Teoria da Prática: Transporte de Glicídios INTRODUÇÃO Os estudos dos fatores que afetam a síntese enzimática nos microrganismos levaram à hipótese de que há duas classes de enzimas: as constitutivas e as induzidas. Enzimas constitutivas são aquelas formadas em velocidade e quantidade constantes, independentemente do estado metabólico do organismo. Elas, em geral, fazem parte da maquinaria enzimática básica permanente das células. Como por exemplo, temos as enzimas da glicólise que é considerada, em termos evolutivos, como a mais antiga via catabólica produtora de energia. Enzimas induzidas são aquelas que ocorrem em quantidades basais no organismo, mas que, em presença de seu substrato, aumentam em concentração cerca de mil vezes ou mais. Isto é evidente, quando esse substrato é a única fonte de carbono presente no meio de crescimento. Nessas condições, a enzima induzida é necessária para transformar o substrato em um metabólito que pode ser diretamente utilizado pela célula. Um exemplo de sistema enzimático induzido é aquele responsável pelo catabolismo da galactose por células de Saccharomyces cerevisiae. Quando a galactose é adicionada ao meio de crescimento como única fonte de carbono, todas as enzimas envolvidas no seu catabolismo são induzidas. ENZIMAS DO CATABOLISMO DA GALACTOSE A utilização de galactose exige uma permease específica, galacto-permease, responsável pelo seu transporte através da membrana citoplasmática. Sua catabolização envolve um conjunto de enzimas que catalisam as reações abaixo: galactoquinase α-d-galactose + ATP α-d-galactose-1-fosfato + ADP + H + transferase α-d-galactose-1-fosfato + UDPG α-d-glicose-1-fosfato + UDPGal epimerase UDPGal UDPG fosfoglicomutase I α-d-glicose-1-fosfato α-d-glicose-6-fosfato fosfoglicomutase II A síntese das três primeiras enzimas e da permease é induzida pela galactose presente no meio de cultura. A fosfoglicomutase I também está presente num meio contendo glicose, é uma enzima constitutiva. Entretanto, quando a fonte de carbono para o crescimento é galactose, um reforço da atividade fosfoglicomutásica se faz necessário, já que todo o fluxo de açúcar para a via glicolítica ocorre através da ação desta enzima. Este reforço se dá através da síntese de uma outra enzima também com atividade fosfoglicomutásica (fosfoglicomutase II), mas codificada por outro gene e que é responsável por 95% da atividade fosfoglicomutásica total da célula. Através da técnica de eletroforese em gel, foi possível evidenciar a existência de duas proteínas com atividade fosfoglicomutásica (isoenzimas), em células crescidas em galactose e somente uma, em células crescidas em glicose. 1
REPRESSÃO, INATIVAÇÃO E MODIFICAÇÃO CATABÓLICAS. Tanto células procarióticas como células eucarióticas dispõem de outro recurso - denominado repressão catabólica - que permite a alteração do teor de enzimas na célula. No caso de células de levedura é particularmente notório o chamado efeito glicose. Enzimas indutivas, como por exemplo, α-glicosidase (que catalisa a hidrólise da maltose a glicose) tem sua síntese reprimida pela glicose, mesmo em presença de seu indutor - a maltose. Certas enzimas da cadeia de transporte de elétrons e do ciclo do ácido cítrico também são reprimidas, possivelmente porque a presença de um suprimento de combustível prontamente fermentável torna desnecessária a utilização de uma via respiratória mais complexa. Assim, quando a glicose é acessível como fonte de carbono, as leveduras preferem utilizar a via catabólica mais primitiva, isto é, a via glicolítica ou fermentativa, e dispensam todas as outras vias catabólicas produtoras de energia. Uma vez que o sinal para esse efeito é dado pela elevação de nível intracelular de glicose, ou algum catabólito derivado da glicose, esse tipo de fenômeno recebe o nome de efeito glicose - e é um caso especial de um fenômeno mais genérico denominado repressão catabólica. Há ainda mecanismos de controle capazes de promover o decréscimo e muitas vezes até o desaparecimento total de uma atividade enzimática. São eles: inativação e modificação catabólica ou proteolítica. A inativação catabólica é o resultado da proteólise total de enzima com conseqüente perda da atividade enzimática. A modificação catabólica é o resultado da proteólise parcial da enzima com conseqüente modificação de suas propriedades. Os sistemas de transporte de maltose e galactose são sujeitos à modificação proteolítica, quando em presença de glicose no meio externo, que promove um aumento do Km de transporte desses glicídios. Essas últimas formas