PERFIS DE OCORRÊNCIAS DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES E Escherichia coli EM DIFERENTES AMOSTRAS DE ÁGUA

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1 PERFIS DE OCORRÊNCIAS DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES E Escherichia coli EM DIFERENTES AMOSTRAS DE ÁGUA Daniel Adolpho Cerqueira (1) Biólogo - Mestre em Microbiologia pela UFMG Responsável pelo Controle Microbiológico da COPASA - MG. Professor convidado para o Curso de Especialização em Engenharia Sanitária e Ambiental da UFMG. Ludmila L. Alves Brito Bacharelanda em Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Patrícia C. Galinari Bióloga - Técnica de Laboratório do Setor de Análises Microbiológicas da COPASA - MG. Grace C. M. Amaral Técnica Química de Laboratório do Setor de Análises Microbiológicas da COPASA - MG. Endereço (1) : Setor de Análises Microbiológicas - Laboratório Metropolitano - COPASA- MG - BR - Km CEP: Belo Horizonte - MG - Brasil - Tel. (31) Fax: (31) labo@copasa.com.br RESUMO As avaliações da qualidade da água utilizando bactérias do grupo coliforme tem utilizado proporções entre seus subgrupos e espécies como critérios de caracterização de tipo e época da poluição. A proporção entre coliforme total e coliforme fecal estabelecida em 5:1 na Resolução n o CONAMA (1986), a fragilidade dos testes para coliformes termotolerantes em estabelecer a porção realmente fecal desse subgrupo e a definição da Escherichia coli como parâmetro de escolha para avaliação da poluição fecal de acordo com os Guias da OMS (1995) permitem uma série de questionamentos quanto à validade da aplicação desses indicadores. Este trabalho avaliou os perfis de ocorrência desses parâmetros - coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli- em diversos tipos de água - mananciais de superfície, afluentes de Estações de Tratamento de Água e Esgoto doméstico. Entre os objetivos, foram avaliados os percentuais de ocorrência de E. coli em contagens de coliformes termotolerantes e desses nas contagens de coliformes totais. Não foram observados padrões nas proporções obtidas em todas as amostras. A distribuição dos percentuais não apresentou similaridades nem entre os parâmetros nem entre os diferentes tipos de amostras. Os coliformes termotolerantes β- glucoronidase positivos foram registrados como E. coli (GUR +) e identificados em sistema API E. Cerca de 1762 isolamentos foram obtidos das amostras em que 244 foram identificados especificamente pelo sistema API E. A E. coli foi a espécie mais isolada, seguida de espécies dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. Um pequeno percentual de E. coli apresentou-se GUR-, embora em sua maioria tenha recuperado a atividade glucoronidásica em sub cultivos posteriores. PALAVRAS-CHAVE: Coliformes Totais, C. Termotolerantes, E. Coli, Qualidade da Água. o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1251

