Prevalência da Legionella pneumophila em águas de diferentes proveniências das regiões norte e centro de Portugal no período de 2000 a 2006

Prevalência da Legionella pneumophila em águas de diferentes proveniências das regiões norte e centro de Portugal no período de 2000 a 2006 CATARINA RODRIGUES MANSILHA CARLA ALEXANDRA COELHO MARIA ALCINA REINAS ANA MARGARIDA HEITOR Catarina Rodrigues Mansilha é investigadora no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto. Carla Alexandra Coelho é técnica superior no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto. Maria Alcina Reinas é técnica de diagnóstico e terapêutica no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto. Ana Margarida Heitor é técnica superior, assessora no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Porto. Submetido à apreciação: 18 de Junho de 2007. Aceite para publicação: 20 de Setembro de 2007. A Legionella é uma bactéria amplamente distribuída capaz de sobreviver em condições ambientais hostis por longos períodos, o que contribui para a sua fácil disseminação, daí resultar uma elevada probabilidade de exposição do Homem a este agente. O seu habitat natural consiste em reservatórios de água, nomeadamente: rios, lagos, nascentes, fontes hidrotermais e solos húmidos, onde sobrevive como parasita intracelular de alguns protozoários que funcionam como seu reservatório natural. Também pode ser encontrada em sistemas artificiais de circulação de água, como os circuitos de água quente sanitária, de água fria para consumo humano, de rega por aspersão, filtros de aparelhos de ar condicionado e suas condutas, sistemas de refrigeração, condensadores de evaporação, nebulizadores e humidificadores. Nestes últimos a Legionella encontra-se frequentemente associada a biofilmes que providenciam os nutrientes e o ambiente necessário à sua manutenção e proliferação. Esta capacidade peculiar de adaptação a novas condições ambientais é responsável pela frequente contaminação de sistemas de distribuição de água artificiais e pela dificuldade de erradicação da Legionella de estruturas contaminadas. A Legionella pneumophila está associada a duas doenças: a Doença dos Legionários e a febre de Pontiac, cuja incidência depende do grau de contaminação dos reservatórios de água, da susceptibilidade da pessoa exposta e da intensidade da exposição. A infecção transmite-se por via respiratória a partir de bioaerossóis de água contaminada com este agente. Pela importância que representa em Saúde Pública, a Doença dos Legionários, e porque a sua monitorização apenas pelo sistema de notificação de doenças transmissíveis de declaração obrigatória (DDO) se tem mostrado insuficiente, considera-se fundamental a pesquisa e quantificação da Legionella nas amostras ambientais para uma melhor vigilância e prevenção desta patologia. Método: Este trabalho resulta de um estudo estatístico, realizado a partir de 1674 amostras de água recebidas no Centro de Qualidade Hídrica do Porto do INSA (Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge), durante os anos de 2000 a 2006, para pesquisa de Legionella pneumophila e Legionella spp. não L. pneumophila. Os resultados foram avaliados por local e ponto de colheita, tendo sido efectuado igualmente um estudo da variação sazonal de amostras positivas ao longo desse período de tempo. Resultados: A partir da análise dos resultados laboratoriais obtidos de 2000 a 2006 verificou-se uma diminuição do número de amostras positivas em águas minerais naturais termais, com 9 e 11 resultados positivos em 2000 e 2001, respectivamente, e ausência de casos positivos em 2006, e um aumento do número de casos em hospitais, hotéis e centros comerciais nos dois últimos anos, com 24 casos VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 67

positivos em 2005 e 2006 contra apenas três casos positivos durante os anos de 2000, 2001 e 2002. Quanto aos resultados por ponto de colheita, verificou-se uma elevada prevalência de Legionella pneumophila nas torres de refrigeração. Concluiu-se também que a Legionella pneumophila predomina relativamente às Legionella spp. não pneumophila nas amostras positivas, com igual incidência de Legionella pneumophila serogrupo 1 e serogrupo 2-14. Em relação à distribuição sazonal de amostras positivas observou-se, contrariamente ao que seria de esperar, uma maior incidência nos meses de Fevereiro, Março, Outubro e Novembro. Conclusões: O problema das doenças causadas pela Legionella pneumophila é real e merece uma maior divulgação, nomeadamente, no que diz respeito ao conhecimento actual sobre os lugares e condições favoráveis ao desenvolvimento desta bactéria, de modo a possibilitar a implementação de medidas preventivas adequadas e eficazes. As autoridades competentes têm que tomar consciência deste tema e promover legislação, normas e regulamentos adaptados aos sistemas mais afectados podendo contribuir, desta forma, para a redução do risco de contágio e constituir uma mais valia para a Saúde Pública nacional. Palavras-chave: Legionella pneumophila; legislação; sistemas de água; saúde pública; avaliação estatística. Introdução O género Legionella engloba bactérias com parede celular típica de Gram-negativo, aeróbicas e nutricionalmente exigentes, que apresentam a forma de pequenos bastonetes pleomórficos geralmente com 2 a 5 µm de comprimento. Dispõem de flagelos que facilitam o seu movimento, algumas espécies são produtoras de pigmentos fluorescentes e são capazes de sobreviver num amplo intervalo de temperaturas, multiplicando-se rapidamente entre 20 C e 45 C (Harrison, T. G. e Taylor, A. G., 1988). As legionelas são parasitas intracelulares facultativos, sobrevivendo à fagocitose por macrófagos através do bloqueio da fusão fagossoma-lisossoma e também inibindo a geração de radicais livres. Utilizam os aminoácidos como fonte primária de carbono e energia, sendo auxotróficas para a L-cisteína, componente essencial dos seus meios de cultura (Ferreira, W. F. e