Bioquímica e Biologia Molecular. Cinética da Enzima Invertase

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1 Bioquímica e Biologia Molecular Cinética da Enzima Invertase 20 de Outubro de 2005

2 Realizado Por: Pedro Miguel Guerreiro Brito da Cruz nº54196 Nuno Miguel Barroso Monteiro nº54208 João Pedro da Silva Gonçalves Poiares nº

3 Índice Páginas Resumo. 2 Resultados Experimentais. 3 Tratamento de Resultados. 10 Discussão de Resultados Conclusão.. 19 Bibliografia 20 2

4 Resumo Este trabalho experimental consistiu na obtenção dos parâmetros cinéticos característicos da enzima invertase, efectuando-se para tal a hidrólise da sacarose a uma temperatura de 45ºC e ph de 4.5, e registando-se ao longo do tempo as concentrações dos intervenientes da reacção, de forma a poder-se calcular as velocidades iniciais da reacção (declives dos gráficos concentração vs. tempo). Figura 1: Reacção de hidrólise da sacarose Utilizaram-se várias concentrações iniciais de substrato (sacarose) de modo a que se pudesse traçar a recta de Lineweaver-Burk e calcular com relativa fidelidade os parâmetros. Obtiveram-se os seguintes parâmetros Km = 20,53mM e Vmax = 5,296mM/min pelo que, comparando estes resultados com os valores de outros autores, para condições de temperatura e ph não muito distantes dos utilizados na experiência, existe alguma coerência nos resultados obtidos (apesar de ter havido alguma instabilidade nos valores discretos usados para obter a recta de Lineweaver-Burk), pelo que os objectivos do trabalho de laboratório foram atingidos. 3

5 Resultados Experimentais De forma a obter a concentração do produto desejado (glicose) nos vários instantes, foi necessário medir as absorvâncias (utilizando um espectrofotómetro com comprimento de onda de 540 nm) de cada uma das amostras preparadas a partir da solução inicial de sacarose mais o reagente DNS. Registados esses valores e com o auxilio de uma recta de calibração (absorvância vs. concentração) y@xd= x em que y[x] corresponde à absorvância e x à concentração de glicose em mg/l. Como tal a concentração de glicose em g/l é obtida da equação anterior -3 resolvida em ordem ao x e multiplicada por 1x10 Tendo em conta que x y@xd = * 1x10-3 M = m n n= m M ; M glicose = g mol Pode-se, então, chegar à concentração de glicose em mol/l através da expressão geral LL Hmol x = y@xd * 1x

6 Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 15 g/l Absorvância 540nm Grupo A Absorvância 540nm Grupo B Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x x10-2 Tabela 1: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 15 g/l 5

7 Sacarose a 15 g/l Absorvânci 2,5 2 1,5 1 0,5 Grupo A Grupo B Média Gráfico 1: Absorvâncias observadas pelos grupos A e B, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 15 g/l Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 30 g/l Absorvância 540nm Grupo C Absorvância 540nm Grupo D Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x x10-2 Tabela 2: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 30 g/l 6

8 Sacarose a 30 g/l Absorvânci 2,5 2 1,5 1 0,5 Grupo C Grupo D Média Gráfico 2: Absorvâncias observadas pelos grupos C e D, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 30 g/l Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 45 g/l Absorvância 540nm Grupo A Absorvância 540nm Grupo B Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x x10-2 Tabela 3: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 45 g/l 7

9 Sacarose a 45 g/l Absorvânci 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Grupo A Grupo B Média Gráfico 3: Absorvâncias observadas pelos grupos A e B, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 45 g/l Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 60 g/l Absorvância 540nm Grupo C Absorvância 540nm Grupo D Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x x10-2 Tabela 4: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 60 g/l 8

10 Sacarose a 60 g/l Absorvânci 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Grupo C Grupo D Média Gráfico 4: Absorvâncias observadas pelos grupos C e D, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 60 g/l Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 75 g/l Absorvância 540nm Grupo A Absorvância 540nm Grupo B Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x x10-9 9

