MICROPLACA MUG/EC 1 - UTILIZAÇÃO As microplacas MUG/EC permitem a identificação e enumeração de Escherichia coli em águas, de acordo com a norma NF EN ISO 9308-3. A utilização de placas de microtitulação com poços contendo um meio especifico, foi concebido para utilização na análise de vários tipos de água, nomeadamente água balneares (salgada e doce), de superfície e água tratada. O método é aplicável a todas as amostras de água, incluindo aquelas com matérias em suspensão. Para enumeração de Escherichia coli, a técnica de microplaca com MUG tem sido reconhecida como a mais específica, precisa e rápida em comparação com os métodos utilizados anteriormente. Em virtude do seu papel como um indicador de contaminação fecal, esta bactéria é de especial interesse devido à sua exclusiva origem intestinal, o que lhe confere um estatuto mais particular como principal bioindicador nos controles de qualidade da água. 2 - HISTÓRIA Buehler et al, em 1949, foram os primeiros a mostrar a presença da β-d-glucuronidase na Escherichia coli. Em 1976, Kilian e Bülow demonstrou essa atividade enzimática característica apenas do género Escherichia, Shigella e Salmonella. A partir dessas observações, Feng e Hartman, em 1982, desenvolveram procedimentos para a deteção específica de Escherichia coli em água e produtos alimentares. Trepeta e Edberg incorporaram MUG num meio de cultura, a fim de detetar a presença de β-glucuronidase. A maioria dos estudos tem mostrado que 94-97% de Escherichia coli de origem humana ou ambiental possuem esta atividade. Dados recentes também mostram que esta enzima pode ser detetada em certas espécies de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella e Yersinia, num número limitado de estirpes dos géneros acima referidos. A técnica de microplaca, bem como o método estatístico de interpretação dos resultados, foi utilizada e validada por Hernandez, em 1988, com o auxílio de 5 laboratórios parceiros para um estudo comparativo entre os métodos usados e o novo método fluorogénico miniaturizado, em água do mar ao largo das costas francesas. O grau de recuperação foi igual ou superior a outros métodos em tubos ou por filtração em membrana. Em particular, o método miniaturizado mostrou uma maior especificidade do que filtração em membrana. β-d-glucuronidase pode, portanto, ser considerado como um indicador de confiança para a deteção de Escherichia coli em água. 3 - PRINCÍPIO - Cada microplaca contém 96 poços de (12 linhas de 8 poços). - O substrato que demonstra a atividade enzimática bacteriana em questão é o MUG (4-metilumbeliferil β - D-glucuronido). Este componente é incorporado num meio de cultura derivado do meio A1 citado pela Associação Americana de Saúde Pública para a determinação da presença de coliformes fecais na água. O meio de cultura é desidratado e fixada ao fundo dos poços da microplaca. Reidratação do meio é conseguida quando a própria amostra de água é introduzida nos poços. Escherichia coli, eventualmente presente na amostra hidrolisa o MUG em 4-metilumbeliferona e glucuronido seus constituintes. A produção de 4-metilumbeliferona, indicado por uma fluorescência azul, podem ser observados com o auxílio de uma lâmpada de UV a 366 nm. Uma vez feita a leitura dos poços, o número de poços fluorescentes é contado para cada diluição. A partir de um número característico obtido, uma análise estatística, com base na
equação de Poisson permite o cálculo de Escherichia coli na amostra analisada. É importante notar que certas estirpes de Escherichia coli, não possuem β-d-glucuronidase, em particular a estirpe Escherichia coli O157: H7. - A composição do meio, com seu alto nível de peptona e salicina, permite uma excelente recuperação. - Triton X favorece a dispersão do microorganismo e fluorogénico nos poços da microplaca. - Incubação a 44 C para inibir o crescimento da maioria dos microrganismos contaminantes. 4 - COMPOSIÇÃO DO MEIO Cada microplaca é preenchida com 100 ul de meio, a fórmula pode ser ajustada para um melhor desempenho: Por 1 litro de meio: - Triptona...... 40,0 g - Salicilina...... 1,0 g - Triton X 100... 1,0 g - MUG...0,1 g ph: 6,9 ± 0,2. 5 -INSTRUÇÕES DE USO A fim de prosseguir com a análise de amostras de águas cloradas, bromados ou ozonizados, é necessário adicionar, em condições estéreis, o tiossulfato de sódio no recipiente de recolha para neutralizar os oxidantes, de modo a obter a recuperação total dos microrganismos. PREPARAÇÃO E DILUIÇÃO - Misturar bem a amostra de forma a obter uma repartição homogénea dos microrganismos. - Para água doce, balneares e outras águas de superfície (salinidade inferior a 30 g/kg), use 18 ml do diluente (Sal marinho sintético BR003 ou BM088). -Para água do mar com uma salinidade superior a 30g / kg (medido com o auxílio de um refratómetro), usar água destilada estéril (BM115) como diluente. - Realizar sucessivas diluições em série com o diluente BR003, BM088 ou BM115. O número de diluições para ser inoculados é uma função do nível de contaminação da amostra a testar. - O nº de diluições é em função do tipo de água de acordo com o quadro seguinte: Tipo amostra Nº de diluições Nº de poços / Diluição Intervalo de deteção Águas Balneares 2 64 poços a 1:2 32 poços a 1:20 1,5 x 10 1 a 3,5 x 10 4 24 poços a 1:2 Águas Superficiais 4 24 poços a 1:20 24 poços a 1:200 24 poços a 1:2000 4,0 x 10 1 a 3,2 x 10 6 16 poços a 1:2 Águas residuais e tratadas 6 até 16 poços a 1:200000 6,0 x 10 1 a 6,7 x 10 8