Sousa, J. C., 2000). Os microrganismos do género Legionella são conhecidos desde 1976 e, até agora, já foram descritas cerca de 48 espécies de Legionella e 70 serogrupos, sendo a Legionella pneumophila, serogrupo 1, a responsável por aproximadamente 80% das infecções no Homem (Fields, B. S., Benson, R. F. e Besser, R. E., 2002; Delgado-Viscogliosi, P. et al., 2005; Pearson, W. E., 2003). A sua descoberta deu-se no seguimento de uma pesquisa intensa, levada a cabo pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dos EUA acerca de um surto de pneumonia que afectou os participantes da convenção anual da divisão de Pennsylvania da Legião Americana, realizada no Bellevue-Stratford Hotel em Philadelphia. A doença, inicialmente baptizada pela imprensa como Doença dos Legionários, é hoje conhecida por Legionelose. O estudo tem como objectivo estimar a prevalência de Legionella pneumophila em amostras de água de diversas proveniências das regiões Norte e Centro de Portugal, de 2000 a 2006, e a análise de resultados por local e ponto de colheita, bem como o estudo da variação sazonal ao longo desse período. Aspectos ecológicos A Legionella tem o seu habitat permanente e generalizado na natureza, independentemente da estação do ano, multiplicando-se massivamente quando se conjugam determinados factores. São bactérias capazes de sobreviver numa ampla gama de condições ambientais que incluem, por exemplo, variações de temperatura dos 5 C aos 63 C e de ph dos 5,5 aos 8,9 (Fields, B. S., Benson, R. F. e Besser, R. E., 2002). As bactérias do género Legionella colonizam, assim, os mais variados tipos de ambientes aquáticos naturais, como rios, lagos, nascentes e solo húmido, e ambientes artificiais, tais como, sistemas de distribuição de água potável, principalmente em edifícios com grande volume de água em circulação e canalizações envelhecidas, sistemas de circulação e distribuição de água quente, cilindros e caldeiras de aquecimento, torneiras e chuveiros e, principalmente, sistemas de condicionamento de ar que envolvem recirculação de água, nomeadamente, torres de arrefecimento ou dispositivos de evaporação ou humidificação onde, aliás, podem sobreviver longos meses (Pearson, W. E., 2003; Yu, V. L., 2002). Em algumas ocasiões, em instalações mal projectadas, sem manutenção ou com manutenção inadequada, favorece-se o estagnamento da água e a acumulação de produtos capazes de funcionar como nutrientes para a bactéria como: lodo, outra matéria orgânica, materiais de corrosão e microrganismos simbióticos (algas, amibas, protozoários ciliados), formando biofilmes (Alary, M. e Joly, J. R., 1991). A presença de biofilmes, associada a uma temperatura propícia, explica a concentração de Legionella até níveis infectantes para o Homem. Se existir na instalação um mecanismo produtor de aerossóis, a bactéria pode dispersar-se no ar e penetrar, por ina- 68 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

lação, no aparelho respiratório (E.P.A., 2001). Os hotéis podem, então, ser um foco de contaminação, bem como os hospitais, locais particularmente preocupantes na medida em que a presença destas bactérias constitui um elevado factor de risco para indivíduos imunocomprometidos, principalmente pacientes sujeitos a transplantação renal e cardíaca (Borella, P. et al., 2005; Leoni, E. et al., 2005). Outros edifícios climatizados (empresas, centros de escritórios, bancos e seguradoras, centros comerciais e grandes superfícies), piscinas e spas, com seus jacuzis e hidromassagens, também podem albergar a Legionella. Esta pode ser encontrada igualmente em fontes ornamentais que embelezam as nossas cidades e que, no Verão, reúnem as condições óptimas para a sua multiplicação caso as águas não sejam convenientemente tratadas, colocando a Legionella num lugar de destaque em termos de risco para a Saúde Pública (Portugal. Direcção-Geral da Saúde. Direcção-Geral do Turismo, 2001; Leoni, E. et al., 2001; Emmerson, A. M., 2001). Estudos epidemiológicos conduzidos desde 1976 demonstram que em certos países da União Europeia parte significativa do número total de casos de Doença dos Legionários ocorre em indivíduos que viajam (no próprio país ou no estrangeiro). Por isso, esta forma associada a viagens (que resulta da visita ou estadia em determinados empreendimentos turísticos) é de grande importância (Ricketts, K. e Joseph, C., 2004; Ricketts, K. D. e Joseph, C. A., 2006). Os empreendimentos turísticos (hotéis, hotéis-apartamentos, apartamentos, aldeamentos, etc.) constituem, assim, elementos essenciais na compreensão do processo de transmissão da doença, quer no que respeita à origem da fonte da infecção quer às acções que visam a sua prevenção e controlo (European Working Group for Legionella Infections, 2003; Hsu, B. et al., 2006). Importa, por isso, desenvolver procedimentos de controlo da doença de molde a contribuir para a segurança das pessoas, através da cooperação interinstitucional e entre os sectores público e privado. O carácter ubiquitário desta bactéria em meios aquáticos naturais e em nichos artificialmente criados pelo Homem, aliado às dificuldades da sua irradicação, favorecem então o aparecimento de surtos epidémicos de Legionelose. Clínica e transmissão A Doença dos Legionários, que constitui a manifestação clínica mais expressiva da infecção por Legionella, é uma infecção sistémica oportunista que acomete sobretudo indivíduos adultos com mais de 50 anos de idade (duas a três vezes mais homens do que mulheres), fumadores ou portadores de doenças crónicas debilitantes (alcoolismo, diabetes, cancro, insuficiência renal, etc.) e doenças com compromisso da imunidade ou que imponham medicação com corticosteróides ou quimioterapia (Mulazimoglu, L. e Yu, V. L., 2001). Os sintomas não são patognomónicos da doença e incluem, inicialmente, dor de cabeça, dores musculares, febre (> 39 C) e calafrios associados a transpiração, logo seguidos por tosse seca, pulmões congestionados