11 7 Tabela 5: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 75 g/l Sacarose a 75 g/l 3 2,5 Absorvânci 2 1,5 1 0,5 Grupo A Grupo B Média Gráfico 5: Absorvâncias observadas pelos grupos A e B, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 75 g/l Tempo (minutos) Concentração de Sacarose: 100 g/l Absorvância 540nm Grupo C Absorvância 540nm Grupo D Média das Absorvâncias Concentração Glicose (mol/l) x x x x x x x

12 x10-2 Tabela 6: Resultados observados para uma solução de sacarose com concentração de 100 g/l Sacarose a 100 g/l 3 2,5 Absorvânci 2 1,5 1 0,5 Grupo C Grupo D Média Gráfico 6: Absorvâncias observadas pelos grupos C e D, e a sua correspondente média para uma solução de sacarose com concentração de 100 g/l 11

13 Tratamento de Resultados Tendo em conta que a concentração de glicose, que se vai formando ao longo do tempo, é igual à concentração de sacarose que vai sendo consumida (devido à estequiometria da reacção) iremos obter 6 gráficos correspondentes a seis concentrações iniciais diferentes de sacarose que avaliam o consumo da sacarose ao longo do tempo, dos quais retiramos a informação da velocidade inicial de cada uma das 6 reacções, através da aproximação dos pontos obtidos a uma recta. Como estamos só interessados na velocidade inicial, vamos optimizar a obtenção da recta restringindo o número de pontos, considerando preferencialmente os instantes iniciais, onde o gráfico tem um comportamento mais ou menos linear. Concentração de Sacarose 15g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0035x + 0, [S ac. C onsum.] (mol/l) Linear ([Sac. C onsum.] (mol/l)) Gráfico 7: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 15 g/l Concentração de Sacarose 15g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 2,00E -02 y = 0,004x + 0,0012 1,60E -02 1,20E -02 8,00E -03 4,00E -03 0,00E Optimização Linear (Optimização) 12

14 Gráfico 8: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 15 g/l Daqui se pode concluir que a velocidade inicial obtida é de 0.004mol/(L.min). Concentração de Sacarose 30g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 y = 0,0031x + 0,0023 0,00E [S ac. Consum.] (mol/l) Linear ([Sac. Consum.] (mol/l)) Gráfico 9: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 30 g/l Concentração de Sacarose 30g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0033x + 0,0023 Optimização Linear (Optimização) Gráfico 10: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 30 g/l 13

15 Neste gráfico, que difere um pouco dos restantes, optou-se por retirar alguns valores a meio do gráfico, nos instantes de tempo 3 e 4 e também ao minuto 7, de forma a obter um declive maior. Obtendo-se para a velocidade inicial um valor de mol/(L.min). Concentração de Sacarose 45g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,50E -02 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0042x + 0, [S ac. Consum.] (mol/l) Linear ([Sac. Consum.] (mol/l)) Gráfico 11: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 45 g/l Concentração de Sacarose 45g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,005x + 0,002 Optimização Linear (Optimização)

16 Gráfico 12: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 45 g/l Neste caso, obteve-se que a velocidade inicial é de 0.005mol/(L.min). Concentração de Sacarose 60g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0037x + 0, [S ac. Consum.] (mol/l) Linear ([Sac. Consum.] (mol/l)) Gráfico 13: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 60 g/l Concentração de Sacarose 60g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0041x + 0,0007 Optimização Linear (Optimização)

17 Gráfico 14: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 60 g/l Daqui se pode concluir que a velocidade inicial obtida é de mol/(L.min). Concentração de Sacarose 75g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 4,00E -02 3,50E -02 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0043x + 0, [S ac. Consum.] (mol/l) Linear ([Sac. Consum.] (mol/l)) Gráfico 15: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 75 g/l 16

18 Concentração de Sacarose 75g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0055x + 0,0017 Optimização Linear (Optimização) Gráfico 16: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 75 g/l Obteve-se, assim, que a velocidade inicial é de mol/(L.min). Concentração de Sacaros e 100g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 5,00E -02 4,00E -02 3,00E -02 2,00E -02 1,00E -02 0,00E +00 y = 0,005x + 0, [S ac. Consum.] (mol/l) Linear ([Sac. Consum.] (mol/l)) Gráfico 17: Aproximação linear de uma solução de sacarose com concentração inicial de 100 g/l 17

