XI COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS DE TUBOS MÚLTIPLOS E CROMOGÊNICA NA ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUAS DE PRAIAS

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1 XI COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS DE TUBOS MÚLTIPLOS E CROMOGÊNICA NA ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUAS DE PRAIAS Vera Nobre Braz (1) Química Industrial, Mestre em Geoquímica pelo Centro de Geociências da UFPA. Professora Adjunto IV do Depº de Engª Química da UFPA. Pesquisadora nas áreas de Qualidade da Água e Controle Ambiental. Consuelo L. Sousa Química Industrial, Mestre em Ciências Biológicas, Professora Assistente do Depº de Engª Química da UFPA. Pesquisadora nas áreas de Controle Ambiental em água e alimentos. Maria do Socorro M. Bezerra Estudante do curso de Engª Sanitária da UFPA David Franco Lopes Estudante do curso de Engª Sanitária da UFPA Endereço (1) : Rua Oliveira Belo, 488 Belém Pará - Brasil CEP Tel: (091) verabraz@ufpa.br RESUMO Métodos rápidos de identificação de coliformes totais e fecais vem sendo propostos, o que tem facilitado estudos das mais diversas naturezas, inclusive o de balneabilidade. No entanto, tornou-se necessário a verificação da correlação entre tais métodos e o método clássico de análise de água, que é o de Tubos Múltiplos, para que se tivesse certeza da pertinência de seu uso em estudos com águas brutas. Foram analisadas 175 amostras na comparação entre Tubos Múltiplos e e 225 entre Tubos Múltiplos e Meio A1. Ambos apresentaram boa correlação demonstrando a possibilidade de sua utilização em estudos de balneabilidade na região Norte PALAVRAS-CHAVE: Água, Praia, Coliformes, Cromogênico, Meio A1. INTRODUÇÃO A quantidade de água doce na região Amazônica é vital para a humanidade, sendo necessária a conservação deste bem e portanto, estudos que avaliem suas condições de qualidade a fim de que possam ser preservadas. Em Belém, além das praias do Mosqueiro, as praias mais procuradas pelos veranistas, quer pela sua beleza ou pela sua proximidade com a capital, são as da ilha do Outeiro e do Distrito de Icoaraci (Braz et al., 1997), que fazem parte do estudo proposto. A pesquisa de microrganismos patogênicos na água, requer procedimentos complexos e longo tempo para obtenção de resultados, o que inviabiliza sua aplicação na rotina, além do que normalmente, encontram-se em número reduzido e sua chegada à água é intermitente. Portanto, para a avaliação de sua qualidade do ponto de vista bacteriológico, é imprescindível a utilização de organismos indicadores de contaminação (Bonde, 1977). Dentre os principais indicadores de contaminação estão os coliformes totais, coliformes fecais, E.coli e estreptococos fecais. Outros indicadores tem sido propostos, e todos apresentam vantagens e desvantagens de aplicação para a avaliação da qualidade sanitária dos ambientes aquáticos, no entanto, os padrões bacteriológicos de qualidade da água a nível nacional e internacional estão baseados na detecção e enumeração de coliformes totais, coliformes fecais e E.coIi (Conselho Nacional do Meio Ambiente - CONAMA. l986; WorId Health Organisation WHO, l987; Environmental Protection Agency- EPA, 1992; APHA. 1995). ABES Trabalhos Técnicos 1