e possível afectação dos rins e do fígado. Tem-se registado igualmente diarreia e vómitos num terço dos casos, assim como comportamentos confusos e delirantes em 50% dos casos. As formas mais graves resultam em pneumonia aguda ou infecção grave extra-pulmonar que pode ser fatal. Em relação ao tratamento, são usados antibióticos como os macrólidos ou as quinolonas azitromicina ou levofloxacina (Akbas, E. e Yu, V. L., 2001). Não se dispõe de vacina contra a Doença dos Legionários. As infecções causadas por Legionella incluem, para além da Doença dos Legionários, outras infecções difíceis de diagnosticar não associadas a pneumonia, geralmente referenciadas como febre de Pontiac. A febre de Pontiac é uma doença não pneumónica, autocontrolada, tipo gripe, caracterizada por um acesso súbito e agudo de febre, tremores, mal-estar e dores de cabeça e musculares, mas sem complicações e que não requer tratamento específico (WHO, 2007). Ambas as doenças são transmitidas por via aérea, através de aerossóis de água contaminada com estirpes virulentas de Legionella, ou seja, a bactéria utiliza o ar como via de propagação e, por isso, basta uma simples inalação para que possa ocorrer contágio, sendo importante referir que não se transmite de pessoa a pessoa, nem pela ingestão de água contaminada (U. K. PHLS Atypical Pneumonia Working Group, 2002). As gotas e partículas de um aerossol, de tamanho menor que 4mm, são as mais perigosas porque podem penetrar profundamente no aparelho respiratório. As infecções por Legionella podem surgir em epidemias ou casos esporádicos, sendo que as epidemias são devidas ao contacto com a mesma fonte de microrganismos e não à transmissão entre pessoas infectadas (Fields, B. S., Benson, R. F. e Besser, R. E., 2002; Atlas, R. M., 1999). Epidemiologia A morbilidade e mortalidade associadas à Doença dos Legionários e à febre de Pontiac são difíceis de VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 69

calcular, principalmente porque grande parte das ocorrências, esporádicas ou epidémicas, não são correctamente diagnosticadas ou notificadas e, portanto, não constam das estatísticas de Saúde Pública. No entanto, e contrariamente à convicção popular, a Doença dos Legionários é uma doença comum. Na Europa, constatou-se um acréscimo do número total de casos de infecções por Legionella de 1161 em 1994 para 4546 em 2004 (WHO, 2007; European Working Group for Legionella Infections, 2003; Fields, B. S., Benson, R. F. e Besser, R. E., 2002). Segundo uma publicação do Ministère de la Santé et des Solidarités da Direction Générale de la Santé, em França, o número de casos declarados em 2004 foi 1202, o que representa uma incidência anual de dois casos por 100 000 habitantes. A letalidade foi de 14%, atingindo os 40% em relação a doentes hospitalizados, tendo sido a Legionella responsabilizada por 0,5% a 5% das pneumonias comunitárias com necessidade de internamento hospitalar. Os casos nosocomiais representaram 9% do total de casos declarados em 2003 e 6% em 2004 (France. Ministère de la Santé et des Solidarités, 2005). Dados da Division of Bacterial and Mycotic Diseases do CDC (Legionellosis (General): DBMD) referem uma incidência de Doença dos Legionários de 8000 a 18000 casos por ano nos EUA, embora muitos não sejam diagnosticados como Doença dos Legionários, mas sim reconhecidos apenas como pneumonia (Fields, B. S., Benson, R. F. e Besser, R. E., 2002; Marston, B. J. et al., 1997). Também nos EUA e Austrália, constatou-se que cerca de 5% das pessoas expostas ao contacto com elevadas concentrações da bactéria contraíam a doença, sendo a taxa de mortalidade de 14% para as infecções nosocomiais e 5% a 10% para as infecções adquiridas na comunidade (Benin, A. L. et al., 2002; Howden, B. P. et al., 2003). Na Europa a taxa global de mortalidade por Legionella ronda os 12% (WHO, 2007). Segundo os dados da Divisão de Epidemiologia da Direcção de Serviços de Informação e Análise da Direcção-Geral da Saúde de 2005 e 2006 sobre Doenças de Declaração Obrigatória, entre os anos de 2000 a 2005 foram diagnosticados 229 casos de Doença dos Legionários, predominantemente na região Norte (51,5%) e atingindo maioritariamente os grupos etários compreendidos entre os 35 e os 54 anos (49,3%). Aspectos regulamentares A nível europeu, foi criado, em 1986, pela Comunidade Europeia o EWGLI European Working Group for Legionella Infections, que Portugal integra desde o início e no qual se congregam as vertentes clínica e ambiental de prevenção da Doença dos Legionários. A harmonização das metodologias e a elaboração de normas técnicas de orientação e controlo constituem a sua base regulamentar. O EWGLI (http://www.ewgli.org/) é um centro de informação e controlo epidemiológico, tendo como objectivos a vigilância e o desenvolvimento de metodologias de diagnóstico, manutenção e tratamento, em articulação com outros organismos internacionais. Posteriormente, foi criada a Rede Europeia de Vigilância da Doença dos Legionários associada a viagens (EWGLINET), que funciona em ligação com o Programa de Controlo de Doenças Transmissíveis da União Europeia. A 2 de Julho de 2003, o Parlamento e o Conselho da Europa, pela Decisão n. o 2119/98/EC, aprovaram Guidelines para o Controlo e Prevenção da Doença dos Legionários, abrangendo os seguintes tópicos: A Doença dos Legionários e as viagens; Definições e Procedimentos para comunicação e resposta em caso de Doença dos Legionários associada a viagens; Procedimentos para Avaliação de Riscos, Investigação Ambiental e Controlo e Prevenção de Legionella em Redes de Água; Metodologia de Investigação e Controlo de Surtos de Legionella em Instalações Hoteleiras; Orientações Técnicas para Controlo e Prevenção de Legionella em Redes de Água; Métodos de Tratamento; Listagem de orientações nacionais em alguns países da EU. Prescrições legislativas e normativas em Portugal Em Portugal a Doença dos Legionários foi pela primeira vez descrita em 1979 (publicação em boletim da OMS). A qualidade da água destinada ao consumo humano é regulamentada pelo Decreto-Lei n. o 243/01, de 5 de Setembro, e, de acordo com 1. a revisão da Directiva Comunitária 98/83/EC, não é exigida a pesquisa de Legionella para monitorização da qualidade de água de uso doméstico. No entanto, tal como outras doenças transmissíveis, a Doença dos Legionários está incluída na lista das doenças de declaração obrigatória desde 1999 de acordo com a Portaria n. o 1071/98 de 31 de Dezembro. A definição de Caso para notificação clínica e 70 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