de regulação são os chamados controles rápidos, isto é, que se manifestam imediatamente, enquanto os fenômenos de repressão e indução são observados apenas com um tempo mais longo. A repressão e a indução são fenômenos que normalmente estão associados a condições de crescimento, enquanto que, em condições não proliferantes esses fenômenos ou não ocorrem ou são muito pouco freqüentes. A modificação e inativação catabólicas podem ocorrer em ambas as condições. Nesta prática será verificado o transporte de glicídios - glicose e galactose - em condições não proliferantes, o que possibilita a observação (indireta) da indução do sistema de transporte ocorrida durante o crescimento. Referências: Manual de Cursos Práticos em Bioquímica. Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ. Fundamentos de Bioquímica Experimental. José Raul Cisternas, José Varga, Osmar Monte. 2ª ed., Editora Atheneu, São Paulo, 21. LEHNINGER - Principles of Biochemistry David L. Nelson, Michael M. Cox. Fifth Edition. W. H. Freeman and Company, New York, 28. 2
Roteiro de Prática: Transporte de Glicídios 1. MATERIAL - Material biológico - células de Saccharomyces cerevisiae cultivadas em meio YED (extrato de levedo 1% e glicose 2%) e em meio YEGAL (extrato de levedo 1% e galactose 2%) ressuspensas em tampão fosfato de sódio,5 M; ph 6,; na concentração de 6 mg p.s. ml. - Tampão fosfato de sódio,5 M; ph 6,. - Solução de glicose 14 mm - Solução de galactose 14 mm - Reagente ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino (DNS) - Centrífuga - Banho termostatado a 1ºC - Espectrofotômetro 2. OBJETIVO Evidenciar a existência de sistemas enzimáticos constitutivos e induzidos em células de levedura. 3. PROCEDIMENTO a) Incubar as células provenientes de cada um dos meios de crescimento (YED e YEGAL) em glicose e em lactose. Utilizar 4 frascos erlenmeyer de 5 ml, de modo que a concentração final de glicose ou galactose seja 7 mm e a de células 3 mg p.s.ml Observação: 1 ml da suspensão de células (crescidas em YED ou em YEGAL) contendo 6 mg p.s.ml + 1 ml da solução de glicídio 14 mm (glicose ou galactose) Células crescidas em Incubadas em Frasco 1 YED glicose Frasco 2 YED galactose Frasco 3 YEGAL glicose Frasco 4 YEGAL galactose b) Retirar alíquotas de 2, ml de cada frasco de incubação nos tempos zero, e minutos. c) Centrifugar as alíquotas imediatamente após a retirada, a 3. rpm por 5 minutos. d) Recolher o sobrenadante para a determinação da glicose ou da galactose residuais, segundo o esquema seguinte: Tempo (min) Sobrenadante H 2 O DNS H 2 O,5,5 1, Aquecer por 5 min 13,,5,5 1, a 1ºC. 13, 1 1, Resfriar 13, Observações: - Para as células crescidas em glicose e incubadas com galactose utilizar, no tempo de minutos, uma alíquota de,5 ml ao invés de 1, ml. - Fazer o branco de reação usando 1, ml de água destilada - Determinar a absorbância em 54 nm. 3
e) Calcular as concentrações de glicose e galactose utilizando a curva padrão (método do DNS) para cada um dos glicídios. e) Anotar os resultados na tabela abaixo f) Interpretar os resultados obtidos Frasco 1 (YED glicose) Frasco 2 (YED galactose) Frasco 3 (YEGAL glicose) Frasco 4 (YEGAL galactose) Tempo (min) Absorbância (54 nm) Glicose (µmolml) Galactose (µmolml) Consumo (%) Observação: corrigir os valores de concentração obtidos em função da diluição utilizada. 4
Determinação de Açúcares Redutores pelo Método do 3,5-Dinitro Salicilato (DNS) 1. REAGENTES Solução padrão de glicose (1 µmolml) Solução padrão de galactose (1 µmolml) Amostras retiradas nos tempos inicial, e minutos de incubação. Ácido 3,5 dinitrosalicílico em solução alcalina (DNS) Banho termostatado a 1 o C Espectrofotômetro 2. PROCEDIMENTO Construção da curva padrão de glicídios redutores Sensibilidade do método químico: 1-2 µmoles de glicose 1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de glicose (1 µmolml) e a solução padrão de galactose (1 µmolml) Tubo Sol. Glicose Sol. Galactose H 2 O dest. Reagente DNS B 1 1 1,2,8 1 2,4,6 1 3,6,4 1 4,8,2 1 5 1-1 B 1 1 6,2,8 1 7,4,6 1 8,6,4 1 8,8,2 1 1 1-1 Absorbância (54 nm) Concentração ( ) 2. Após a adição dos reagentes, agitar e aquecer a 1 o C por 5 minutos, resfriar e adicionar 13 ml de água destilada. 3. Usando o tubo B como branco de reação, determinar as absorbâncias a 54 nm. 4. Lançar em gráfico as leituras de absorbância x concentração de glicídios em µmolml (glicose e galactose). Determinar o coeficiente angular e o fator da reta obtida para cada glicídio. 5. Verificar quais os limites de sensibilidade do método para a aparelhagem utilizada. 5