2 INTRODUÇÃO Os testes convencionais para a determinação de coliformes fecais padronizados segundo o Standard Methods (APHA, 1995), têm utilizado a temperatura elevada - 44,5 ±,2 o C - como critério de diferenciação. A primeira definição de bactérias termotolerantes surgiu dos experimentos realizados por EIJKMAN (194), quando verificou que somente a Esherichia coli fecal era capaz de fermentar a glicose com produção de gás a uma temperatura de 46 o C. Com os aprimoramentos sucessivos dos meios de cultura envolvidos no teste, STUART e colaboradores (1942), trabalhando com água tratada, identificaram outras espécies - Enterobacter aerogenes e Citrobacter freundii - que também produziam gás a partir da fermentação da lactose quando incubadas a 45,5 o C. Dados da literatura estimam que 15% dos testes positivos para Coliformes Termotolerantes são devidos a outros coliformes que não E.coli, provenientes de diversas origens. Muitos destes resultados são devidos a espécies dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter, de contribuição ambiental (solo, vegetais, e águas pristinas) (CAPELNAS & KANAREK, 1984; EDBERG et al. 1994). Em ambientes aquáticos tropicais, esses gêneros são facilmente isolados em condições em que não se observa poluição fecal humana e animal. À rigor, E. coli é o único membro do grupo coliforme que é inquestionavelmente habitante do trato intestinal, apresentando percentual próximo a 94% em fezes humanas e animais (ALLEN, 1995).Anteriormente, justificava-se utilizar o teste da temperatura elevada para a diferenciação da porção fecal dos coliformes uma vez que a detecção da E. coli era demorada e complexa para exames de rotina. Atualmente, com o advento dos testes cromogênicos, a detecção e identificação da E. coli torna-se simples e acessível a todos os laboratórios de controle de qualidade da água. Nestes testes a E. coli é detectada e identificada pela expressão da enzima b- glucoronidase em meios de substratos definidos. De acordo com os guias da Organização Mundial de Saúde, a ausência de E. coli em uma contagem de coliformes de coliformes totais ou mesmo em termotolerantes significaria adequabilidade de uma fonte de água para abastecimento. Este trabalho procurou determinar os perfis de ocorrência de E. coli nas contagens de coliformes termotolerantes e desses nas contagens de coliformes totais. OBJETIVOS Determinar a porcentagem de Coliformes Termotolerantes dentre os Coliformes Totais, para amostras de água provenientes de diferentes fontes (Manancial, afluente de ETA, afluente de ETE) e em amostras de fezes humanas frescas. Determinar a porcentagem de Coliformes Termotolerantes não-e.coli, através da expressão da enzima b-glucoronidase, de amostras de água provenientes de diferentes fontes (Manancial, ETA bruta, afluente de ETE) e em amostras de fezes humanas frescas. Verificar se há diferença na proporção Coliformes Termotolerantes /Coliformes Totais e na proporção Coliformes Termotolerantes não E.coli/Termotolerantes E.coli dentre as diversas fontes analisadas. o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1252

3 METODOLOGIA Amostragem No período de Abril de 1997 a Março de 1998 foi coletado um total de 9 amostras de água provenientes de três diferentes fontes: 3 amostras de manancial, 3 amostras de afluente de ETA, e 3 amostras de afluente de ETE. Todas as amostras provieram dos Sistemas de abastecimentos e coleta de esgoto operados pela COPASA MG, com distribuição regional aleatória. As amostras foram coletadas em frascos de polietileno estéreis num volume total correspondente a 1 ml, segundo técnicas do Standard Methods da 19 o edição, APHA Além destas, foram analisadas 15 amostras de fezes humanas frescas, coletadas de voluntários (1 masculinos e 5 femininos), com idades entre 21 e 45 anos. ANÁLISE BACTERIOLÓGICA Amostras de Água O volume da amostra a ser analisado foi padronizado de acordo com dados obtidos anteriormente no Laboratório Central de Microbiologia da COPASA MG, sendo que para as amostras de afluente de ETA esse volume variou de 1 a 5 ml (com 3 exceções onde se fez necessária a diluição da amostra até 1-2 ). Para as amostras de manancial o volume variou entre 1 e 5 ml, e para as amostras de afluente de ETE as diluições oscilaram entre 1-3 e 1-8, dependendo da ETE em questão. Neste trabalho utilizou-se o método de Membrana Filtrante de acordo com a 19 a edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Para o isolamento de Coliformes Totais, foi utilizado o meio m-endo ágar LES (35 o C/24 hs). Das colônias de brilho verde metálico, 1% foram a confirmadas por repique em Caldo lactosado e verde brilhante (35 o C/24-48 hs), onde se verificou a capacidade de fermentar a lactose com produção de gás. Todas as colônias que apresentaram brilho verde metálico foram transferidas uma a uma, com auxílio de palitos previamente esterilizados em autoclave, para o Placas de Petri contendo o meio de EC acrescido do substrato definido 5-bromo 4-cloro 3-indolil b-dglucoronida, e incubado a 44,5 o C por 24 hs, para verificação da porcentagem de Coliformes Termotolerantes. As colônias que apresentaram coloração verde-azulada foram classificadas como E. coli (1% foram confirmadas por Sistema de identificação*); já as colônias de cor branca forma transferidas para tubos de Ágar Tripticaseína de Soja inclinados para posterior identificação. Amostras de Fezes Humanas Foram coletadas pequenas quantidades de fezes com auxílio de swabs estéreis (CHANG et alli, 1989), e transportados em tubos de ensaio contendo água peptonada 1% o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1253