laboratorial é a que consta na Circular Normativa n. o 03/DSIA de 30/03/99. A declaração é da responsabilidade de todos os médicos, quer exerçam a actividade no Serviço Nacional de Saúde ou no sector privado. Por outro lado, o Autoridade de Saúde Concelhia tem competência para conduzir acções de inspecção, tanto preventivamente como após a notificação de um ou mais casos de doença. Data de 2000 a portaria dos Ministérios da Economia e da Saúde (Portaria n. o 1220/2000 de 29 de Dezembro) que, pela primeira vez, refere específicamente a pesquisa de Legionella spp. e Legionella pneumophila como parâmetros inerentes à qualidade microbiológica das águas minerais naturais e das águas de nascente destinadas a serem utilizadas em estabelecimentos termais. Segundo a referida portaria, para poder ser considerada bacteriologicamente própria a água deverá estar isenta de L. pneumophila em 1 litro de amostra analisada e o valor de referência para o número total de Legionella não L. pneumophila é de 100 UFC/L. Em relação a procedimentos de controlo direccionados para as unidades hoteleiras, as primeiras orientações surgiram em 2001 (Doença dos Legionários. Procedimentos de controlo nos empreendimentos turísticos, 2001. Direcção-Geral de Saúde e Direcção-Geral de Turismo). As Circulares Normativas da Direcção Geral da Saúde (Circular Normativa n. o 5/DEP, 22/04/04 Notificação Clínica e Laboratorial de Casos e Circular Normativa n. o 6/DEP, 22/04/04 Investigação epidemiológica. Inquérito epidemiológico e Ambiental), de 2004, destinam-se à orientação do procedimento de investigação e tratamento de casos ou surtos de Legionella direccionadas, neste caso, para os serviços de Saúde Pública. Mais recentemente, o Decreto-Lei n. o 79/2006, sobre climatização e qualidade do ar interior refere, no artigo 29. o respeitante a Requisitos de Qualidade do Ar, no ponto 8, que as concentrações máximas de referência de poluentes no interior dos edifícios abrangidos pelo presente Regulamento são: para microrganismos, 500 Unidades Formadoras de Colónias (UFC) sendo detectados bactérias e fungos; e no ponto 9 que, em edifícios com sistemas de climatização em que haja produção de aerossóis, nomeadamente onde haja torres de arrefecimento ou humidificadores por água líquida, ou com sistemas de água quente para chuveiros onde a temperatura de armazenamento seja inferior a 60 C, as auditorias incluem também a pesquisa de Legionella em amostras de água recolhidas nos locais de maior risco, nomeadamente, tanques das torres de arrefecimento, depósitos de água quente e tabuleiros de condensação, não devendo ser excedido um número superior a 100 UFC. Neste Documento reconhece-se que, em termos gerais, no passado: «..., a não existência de requisitos exigenciais quanto a valores mínimos de renovação do ar, o pouco controlo da conformidade do desempenho das instalações com o respectivo projecto aquando da sua recepção e a continuada falta de uma prática efectiva de manutenção adequada das instalações durante o seu funcionamento normal têm levado ao aparecimento de problemas de qualidade do ar interior, alguns dos quais com impacte significativo ao nível da saúde pública.» Métodos A pesquisa e quantificação de Legionella em amostras de água efectua-se no Laboratório de Microbiologia de Águas do INSA desde a década de 80, e actualmente baseia-se na Norma ISO 11 731: 1998. Esta norma descreve o método de cultura para isolamento de Legionella e a estimativa do seu número em amostras ambientais. O método é aplicável a todos os tipos de amostras ambientais, incluindo águas potáveis, industriais e naturais, bem como a materiais associados, tais como sedimentos, depósitos e lamas. Em relação à identificação e serotipagem de Legionella pneumophila é utilizado o kit comercial da Oxoid (Oxoid s.a., Dardilly, France Legionella latex test) que permite distinguir Legionella spp. não pneumophila e L. pneumophila serogrupo 1 e serogrupos 2-14. As colheitas foram realizadas segundo as normas do EWGLI. Resultados Nos últimos sete anos (2000-2006) foram analisadas 1674 amostras de água para pesquisa de Legionella pneumophila, decorrentes de inquéritos epidemiológicos, vigilância sanitária e particulares, cuja distribuição está representada na Figura 1. O ano de 2004 foi o que apresentou maior número de pedidos para pesquisa de Legionela em amostras de água. Contudo, foi em 2005 que houve uma maior percentagem de resultados positivos (22,0%) para Legionella pneumophila. As análises efectuadas foram requisitadas por diversas entidades, particulares e públicas, como se mostra no Quadro I e Figuras 2a) e 2b). VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 71

Figura 1 Distribuição do número de amostras de água para pesquisa de Legionella pneumophila de 2000 a 2006, por ano 350 Número de amostras 300 250 200 150 100 13 15 8 19 16 14 24 212 258 254 216 290 209 235 50 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Ano Positivos Total Quadro I Distribuição do número total de amostras e percentagem de resultados positivos por local de colheita. Entre parêntesis encontra-se o número efectivo de amostras positivas 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total Local de Colheita Empreendimentos turísticos 2 6 23 13,0 19 15,8 35 17,1 25 28,0 27 7,4 137 15,3 (3) (3) (6) (7) (2) (21) Hospitais 11 2 1 10 6 13 23,1 37 21,6 80 13,8 (3) (8) (11) Centros comerciais 9 8 7 57,1 24 16,7 (4) (4) Empresas e edifícios 28 25,0 46 4,3 32 6,3 23 17,4 38 15,8 47 17,0 90 5,6 304 11,2 (7) (2) (2) (4) (6) (8) (5) (34) Complexos piscinas 2 3 33,3 8 3 16 6 50,0 1 39 10,3 (1) (3) (4) Fontes decorativas 3 2 2 4 16 27 0,0 (0) Particulares 1 20 5,0 18 16 19 34 3 111 0,9 (1) (1) Termas 165 5,5 170 6,5 162 1,9 141 5,0 160 0,6 84 3,6 70 952 3,6 (9) (11) (3) (7) (1) (3) (34) 72 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

