DESPROTEINIZAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE PELO SULFATO DE ZINCO ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA ESTRATÉGIA. ElianiSpinelli(spinelli@vm.uff.br) 1 ; SoreleB. Fiaux 1 ; CassiaM. L. Silva 2 ; HelianeDuarte 1 1 Toxfree Universidade Federal Fluminense Niterói, RJ, Brasil. 2 Instituto Médico Legal do Rio de Janeiro, Brasil.
SOMOGYI, M. (1930) Sulfato de zinco a 10% e NaOH0,5 M O agente desproteinizanteseria seria o gel de hidróxido de zinco...
IYER& PRZYBYCIEN(1996) Mecanismo da precipitação de proteínas com metais divalentes: Histidina Triptofano Cisteína SH COO - 1ª etapa NH 2 M ++ H + M ++ M ++ H + H + M ++ H + M ++ N COO 2ª etapa ++ Reações cruzadas M M N S
IYER& PRZYBYCIEN(1996) Características da reação com metais divalentes: - Reação irreversível - A concentração de íons H + afeta a eficiência - A agitação pode gerar precipitado mais fino
Estratégias para o presente estudo: 1)Avaliação da eficiência da desproteinização através da dosagem de proteínas no sobrenadante obtido após centrifugação. 2) Investigação do efeito de variáveis através do planejamento experimental.
Dosagem de proteínas ZAIA et al. (1998) Revisão sobre as vantagens e desvantagens dos vários métodos de desproteinização. Método de Bradford : Rápido Sensível Execução simples Menos interferentes
Reagente de Bradford(1976) Brilliant Blue G, Sigma Aldrich(product number B0770-5G) Ácido fosfórico ACS86 86,3%,J.T.Baker Álcool etílico ACS96 96%,Vetec 0,9 Curva de calibração da albumina bovina Absorvância 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,007x + 0,051 R² = 0,985 0 50 100 150 Albumina (µg)
Esquema analítico Sobrenadante Precipitado Diluição com água destilada Alíquota para análise 10 µl a 100 µl Etc. Leitura da absorvância 1: 5 1: 10 1: 20 Reação com 5 ml do reagente de Bradford Curva de calibração µg de proteína µg/µl= (µg µgde proteína / µl de sobrenadante) x fator de diluição
Planejamento experimental Variáveis a serem investigadas Domínios Concentração do sulfato de zinco 0,5 10% Temperatura 25 55 C Tempo 5 30 minutos A validade do modelo experimental foi determinada através da análise de uma amostra de sangue, em triplicata, nas melhores condições apontadas pelo modelo: comparação entre valor teórico esperado e valor obtido.
Gráfico de superfície, mostrando a dependência da concentração de proteína residual com a temperatura e a concentração de sulfato de zinco.
Melhores condições selecionadas pelo estudo: 0,5 ml sangue 1 ml sulfato de zinco a 1% Vortex por 10 s 45 C C / 15 minutos 3000 rpm/ 15 minutos Sobrenadante límpido Remoção de 99,3% das proteínas
Avaliação do efeito da desproteinização na recuperação da amitriptilina e nortriptilina Estratégia: comparação com a recuperação da extração direta, após seleção do solvente: - Hexano:acetato de etila 75:25 Resultado da 1ª avaliação: 20,2 % para amitriptilina 21,4 % para a nortriptilina Fármacos retidos no material precipitado?
WI:2 WI:4 WI:8 mvolts 200 150 c:\star\data\sangue\exp 1 eter_4-2-2009.run File: 100 50 1.058 1.202 1.107 1.085 1.132 1.173 3.491 3.510 4.260 4.693 5.129 5.245 5.991 6.121 6.261 6.511 6.630 6.951 7.281 7.503 7.773 7.867 7.981 8.197 8.333 8.778 9.017 9.589 10.095 10.235 10.312 10.396 10.989 11.300 11.470 11.374 5.500 5.861 11.940 12.164 12.509 12.784 13.083 13.238 13.469 13.745 13.889 14.232 14.389 14.548 14.825 14.912 15.320 15.524 15.625 15.693 16.083 15.979 16.341 16.555 16.697 17.001 17.211 18.663 18.938 19.349 19.600 19.977 20.356 20.608 21.174 21.439 21.871 6.779 9.884 10.666 1.972 9.269 Channel: Last recalc: c:\star\data\sangue\exp 1 eter_4-2-2009.run Front = FID Results NA 18.240 Extração direta C 26 amitriptilina nortriptilina 0-20 mvolts 5 10 15 20 Minutes 150 100 50 3.512 4.304 5.138 5.528 6.511 6.630 6.779 7.276 8.194 5.861 5.992 9.252 1.982 Sangue fortificado com amitriptilina e nortriptilina a 2,5 µg/ml c:\star\data\sangue\sobrenadante2_11-2-2009.run File: Channel: Last recalc: c:\star\data\sangue\sobrenadante2_11-2-2009.run Front = FID Results NA C 26 amitriptilina 10.385 11.291 11.934 12.449 13.343 13.231 13.892 14.167 15.973 16.335 10.647 17.794 9.869 nortriptilina Extração após desproteinização 0-17 5 10 15 20 Minutes
Modificações efetuadas para aumentar o rendimento da extração Volume de água destilada? Diluição Antes ou depois do sulfato de zinco? Antes ou depois do aquecimento?
Volumes de precipitado obtidos na desproteinização de 1 ml de sangue. O sangue foi previamente diluído com quantidades crescentes de água (da direita para esquerda), antes da adição do sulfato de zinco. Diferença na compactação do precipitado obtido com a troca na ordem de entrada dos reagentes. Á direita, o sangue foi diluído antes da adição do sulfato de zinco. À esquerda, a diluição ocorreu após a adição do sulfato de zinco. Ambos os tubos foram centrifugados a 3000 rpm/ 15 min.
Melhor condição selecionada 1 ml de sangue 2 ml de sulfato de zinco a 1% Vortex / 10s 45 ºC / 15 minutos Diluição com 6 ml de água destilada Vortex / 20 s 3000 rpm por 15 min Separar o sobrenadante 1mL cloreto de amônia 3,3 N, ph 12 15 ml hexano: acetato de etila 75: 25 Resultado da 2ª avaliação: 60 % para amitriptilina 85 % para a nortriptilina
Extração em fase sólida Bond Elut Certify 1. Condicionamento 2 ml de MeOH 2 ml tampão fosfato 0,1 M ph 6 Velocidade de eluição: 1 a 2 gotas / segundo 2. Aplicação do sobrenadante 1 a 2 gotas / segundo 3. Lavagem: cloreto de amônio 0,1 M ph 9,5 2 a 3 gotas / segundo 4. Secagem Vácuo : 20 Pol por 10 minutos 5. Eluição dos analitos 5 ml de Diclorometano: isopropanol:amônia 87:10:3 1 a 2 gotas / segundo
Resultado da 3ª avaliação: 80 % para amitriptilina 85 % para a nortriptilina 0,16 Curvas de calibração da nortriptilina 0,3 Curvas de calibração da amitriptilina Razão das áreas dos picos: analito / PE 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,072x -0,008 R² = 0,985 EFS y = 0,070x -0,007 R² = 0,985 Liq/Liq 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Razão das áreas dos piscos: analito / PE 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,133x + 0,002 R² = 0,987 EFS y = 0,123x -0,018 R² = 0,958 Liq/Liq 0 0,5 1 1,5 2 2,5 µg / ml µg / ml
OBRIGADA. Contato: spinelli@vm.uff.br