4 (Standard Methods). A partir desta solução foram efetuadas diluições a em água destilada estéril. A análise bacteriológica procedeu-se como descrito para as amostras de água. RESULTADOS E DISCUSSÃO Determinação da Proporção Coliformes Termotoletantes / Totais As porcentagens de coliformes termotolerantes dentre os coliformes totais está demonstrada separadamente na Figura 1. 1 % de Termotolerantes em Manancial Amostras (a) 1 % de Termotolerantes em ETA 8 A C E G I K M Amostras O Q S U X AA CC EE (b) a i c e g % de Termotolerantes em ETE k m Amostras o q s u x aa cc ee (c) o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1254

5 Figura 1 - Porcentagem de coliformes termotolerantes dentre as 3 diferentes fontes de água pesquisadas: Manancial (a), afluente de ETA (b) e afluente de ETE (c). Não foi observado nenhum padrão que nos permitisse determinar diferenças nesta proporção para as diversas fontes estudadas, uma vez que houve uma grande variação dessa porcentagem dentro das amostras analisadas em cada fonte (Figura 1). Para as amostras de fezes analisadas, apenas 5 apresentaram porcentagem de coliformes termotolerantes dentre os fecais inferior a 1% (Figura 2). 1 % Termotolerantes em Fezes 8 F1 F3 F5 F7 F9 F11 F13 F15 F17 F19 F21 F23 F25 F27 F29 Figura 2 - Porcentagem de coliformes termotolerantes dentre as amostras de fezes analisadas As amostras F13, F14 e F15 apresentaram um alto índice de coliformes nãotermotolerantes, resultado este que se confronta com o uso da temperatura elevada como critério de diferenciação de coliformes fecais (Standard Methods). Uma vez que estas amostras provieram de fezes e todas as colônias apresentaram brilho verde-metálico em meio de m-endo, por definição todos os organismos isolados pertencem ao grupo dos coliformes fecais; esse elevado índice de amostras não-termotolerantes encontrado neste estudo merece análise mais aprofundada e detalhada. Identificação dos Coliformes Termotolerantes Foram isoladas no total 1762 microrganismos das diversas fontes de água, sendo que 244 (todas as colônias isoladas em meio EC/BCIG que não apresentaram cor verde-azulada proveniente da utilização do substrato cromogênico, e certa porcentagem de colônias BCIG+) foram submetidos a identificação por API E. Das amostras de fezes foram isoladas 39 microrganismos, sendo 32 identificados pelo mesmo sistema. A ocorrência dos microrganismos nas diferentes fontes de água estudadas está relacionada na Tabela 1. Escherichia coli se apresentou como espécie predominantemente isolada nas três fontes estudadas, sendo que em amostras de afluente de ETE e em Manancial houve uma maior ocorrência de E. coli Glucoronidase-negativas (GUR-) no isolamento. As espécies de Klebsiella representaram os segundo gênero de maior ocorrência, sendo seguidos por representantes dos gêneros Enterobacter, Proteus, Citrobacter e a espécie Escherichia fergusonii (Tabela 1). Esses resultados estão de acordo como que vem sendo referenciado na literatura já a algum tempo. RAMTEKE et al. (1992), estudando diversas amostras de água na Índia, obtiveram uma porcentagem de 75,1% para E. coli e 16,4% para Klebsiella dentre os coliformes termotolerantes, sendo seguidas por espécies dos o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1255