Da análise crítica do Quadro I e das Figuras 2a) e 2b) pode concluir-se que, de uma maneira geral, o maior número de amostras recebidas foi oriundo de estâncias termais, o que é natural uma vez que a legislação obriga a vigilância nestes locais desde Dezembro de 2000 (Portaria 1220/2000). Relativamente aos empreendimentos turísticos, verificou-se um acréscimo do número total de amostras desde 2001, ano de publicação do Guia Prático da Doença dos Legionários nestes empreendimentos sendo, em Figura 2 a) Distribuição do número total de amostras de água para pesquisa de Legionella pneumophila, por entidade, de 2000 a 2006 Número total de amostras 300 250 200 150 100 50 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Ano Termas Particulares Fontes decorativas Complexos de piscinas Empresas e edifícios Centros comerciais Hospitais Hotéis Figura 2 b) Distribuição do número de amostras de água contendo Legionella pneumophila, por entidade, de 2000 a 2006 25 Termas Número de amostras positivas 20 15 10 5 Particulares Fontes decorativas Complexos de piscinas Empresas e edifícios Centros comerciais Hospitais Hotéis 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Ano VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 73

termos relativos, os que apresentam o segundo maior número de amostras positivas (19,2%), cabendo o primeiro lugar às empresas e edifícios com 31,2% que também apresentam, em termos absolutos, o mesmo número de amostras positivas (34) que os estabelecimentos termais ao longo destes 7 anos (Figura 3). O acentuado acréscimo do número de amostras para pesquisa de Legionella no ano transacto por parte das empresas e grandes edifícios poderá estar relacionado com a publicação do DL 79/ 2006 e com o facto de muitas empresas serem filiais de multinacionais sediadas em países onde a pesquisa e quantificação da Legionella faz parte do sistema regulamentar. Nos Quadros II e III apresenta-se o número de amostras positivas para Legionella pneumophila nos vários pontos de colheita analisados. Da análise dos Quadro II e III pode-se inferir que, em relação a uma distribuição por ponto de colheita, as torres de refrigeração apresentam o maior número de resultados positivos (42), superior aos resultados obtidos em águas termais (34). Desta análise destacam-se também os resultados em chuveiros e torneiras, com 8 e 13 amostras respectivamente, facto que poderá estar relacionado com a formação de biofilmes neste tipo de dispositivos. Quanto às águas termais, os resultados positivos distribuem-se apenas por 3 pontos: técnicas ORL, técnicas de duche e técnicas de imersão. As técnicas ORL englobam irrigação nasal, inalação oral ou nasal, aerossol oral nasal e facial, nebulização e pulverização faríngea. As técnicas de duche referem-se a agulheta, circular, subaquático, pulverizado e massagem tipo vichy e tipo bertholaix. As técnicas de imersão são de imersão simples, corrente, aerobanho, hidromassagem simples ou computorizada, manilúvio-pedilúvio e hidropressoterapia. Como se explicou anteriormente, a metodologia utilizada no Laboratório de Microbiologia de Águas do INSA-Porto permite detectar a presença de L. pneumophila ou de outras espécies de Legionella sem especificação (denominadas como Legionella spp.). Uma análise dos resultados positivos obtidos ao longo destes sete anos revela que 84,5% das amostras correspondem a Legionella pneumophila (109 amostras) contra apenas 15,5% de Legionella spp. não pneumophila (20 amostras). Quanto aos serogrupos de Legionella pneumophila, o serogrupo 1, mais importante pela sua patogenicidade para o Homem, foi encontrado com frequência (53,2% 58 amostras) apenas ligeiramente superior Figura 3 Percentagem de amostras de água contendo Legionella pneumophila por entidade, ao longo dos sete anos de estudo Amostras positivas Termas 31% Hotéis 19% Hospitais 10% Particulares 1% Complexos de piscinas 4% Empresas e edifícios 31% Centros comerciais 4% 74 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

Quadro II Distribuição do número total de amostras e % de resultados positivos para Legionella pneumophila por ponto de colheita. Entre parêntesis encontra-se o número efectivo de amostras positivas 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total Local de colheita Termais 165 6,0 170 7,3 162 2,3 141 5,5 160 0,8 84 4,2 70-952 3,6 (9) (11) (3) (7) (1) (3) (34) Torres refrigeração 18 38,9 25 8,0 14 14,3 17 35,3 28 17,9 28 10,7 91 18,7 221 19,0 (7) (2) (2) (6) (5) (3) (17) (42) Ar condicionado 6 5 1 8 2 10 32 Caldeiras 2 50,0 6 8 12,5 (1) (1) Depósitos 10 10,0 1 3 2 3 3 22 4,5 (1) (1) Cisternas 2 3 5 Chuveiros 7 15 6,7 28 3,6 18 5,6 41 4,9 42 7,1 29 180 4,4 (1) (1) (1) (2) (3) (8) Torneiras 6 22 21 4,8 8 24 12,5 23 30,4 12 16,7 116 11,2 (1) (3) (7) (2) (13) Fontes ornamentais 3 2 2 4 16 27 Piscinas 1 2 1 4 Jacuzis 1 1 6 33,3 1 9 22,2 (2) (2) Diversos 7 12 16 16 8 5,6 20 18,8 19 98 8,2 (2) (6) (8) Quadro III Distribuição do número total de amostras e percentagem de resultados positivos para Legionella pneumophila, por ponto de colheita, em águas minerais naturais utilizadas nos estabelecimentos termais. Entre parêntesis encontra- -se o número efectivo de amostras positivas 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total Local de colheita Técnicas ORL/ 30 6,7 40 5,0 35 24 8,3 38 2,6 17 11,8 14 198 4,5 /Vias respiratórias (2) (2) (2) (1) (2) (9) Técnicas de duche 62 8,1 65 9,2 54 47 2,1 50 24 23 325 3,7 (5) (6) (1) (12) Técnicas de imersão 42 4,8 36 8,3 44 6,8 49 8,2 45 25 4,0 28 269 4,8 (2) (3) (3) (4) (1) (13) Outros pontos 31 29 29 21 27 18 5 160 VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 75

