilidade bacteriana (F) Cromossomos artificiais P1 (PACs) foram construídos a partir de cromossomos P1 de bacteriofagos. BACs e PACs aceitam insertos de 150-300 kb e são menos complexos que os YACs. John Wiley & Sons, Inc.

Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)

PCR Reação em Cadeia da Polimerase Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Kary Mullis ganhou o prêmio Nobel em 1993 pela invenção da PCR. http://www.karymullis.com

PCR Reação de PCR: DNA dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.

Hibridação A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

Pontos essenciais A descoberta das enzimas de restrição que clivam o DNA em sequências específicas permitiu a produção de moléculas de DNA recombinante in vitro. Sequências de DNA podem ser inseridas em vetores e amplificadas por replicação in vivo.

Pontos essenciais A reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma sequência específica de DNA in vitro.

Construção e triagem de bibliotecas de DNA

Bibliotecas de DNA Uma biblioteca de DNA genômico é um conjunto de clones de DNA, que coletivamente contem o genoma inteiro de um organismo. Uma biblioteca de cdna contem as regiões codificadoras dos genes expressos de um organismo.

Síntese de cdnas a partir de mrna

Uso de sondas para identificar o clone portador do gene de interesse

Técnica de andar no cromossomo

Encontrando o clone de interesse usando anticorpo em uma biblioteca de expressão

Análise Molecular de DNA, RNA e Proteína DNA, RNA ou proteínas podem ser separadas por eletroforese, transferidas para membranas e analisadas por vários procedimentos.

Análises de DNA por Hibridização Southern Blot

O DNA genômico digerido por enzimas de restrição produz muitos fragmentos e forma um contínuo. Uma sonda pode identificar uma banda específica: técnica de Southern blot

Southern Blot: John Wiley & Sons, Inc.

Identificação de um fragmento específico por Southern Blot John Wiley & Sons, Inc.

Análises de RNAs por Northern Blot O Northern Blot é semelhante ao Southern blot, exceto: RNA é sensível a degradação por RNases;. moléculas de RNA contem estruturas secundárias e tem que ser desnaturadas. Northern blot é útil para estudos de expressão gênica.

Northern Blot (RNA de raiz, folhas e flores de A. thaliana) John Wiley & Sons, Inc.

Análise de RNAs por Transcriptase Reversa -PCR (RT-PCR) John Wiley & Sons, Inc.

Análise de Proteínas por Western Blot Polipeptídeos são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida. Proteínas são transferidas do gel para a membrana de nitrocelulose. Proteínas individuais são detectadas com anticorpos.

Análise Molecular de Genes e Cromossomos Os sítios das enzimas de restrição podem ser usados para construir mapas

Mapeamento por enzimas de restrição John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciamento de DNA

2',3'-Dideoxyribonucleoside Triphosphates John Wiley & Sons, Inc.

Sequenciamento de DNA : método de Sanger John Wiley & Sons, Inc.