19 Concentração de Sacarose 100g/l [Sacarose Consum.] (mol/l) 3,50E -02 3,00E -02 2,50E -02 2,00E -02 1,50E -02 1,00E -02 5,00E -03 0,00E +00 y = 0,0059x + 0,0018 Optimização Linear (Optimização) Gráfico 18: Aproximação linear optimizada de uma solução de sacarose com concentração inicial de 100g/L Neste último caso, verifica-se que a velocidade inicial obtida é de mol/(L.min). Assim, obteve-se a recta de Lineweaver-Burk. Representação de Lineweaver-Burk 1/v (L.min/mol) y = 3,6989x + 223,98 Lineweaver-Burk Linear (Lineweaver-Burk) /[Sacarose] (L/mol) Gráfico 19: Representação da recta de Lineweaver-Burk utilizando as velocidades iniciais 18

20 obtidas anteriormente sem optimização Assim para a versão não optimizada, obtêm-se um K m = 0,01651 mol/l ou seja K m = 16,51 mm. Quanto à velocidade máxima obteve-se V max = 0, mol/(l.min) = 4,465 mm/min. Representação de Lineweaver-Burk 1/v (L.min/mol) y = 3,8767x + 188, /[Sacarose] (L/mol) Lineweaver-Burk Optimizado Linear (Lineweaver-Burk Optimizado) Gráfico 20: Representação da recta de Lineweaver-Burk utilizando as velocidades iniciais obtidas anteriormente com optimização Assim, para a versão optimizada, obtêm-se um K m = 0,02053 mol/l ou seja K m = 20,53 mm. Quanto à velocidade máxima obteve-se V max = 0, mol/(l.min) = 5,296 mm/min. 19

21 Discussão dos Resultados Apesar da concordância de resultados, o trabalho experimental foi obviamente afectado de erros. Relativamente ao gráfico de Lineweaver-Burk, vê-se claramente que existe uma certa incoerência de valores que por acaso resultam na obtenção de valores de K m e V max próximos de outros autores, para condições semelhantes. Os valores discretos obtidos experimentalmente traduzem um zig-zag de valores que correspondem ao facto de nem sempre que a concentração de substrato aumentar, a velocidade de processamento da enzima acompanha esse aumento, o que sabemos ser inválido teoricamente. Em todo o caso, como já foi referido, obtiveram-se valores cinéticos bastante satisfatórios. Outro aspecto diz respeito aos primeiros gráficos que foram apresentados, da absorvância ao longo do tempo para várias concentrações de sacarose. No caso da série dos grupos A e B nota-se imediatamente que o grupo A tem um registo de absorvâncias sempre maior relativamente ao grupo B para as três séries, vindo esta diferença a aumentar com o aumento da concentração inicial de sacarose. O mesmo acontece para a série dos grupos C e D à excepção da série de 100 g/l de sacarose onde o grupo D tem valores superiores ao C. No entanto, há que referir que o grupo D obteve valores para a absorvância muito semelhantes nos casos das concentrações iniciais de sacarose de 30 e 60g/L, para além disso estes valores são inferiores aos verificados pelos grupos A e B para concentrações de sacarose de 15 a 45g/L; o mesmo se pode verificar que com o grupo B na série de 75g/L de sacarose, que apresenta valores inferiores aos registados para concentrações mais baixas. O que vem interferir em muito nos resultados, uma vez que era de esperar que à medida que a concentração inicial de sacarose fosse aumentando, o mesmo aconteceria com os valores observados para a absorvância. Estas diferenças sugerem claramente que o facto de se terem usado 2 espectrofotómetros diferentes pode ter resultado nesta diferença de valores (sendo um deles digital e outro de leitura), tanto que a utilização sucessiva do mesmo espectrofotómetro traduz o facto introduzido primariamente (é uma hipótese). Existem ainda outros erros associados a várias fases do trabalho que podem ter influenciado o resultado final, tais como erros de pipetagem, deficiente termostatização da solução, não respeitar os tempos previamente definidos para a preparação das amostras e aquecimento no banho de água quente, deficiente arrefecimento dos tubos de ensaio após o banho de água quente, incorrecta utilização dos espectrofotómetros, etc Condições Temperatura: 30ºC ph: 4.9 Km (mm) 25,4 20