à frequência dos serogrupos 2-14 (46,8% 51 amostras) Quadro IV. A Figura 4 apresenta a distribuição mensal das amostras analisadas ao longo dos sete anos em estudo. No que respeita à ocorrência temporal de casos positivos pode verificar-se que, contrariamente ao que seria de esperar, se detectaram mais amostras contaminadas por Legionella pneumophila nos meses de Fevereiro, Março, Outubro e Novembro e não nos meses mais quentes, sendo esta distribuição diferente da correspondente ao número total de amostras recebidas. Uma análise das condições meteorológicas referentes a estes meses dos anos de 2000 a 2006 não revelou qualquer aumento significativo de temperatura relativamente aos valores considerados normais para a época. Discussão Mais de 25 anos após a descoberta da Legionella pneumophila, a sua detecção em reservatórios aquáticos ambientais, naturais e artificiais é cada vez mais importante numa tentativa de evitar a infecção humana, uma vez que as manifestações patológicas Quadro IV Distribuição percentual dos sub-grupos de Legionella pneumophila e Legionella spp., segundo o ano Número positivos/ano 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total (20) (17) (8) (15) (14) (28) (27) (129) L. pneumophila ser 1 60,0 35,3 62,5 26,7 57,1 32,1 51,9 45,0 L. pneumophila ser 2-14 20,0 52,9 37,5 66,7 35,7 53,6 18,5 39,5 Legionella spp. 20,0 11,8 0,0 6,7 7,1 14,3 29,6 15,5 Figura 4 Distribuição percentual mensal do total de amostras de água recebidas e de amostras contendo Legionella pneumophila, no período de 2000 a 2006 14,0 12,0 10,0 8,0 1,2 0,9 0,6 0,3 0,4 0,4 0,6 0,4 0,8 0,7 6,0 4,0 0,2 0,2 2,0 0,0 Jan. Fev. Março Abril Maio Junho Julho Agosto Set. Out. Nov. Dez. Percentagem de amostras positivas Percentagem de amostras recebidas 76 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

podem revestir-se de extrema gravidade, com elevada taxa de mortalidade tratando-se, por isso, de um problema real de saúde pública. A melhor forma de prevenção da doença reside na actuação a nível das potenciais fontes de contágio. Para isso, urge criar legislação de carácter obrigatório que determine a análise periódica de controlo de parâmetros importantes à colonização de ambientes hídricos por bactérias do género Legionella e à implementação obrigatória de medidas de higiene e de construção de instalações e equipamentos de fornecimento de água potável, de uso doméstico e industrial. De momento, esse tipo de legislação abrange unicamente as estâncias termais e sistemas de climatização no âmbito da qualidade de ar interior, estando ainda a descoberto os sistemas de distribuição e armazenamento de água em edifícios como hotéis e estâncias turísticas, hospitais e também piscinas, jacuzis, ginásios, embarcações e fontes públicas, contrariamente ao que acontece em Espanha em que existe uma legislação bastante abrangente desde 2003 (Ministerio de Sanidad y Consumo, Real Decreto 865/2003 de 4 de Julho). A partir da análise dos resultados laboratoriais obtidos nos últimos sete anos é possível tirar algumas conclusões nomeadamente no que diz respeito à eficácia real da aplicação e cumprimento da Portaria 1220/2000, referente a águas minerais naturais termais, revelada pela diminuição do número de amostras positivas e ausência de resultados positivos em 2006. É igualmente notório o aumento do número de casos em hospitais, hoteis e centros comerciais nos dois últimos anos o que, de certa forma, fundamenta a necessidade de criação de nova legislação. Quanto aos resultados por ponto de colheita, verifica- -se uma elevada prevalência de Legionella pneumophila nas torres de refrigeração, fundamentando a necessidade imperiosa de cumprimento do Decreto- Lei 79/2006. Relativamente às águas termais, são as técnicas ORL, de duche e de imersão as que requerem maior controlo, principalmente as técnicas de ORL que são técnicas de inalação directa de aerossóis. O risco de contaminação por Legionella é nestes casos muito elevado, sendo uma das situações mais preocupantes para a Saúde Pública, como se pode verificar analisando os critérios de valorização de risco sugeridos para a Legionella (Quadro V). Conclui-se também que a Legionella pneumophila predomina nas amostras positivas com frequência idêntica de Legionella pneumophila serogrupo 1 e serogrupo 2-14. Quanto à distribuição sazonal de amostras positivas observa-se uma maior frequência nos meses de Fevereiro, Março, Outubro e Novembro. Este facto pode estar relacionado não só com um menor controlo e manutenção dos vários equipamentos nestes meses do ano, como também com uma menor taxa de ocupação dos empreendimentos turísticos e termais, o que favorece a criação de condições que propiciam a eventual formação de nichos, capazes de facilitar a multiplicação de bactérias do género Legionella nos sistemas e redes de água. Uma vez a água contami- Quadro V Critérios de valorização de risco sugeridos para a Legionella Legionella UFC/ml Torres de arrefecimento Redes de água quente Humidificadores/nebulizadores < 1 BAIXO BAIXO BAIXO 1-9 BAIXO BAIXO MODERADO 10-99 BAIXO MODERADO ALTO 100-999 MODERADO ALTO ALTO > 1000 ALTO ALTO ALTO Fonte: NSW Health department: code of practice for the control of Legionnaires Disease, New South Wales. VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 77