INOCULAÇÂO - Transferir a diluição inicial para um recipiente estéril apropriado. - Usar uma pipeta multi-canal (8 pontas estéreis), inocular 200 μl em cada microplaca. Distribuição: 200 µl / poço Incubação: 36 a 72 h a 44 C - Da mesma forma, inocular as diluições subsequentes (1:20, 1: 200, 1: 2000, etc), utilizando um novo recipiente e novas pontas estéreis. - A inoculação deve ser realizada com cuidado, a fim de evitar a contaminação cruzada. - Cobrir cada microplaca com uma cobertura adesiva estéril fornecida com o kit. Isso limita a desidratação do meio e protege a placa de contaminação externa durante o período de incubação. INCUBAÇÃO Incubar as microplacas a (44 C ± 0,5) C pelo menos 36 horas, não exceder um máximo de 72 horas. 6 - RESULTADOS Os poços que mostram um azul fluorescente sob luz UV 366 nm são considerados positivos. A leitura pode ser realizada após o período mínimo de incubação pois a fluorescência não diminui ao longo do tempo. As microplacas opacas (BT001) foram desenvolvidas para uma leitura visual e contagem manual. Ver Foto anexo 1 Determinar o número característico a partir dos poços positivos para cada uma das diluições escolhidas. No caso em que mais de 3 diluições são inoculadas, um número característico composto de três números (se possível terminado em 0) deve ser considerado. Ver a tabela fornecida no anexo da norma NF EN ISSO 9308-1 Nota:Um ficheiro em excel pode ser fornecido a pedido. 7 - CONTROLE DE QUALIDADE Fluorescência após 48 h de incubação a 44 ± 1 C: Análise Fundo: Distribuição do Diluente Sal Marinho Nível médio de fluorescência com Escherichia coli WDCM 00179 Fertilidade / Microorganismo Resultado / Crescimento Ausência de poços positivos Fundo <25 % do limiar positivo Fluorescência maior que o dobro do valor positivo Limiar (variação <10%) Crescimento / Grau de recuperação Escherichia coli WDCM 00179 66 a 150% do valor alvo
8 - CONSERVAÇÃO E VALIDADE Microplacas: 2-8 C. - Data de validade indicada no rótulo. 9 - EMBALAGEM Referência Microplacas brancas opacas: 25 microplacas + 25 selantes adesivos transparentes estéreis BT00108 10 - BIBLIOGRAFIA BUEHLER, H.J., KATZMAN, P.A., and DOISEY, E.A. 1949. Bacterial glucuronidase. Federation Proceedings, 8 : 189. COCHRAN, W.G.. 1950. Estimation of bacterial densities by means of the "Most Probable Number". Biometrics, 6 : 105-116.de MAN, J.C.. 1975. The probability of most probable numbers. European Journal of Applied Microbiology, 1 : 76-78. KILIAN, M., and BÜLOW, P.. 1976. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. I. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica Section B, 84 : 245-251. FENG, P.C.S., and HARTMAN, P.A.. 1982. Fluorogenic assays for immediate confirmation of Escherichia coli. AppliedEnvironmental Microbiology, 43 :1320-1329. HURLEY, M.A., and ROSCOE, M.E.. 1983. Automated statistical analysis of microbial enumeration by dilution series. Journal of Applied Bacteriology, 55 : 159-164. TREPETA, R.W., and EDBERG, S.C.. 1984. Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide-based medium for rapid isolation and identification of Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology, 19 : 172-174. HERNANDEZ, J.F., GUIBERT, J.M., DELATTRE, J.M., OGER, C., CHARRIERE, C., HUGUES, B., SERCEAU, R., and SINEGRE, F.. 1991. Miniaturized fluorogenic assays for enumeration of E.coli and enterococci in marine water. Water Scienceand Technology, 24 : 137-141. NF EN ISO 9308-3 Mars 1999. Qualité de l eau. Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux de surface et résiduaires. Partie 3 : Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour ensemencement en milieu liquide. 11 INFORMAÇÃO ADICIONAL As informações fornecidas nos rótulos têm precedência sobre as formulações ou instruções descritas neste Documento e são suscetíveis de modificação a qualquer momento, sem aviso prévio. Código do documento: MICROPLATE MUG EC_ENv8 Data de criação: 02-2005 Atualizado em: 02-2017 Origem da revisão: Clarificação das instruções de utilização
ANEXO 1 : FOTO DE APOIO Microplate MUG/EC Deteção e enumeração de Escherichia coli em água, de acordo com a NF EN ISO 9308-3. Resultados: Crescimento obtido após Incubação de 36 horas a 44 C Características:Os poços com luz azul sob uma lâmpada UV a 366 nm são considerados positivos (presença de E. coli na água)