22 Concentração do Tampão Acetato: 100mM/L Temperatura: 45ºC ph: 4.0 Concentração do Tampão Acetato: 59mM/L Temperatura: 37ºC ph: 4.7 Concentração do Tampão Acetato: 80mM/L Tabela 7: Valores obtidos para Km para outros autores em condições de temperatura e ph semelhantes às utilizadas nesta experiência Comparando os valores de K m obtidos pode-se verificar que com a optimização o valor de K m é maior (K m optimizado K m não optimizado = 4,02mM), como consequência de neste processo não se considerarem certas concentrações em dados instantes para que as velocidades iniciais da reacção sejam maiores. Como tal, também ocorre um aumento de V max, uma vez que esta depende directamente de K m (como se pode verificar pela recta de Lineweaver-Burk). Comparando este valores com os de outros autores (em condições experimentais semelhantes às utilizadas) pode-se verificar que ambos os valores de K m, tanto o obtido com ou sem optimização, se encontram numa gama de valores compreendido entre os vários valores de K m tabelados. Apesar disso, pode-se ver bem que o valor obtido sem optimização é muito parecido ao obtido para uma temperatura de 37ºC e a um ph de 4.7. O que nos mostra que apesar de existir alguma discrepância nestes valores, o que é óbvio que aconteça porque em nenhum dos casos as condições experimentais são exactamente as mesmas que as utilizadas (certas condições como a temperatura e o ph vão alterar o comportamento da enzima, apresentando-se esta mais ou menos activa conforme se forem aproximando dos chamados valores óptimos para os quais a sua actividade é máxima; alterando, consequentemente, os valores de K m e V max ), a enzima apresenta uma boa afinidade para o substrato, neste caso a sacarose, uma vez que o valor de K m obtido cai sobre uma zona de valores aceitáveis. Para além das condições experimentais não serem exactamente as mesmas há que acrescentar o facto de certos erros experimentais, como os referidos anteriormente, terem ocorrido ao longo do trabalho experimental. É de referir, ainda, que não se encontraram valores de V max para os quais se pudesse dizer que se pudesse fazer uma comparação que fosse fidedigna, uma vez que cada autor adopta a sua unidade para V max e de forma a evitar quaisquer conclusões erróneas ou que possam induzir a erro esta comparação não vai ser efectuada. 9,

23 Conclusão Por comparação entre os valores de K m obtidos com e sem optimização podese concluir, que apesar de existir um pequeno desvio de 4,02mM este não é suficientemente grande para se poder dizer que o valor considerado para K m (com optimização) seja errado. Em conclusão, apesar de todos os erros experimentais que possam ter ocorrido, pode-se concluir que os valores encontrados através do modelo de Lineweaver-Burk são relativamente aceitáveis por comparação com os valores obtidos por outros autores, verificando-se que os parâmetros cinéticos característicos da invertase a uma temperatura de 45ºC e a um ph de 4.5 são: uma velocidade máxima de actuação da enzima (V max = 5,296mM/min) e uma medida da sua afinidade ao substrato (K m = 20,53mM). Pelo que os objectivos do trabalho laboratorial foram atingidos. 22

24 Bibliografia COX, MICHAEL M.; NELSON, DAVID L.; Lehninger Principles of Biochemistry, W. H. Freeman and Company, 4ª Edição; LESKOVAC,VLADIMIR; Comprehensive Enzyme Kinetics, Kluwer Academic Publishers, 2004; Enzymes and Pathologic Pathways Database, mantida por Integrated Genomics, 2201 W. Campbell Park Dr., Chicago, Estados Unidos da América, consultada a 12/10/