nada, o processo de tratamento é, sem dúvida, muito mais difícil. É necessário estabelecer políticas de controlo com vista à realização de uma avaliação analítica repartida ao longo do ano para poder levar a cabo um correcto controlo das instalações. Actualmente o laboratório dispõe para a pesquisa de Legionella spp. e Legionella pneumophila de um sistema PCR em Tempo Real (GeneSystems ), que permite a obtenção de resultados em apenas 4 horas e que tem demonstrado ser um método alternativo rápido e mais sensível que os convencionais, conferindo maior poder qualitativo e quantitativo a este tipo de análises (Yaradou, D. F et al., 2006). A técnica PCR em Tempo Real vem obviar problemas relacionados com as análises, nomeadamente, tempo de análise, detecção da bactéria em águas com elevada interferência de matriz, forte contaminação ou interferentes, presença da Legionella em biofilmes e em baixas concentrações, permitindo-nos fazer a sua detecção por PCR e não pelo método cultural quando o inverso não se aplica. Um entrave à utilização da técnica como único método de pesquisa, nomeadamente em termos legislativos, continua a ser, ainda, a ausência de correspondência entre Unidades de Genoma (UG) e Unidades Formadores de Colónias (UFC). As infecções causadas por este agente bacteriano têm cada vez maior importância não só em meio hospitalar como também na comunidade, com especial ênfase na infecção de viajantes. Nesse contexto, a criação de grupos de trabalho a nível europeu (EWGLI, EWGLINET) tem vindo a revelar-se uma mais valia no sentido da vigilância epidemiológica da Doença dos Legionários no espaço físico referido. Contudo, apesar de se tratar de um importante problema de saúde pública e doença de declaração obrigatória, e dos esforços múltiplos (embora dispersos) para sensibilizar todos os grupos profissionais que, directa ou indirectamente, lidam com este problema, a sub-notificação da Doença dos Legionários é uma realidade, o que muito prejudica a investigação epidemiológica da relação causal água-doente. É de salientar, de acordo com dados recentes do EWGLI, que apenas cerca de 8% dos casos chegue ao conhecimento das entidades competentes (Autoridades de Saúde). A criação do Programa de Vigilância Epidemiológica Integrada da Doença dos Legionários, coordenado pelo INSA em parceria com outras instituições, introduziu de forma sistemática a componente laboratorial na vigilância epidemiológica, que veio apoiar a monitorização da referida entidade pelo Sistema de Notificação das Doenças Transmissíveis de Declaração Obrigatória. Este reforço da vigilância, visando a análise conjunta das informações clínicas e laboratoriais (VigLab), permitiria, teoricamente, a execução em tempo útil da investigação epidemiológica, nomeadamente a confirmação e caracterização do caso, pesquisa de casos relacionados, identificação de nichos da doença e a detecção do reservatório ambiental da bactéria (fonte de infecção). Contudo, o esforço cai por terra, novamente, devido à subnotificação dos casos, que é reflexo não só de alguma inércia, mas porventura de subdiagnóstico. Além disso, e apesar do INSA ter já um papel importante nos inquéritos epidemiológicos, deveria poder desempenhar outra função, silenciada pelo sigilo profissional: dar a conhecer à respectiva Autoridade de Saúde os casos de amostras de água contaminada por Legionella pneumophila. Desta forma, poder-se-ia efectuar o estudo de todos os focos passíveis de contaminação, o que permitiria debelar a colonização mesmo antes de existirem casos de infecção humana. Bibliografia AKBAS, E.; YU, V. L. Legionnaires disease and pneumonia. Postgraduate Medicine. 109 : 5 (2001) 135-147. ALARY, M.; JOLY, J. R. Risk factors for contamination of domestic hot water systems by Legionellae. Applied and Environmental Microbiology. 57 : 8 (1991) 2360-2367. ATLAS, R. M. Legionella : from environmental habitats to disease pathology, detection and control. Environmental Microbiology. 1 : 4 (1999) 283-293. BENIN, A. L. et al. An outbreak of travel-associated Legionnaires disease and Pontiac fever : the need for enhanced surveillance of travel-associated legionellosis ihe United States. Journal of Infectious Diseases. 185 : 2 (2002) 237 243. BORELLA, P. et al. Legionella contamination in hot water of Italian hotels. Applied and Environmental Microbiology. 71 : 10 (2005) 5805-5813. DELGADO-VISCOGLIOSI, P. Rapid method for enumeration of viable Legionella pneumophila and other Legionella spp. in water. Applied and Environmental Microbiology. 71 : 7 (2005) 4086-4096. EMMERSON, A. M. Emerging waterborne infections in Health-care settings. Emerging Infectious Diseases. 7 : 2 (2001) 272-276. EUROPEAN WORKING GROUP FOR LEGIONELLA INFECTIONS [Em linha] European Guidelines for Control and Prevention of Travel Associated Legionnaires Disease. London : European Working Group for Legionella Infections, 2003. [Consult. 12-08-2007] Disponível em http://www.ewgli.org/data/ european_guidelines.htm 78 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA

FERREIRA, W. F.; SOUSA, J. C. Microbiologia. Lisboa : LIDEL, 2000. FIELDS, B. S.; BENSON, R. F.; BESSER, R. E. Legionella and Legionnaires disease : 25 years of investigation. Clinical Microbiology Reviews. 15 : 3 (2002) 506-526. FRANCE. Ministére de la Santé et des Solidarités. Direction Générale de la Santé [Em linha] Le risque lié aux légionelles : guide d investigation et d aide à la gestion. Paris : Direction Générale de la Santé. Ministére de la Santé et des Solidarités, 2005. [Consult. 12-08-2007] Disponível em http:// www.sante.gouv.fr/htm/pointsur/legionellose/guid2005.pdf YARADOU, D. F. et al. Integrated real-time PCR detection and monitoring of Legionella pneumophila in water systems. Applied and Environmental Microbiology. 73 : 5 (2007) 1452- -1456. YU, V. L. Legionella surveillance : political and social implications : a little knowledge is a dangerous thing. The Journal of Infectious Diseases. 185 : 2 (2002) 259-261. HARRISON, T. G.; TAYLOR, A. G. A laboratory manual for Legionella. Chichester: John Willey and Sons, 1988. HOWDEN, B. P. et al. Treatment and outcome of 104 hospitalized patients with Legionnaires disease. Internal Medicine Journal. 33 : 11 (2003) 484-488. HSU, B. et al. Legionella prevalence in hot spring recreation areas of Taiwan. Water Research. 