6 gênero Proteus e Enterobacter. Outros trabalhos (AWWA, 1994; CHANG et al., 1989), também descreveram proporções semelhantes as encontradas neste trabalho; entretanto, CHARRIERE et al., pesquisando amostras de água bruta de país de clima temperado encontraram uma porcentagem de coliformes termotolerantes do gênero Citrobacter (46.9%) maior do que aquela encontrada para as espécies do gênero Klebsiella (37,5%). TABELA 1: Número de ocorrências das espécies de coliformes nas diversas fontes estudadas. Esgoto ETA Manancial Escherichia coli E. coli BCIG Klebsiella pneumoniae K. oxytoca 5 1 K. ornithinolytica 2 Enterobacter cloacae 2 En. sakasakii 1 1 En. aglomerans 2 En. aerogenes 1 Proteus mirabilis 1 1 Citrobacter freundii 1 E. fergusonii 1 Foi encontrado um percentual de 4.4% de Escherichia coli GUR- no isolamento (resultado falso-negativo), resultado este bem inferior ao encontrado por CHANG et alii ao estudarem human fecal samples (34% de E. coli GUR-). Deste total (78 isolados) de E. coli GUR- encontrado neste estudo, 53,9% são provenientes de amostras de esgoto, 39,7% de águas superficiais e 1,3% de água chegando à ETA. Alguns pesquisadores (MC FETERS et al., 1986; Mc FETERS, 199; COVERT et al., 1992) sugeriram que ocorre stress sub-letal, devidos à ação de desinfetantes e outros fatores antimicrobianos, que podem determinar o retardamento da recuperação celular microbiana em expressar atividade β- galactosidásica. Dos 78 isolados caracterizados como GUR-, 12,8% recuperaram esta atividade enzimática após sucessivos repiques em meios de cultura e em temperatura apropriados, confirmando que o stress causado por produtos tóxicos do ambiente aquático podem inibir a expressão do gene uid-a. Algumas bactérias apresentaram diferentes padrões de utilização do substrato cromogênico; elas são MUG positivas mas não podem hidrolizar o BCIG. Todos esses isolamentos provêm da mesma origem, sugerindo que essa característica pode ser ligada à especificidade celular. TABELA 2 - Perfis E. coli GUR- e sua distribuição. Esgoto ETA Mananc TOTAL GUR GUR +* BCIG-/MUG+ 7 7 TOTAL * Recuperaram sua atividade enzimática após sucessivos repiques o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1256

7 Das amostras provenientes de fezes humanas, todos os isolados foram identificados como pertencentes ao gênero E.coli, sendo que em 3 amostras foram isoladas E. coli GUR- (Tabela 3). Trabalhos anteriores reportam uma predominância de 94 a 96% de Escherichia coli em fezes humanas, sendo que espécies dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter compõe o restante desta porcentagem (ALLEN, 1995). Até o momento, a percentagem de E. coli GUR- é semelhante a obtida para as amostras de água - 4,4%; no entanto, os estudos em amostras de fezes humanas está apenas no início, e a amostragem ainda é muito pequena para que possamos concluir sobre quaisquer aspectos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ALLEN, M.J., EDBERG, S.C. The public health significance of bacterial indicators in drinking water. International Conference Coliforms and E. coli: Problem or solution?, University of Leeds, UK, September 24-27, CAPLENAS, N.R., KANAREK, M.S. Thermotolerant nonfecal source of Klebsiella pneumoniae: validity of the fecal coliform test in recreational waters. Am. J. Public Health, v.74, n.11, p CHARRIERE, G., MOSSEL, D.AA, BEAUDEAU, P., LECLERC, H. Assessment of the marker value of various components of the coli-aerogenes group of Enterobacteriaceae and of a selection of Enterococcus spp for the official monitoring of drinking water supplies. J. Appl. Bacteriol., v.76, p COSTA, L.J.P. Análise Bacteriológica da Água. Editora Universitária/UFPb, João Pessoa, PB EDBERG, S.C., ALLEN, M.J., SMITH, D.B. National Field Evaluation of a defined substate method for the simultaneous enumeration of total coliforms and Escherichia coli from drinking water: comparision with the standard multiple tube fermentation method. Appl. Environ. Microbiol., v.54, n.6, p , EIJKMAN, C. Die Gärungsprobe bei 46 o als Hilfsmittel bei der Trinkwasseruntersuchung. Centr. Bakt. I Abt. Orig. v.37, p McFETERS, G.A, KIPPIN, J.S., LeCHEVALLIER, M.W. Injured coliforms in drinking water. Appl. Environ. Microbiol. v.51, p.1, McFETERS, G.A Enumeration, ocurrence, and significance of injured indicator bacteria in drinking water. In.: Drinking Water Microbiology: progress and recent developments. Ed. Springer-Verlag, New York, RAMTEKE, P.W., BHATTACHARJEE, J.W., PATHAK, S.P., KAIRA, N. Evaluationof coliforms as indicators of water quality in India. J. Appl. Bacteriol. V.72, p , Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.. APHA-AWWA-WEF. 19 o Edition, STUART, C.A et alli Eijkman relationships of the coliform and related bacteria. J. Bacteriol., v. 43, p o Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 1257