40 : 17 (2006) 3267-3273. U.S. Centers for Disease Control and Prevention. Division of Bacterial and Mycotic Diseases [Em linha] Legionellosis : Legionnaires Disease (LD) and Pontiac Fever : General information: 2005. Washington, DC : Division of Bacterial and Mycotic Diseases. Centers for Disease Control and Prevention, 2005. [Consult. 12-08-2007] Disponível em http://www.cdc.gov/ ncidod/dbmd/diseaseinfo/legionellosis_g.htm. LEONI, E. et al. Prevalence of Legionella spp. in swimming pool environment. Water Research. 35 : 15 (2001) 3749-3753. LEONI, E. et al. Legionella waterline colonization : detection of Legionella species in domestic, hotel and hospital hot water systems. Journal of Applied Microbiology. 98 : 2 (2005) 373-379. MARSTON, B. J. et al. Incidence of community acquired pneumonia requiring hospitalization : results of a population-based active surveillance study in Ohio. Archives of Internal Medicine. 157 : 15 (1997) 1709-1718. MULAZIMOGLU, L.; YU, V. L. Can legionnaires disease be diagnosed by clinical criteria? : a critical review. Chest. 120 : 4 (2001) 1049-1053. PEARSON, W. E. Legionella 2003 : an update and statement by the Association of Water Technologies. Rockville: Association of Water Technologies, 2003. PORTUGAL. Direcção-Geral da Saúde. Direcção-Geral do Turismo Doença dos Legionários : guia prático. Lisboa : Direcção-Geral da Saúde. Direcção-Geral do Turismo, 2001. RICKETTS, K.; JOSEPH, C. Travel associated Legionnaires Disease in Europe : 2003. Eurosurveillance. 9 (2004) 40-43. RICKETTS, K. D.; JOSEPH, C. A. The distribution of travelassociated Legionnaires disease within selected European countries, and a comparison with tourist patterns. Epidemiology and Infection. 134 (2006) 887-893. UK. PHLS ATYPICAL PNEUMONIA WORKING GROUP Guidelines for investigating single cases of legionnaires disease. Communicable Disease and Public Health. 5 : 2 (2002) 157-162. U.S. UNITED STATES OFFICE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY. ENVIRONMENTAL PROTECTION OFFICE OF WATER AGENCY [Em linha] Legionella : Drinking Water Health Advisory. Washington, DC : Environmental Protection Office of Water Agency, 2001. (EPA-822-B-01-005). [Consult. 12-08-2007] Disponível em http://www.epa.gov/ waterscience/criteria/humanhealth/microbial/legionellaha.pdf. WHO Legionella and the prevention of legionellosis. Geneva : World Health Organisation, 2007. Abstract PREVALENCE OF LEGIONELLA PNEUMOPHILA IN DIF- FERENT WATER SAMPLES FROM THE NORTH AND CENTRE REGIONS OF PORTUGAL IN THE PERIOD 2000 TO 2006. Introduction: Legionella species are ubiquitous bacteria, capable of survive in adverse environmental conditions for long periods of time which contributes for their dissemination and for a great probability of man exposure to these infectious agents. Water is the major reservoir for Legionella. They are found in freshwater environments worldwide such as rivers, lakes, natural thermal springs and wet soil, where they survive as intracellular parasites of free-living protozoans, which are their natural hosts. But Legionella can also be found in manmade aquatic environments, including hot sanitary water systems, drinking water systems and conduits, agricultural water systems, air conditioning equipments, humidifiers and air washers, cooling towers and evaporative condensers. In building water systems, Legionella are frequently associated with biofilms that provide shelter and nutrients and support their survival and multiplication even outside a host cell. These peculiar abilities to grow are responsible for the frequent contamination of artificial water systems, as well as difficulties in eradicating Legionella from contaminated waters and the lack of biocide efficacy. Legionella pneumophila is associated with two different pathologies: Legionnaires disease and Pontiac fever which incidence depends on water contamination levels and susceptibility of the person exposed. Legionnaires disease is normally acquired through the respiratory system by breathing in VOL. 25, N. o 2 JULHO/DEZEMBRO 2007 79

air that contains Legionella bacteria in an aerosol. Case to case transmission between humans has never been demonstrated. For its importance to public health, the surveillance of Legionnaires disease should not only be based ohe mandatory notification system, clearly insufficient according to the under notification of cases, but also be reinforced by laboratory analysis of the environmental sources. Method: This study included a statistic analysis of 1674 water samples received in Centro de Qualidade Hídrica do Porto do INSA for the detection and quantification of Legionella pneumophila and Legionella spp. not pneumophila during the years 2000 to 2006. The results were analyzed according the sampling area, point of source and seasonal variation. Discussion: Through the analysis of the laboratory results, we can notice a gradual decrease of the positive samples in hot spring waters and an increase of the positive cases in hospitals, hotels and shopping centers ihe last two years. The analysis of the results according to the point of source showed a great prevalence of Legionella pneumophila in cooling towers. We can also see that Legionella pneumophila predominates in positive samples rather than Legionella spp. with an equal incidence of Legionella pneumophila serogroup 1 and 2-14. According to the monthly distribution of positive samples, we can observe, contrary to what was expected, an incidence in February, March, October and November. Conclusions: The problem of Legionnaires disease is severe and implies more public information about places and conditions favorable for Legionella pneumophila proliferation. The competent authorities must promote legislation and guidelines to reduce the contamination of water systems and to threat the contaminated ones efficiently, giving their contributioo a considerable improvement of our public health system. Keywords: legionella pneumophila; legislation; water systems; public health; statistical evaluation. 80 REVISTA PORTUGUESA DE SAÚDE PÚBLICA