2 Os métodos chamados rápidos surgiram como conseqüência da necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados analíticos e de se melhorar a produtividade laboratorial. Além desses objetivos, esses métodos visam a simplificação do trabalho e a redução de custos com meios de cultura e equipamentos. A essas vantagens aliam-se outras como maior sensibilidade e especificidade que os métodos convencionais. Nos últimos anos, tem se observado que a área de métodos rápidos desenvolve-se de forma acelerada, com o surgimento constante de novos sistemas e instrumentos, destinados aos mais variados tipos de análise (Franco, 1998). Pela simplicidade e rapidez de processamento, o teste cromogênico tem sido implantado em muitos laboratórios bacteriológicos. Esse teste fornece os resultados em 24 horas e podem ser obtidos nos formatos de presença /ausência, número mais provável (NMP) e por Unidade Formadora de Colônia (UFC) Membrana Filtrante. O princípio do sistema ou teste cromogênico está na definição dos substratos específicos para o grupo ou espécie de microorganismos a ser determinado. Para a determinação de coliformes, utiliza-se o substrato ß galactopiranosídeo que é específico para uma enzima encontrada nas bactérias desse grupo a ß D galactosidade. (Heizmann et all, 1988). Vários trabalhos têm relatado a atividade desses substratos na detecção de coliformes em amostras de água ( Pellizari, et al., 1993; Trepta & Edberg, 1994 ; Fricker & Fricker, 1996 ). O outro método utilizado, desenvolvido por Andrews e Presnell em 1972, utiliza o meio A1 na técnica de Tubos Múltiplos para a determinação de coliformes fecais em águas estuarinas, sendo os resultados obtidos em 24 horas. O objetivo deste trabalho foi o de comparar resultados obtidos através da técnica convencional de Tubos Múltiplos () com os obtidos pelas técnicas cromogênica () para coliformes totais e a que utiliza o meio A1 para coliformes fecais, em praias de água doce. Importante ainda é que tal comparação seja efetuada em cada região, pois a característica das águas, condições climáticas, e fatores geológicos, poderão alterar a eficiência dos métodos, diferenciando resultados em cada região estudada. MATERIAIS E MÉTODOS AMOSTRAS Foram analisadas 225 amostras provenientes de 15 praias estuarinas de água doce, localizadas no município de Belém-Pa, ao longo de cinco campanhas, constituídas cada uma de cinco coletas consecutivas semanais, durante o período de 1998 a Para comparação entre os métodos de e A1 todas as amostras foram utilizadas e para a comparação entre as técnicas e apenas 175. A coleta das mesmas seguiu as recomendações do Stardard Methods (APHA,1995) e da resolução nº 20 do CONAMA (1986). DETERMINAÇÕES As análises foram realizadas com metodologia descrita no Standard Methods (APHA,1995): Tubos Múltiplos. Diluições decimais das amostras foram inoculadas em 5 tubos contendo caldo lactosado e incubadas por 48hs a 35 o C; os tubos positivos foram confirmados em caldo lactose verde brilhante bile a 2% e em meio EC por 48 h a 35 0 C e por 24hs a 44,5ºC respectivamente para coliformes totais e fecais. Cromogênico. Foi utilizado o kit (Idexx/Quanti-tray) o qual detecta coliformes totais e E.coli em amostras de água através da reação com ONPG (o-nitro fenil-beta-d-galactopiranosideo) e MUG (4metilumbeliferil-beta-D-glucoronida) respectivamente. O meio de cultura já vem na quantidade certa para a analise de 100ml de água, bastando adicionar o conteúdo de um recipiente a amostra. Este volume 2 ABES Trabalhos Técnicos

3 foi colocado em cartela própria (quanti-tray), com 97 quadrículas que após selada foi incubada a 35ºC por 24hs. Amostras que ficaram amarelas foram consideradas positivas para coliformes totais. Os resultados foram lidos em tabela própria, fornecida pelo fabricante. Meio A1: Diluições decimais das amostras foram incubadas em 5 tubos de ensaio contendo meio de cultura denominado de meio A1, o qual difere do caldo lactosado pela substituição da triptose por triptona, pela eliminação do sistema tampão fosfato e adição de salicina e triton. Foram seguidas alterações propostas por técnicos da Cetesb, com relação a incubação, a qual foi feita a 44,5ºC em banho maria por 24 horas. A diferença é que a técnica recomenda incubação prévia de 3hs em estufa a 35ºC e após em banho maria a 44,5ºC por 21hs. O resultado foi verificado através da leitura dos tubos positivos (produção de gás no tubo de Durhan), na mesma tabela de NMP utilizada para os Tubos Múltiplos. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram convertidos ao logaritmo na base 10. Para verificar a correlação entre os métodos, utilizou-se o Teste F de Snedecor com nível de significância a 5% (α=5%), como recomendado pelo Standard Methods (APHA, 1995) para amostras ambientais. RESULTADOS E DISCUSSÕES Nas Tabelas 1 e 2 são apresentadas as percentagens de resultados positivos de coliformes totais e fecais, obtidos pela comparação com os resultados de Tubos Múltiplos e e Tubos Múltiplos e A1 respectivamente. Optou-se pelas faixas de 5x10 3 para coliforme total e 10 3 para coliforme fecal pelo fato de se constituírem os limites de balneabilidade para estes dois indicadores. Nas Figuras 1 e 2 verifica-se comportamento semelhante ou seja a técnica de apresentou-se mais sensível para faixas mais baixas enquanto que as técnicas do meio A1 e para faixas mais elevadas. Tabela 1: NMP de coliformes totais obtidos pelas técnicas dos Tubos Múltiplos e em 175 amostras de 15 praias Determinações Técnicas Tubos Múltiplos () Faixas NMP < 5x10³ NMP 5x10³ NMP < 5x10³ NMP 5x10³ Coliforme Total Nº % Nº % Nº % Nº % , , , ,57 Nº de resultados NMP< 5x10³ NMP > 5x10³ faixas Figura 1: Representação gráfica da Tabela 1 ABES Trabalhos Técnicos 3

4 Tabela 2: NMP de coliformes fecais obtidos pelas técnicas dos Tubos Múltiplos e meio A1 em 225 amostras de 15 praias Determinações Técnicas Tubos Múltiplos () Meio A1 Faixas NMP < 10³ NMP 10³ NMP < 10³ NMP 10³ Coliforme Fecal Nº % Nº % Nº % Nº % , , , ,89 Nº de resultados NMP< 10³ NMP > 10³ Faixas Figura 2: Representação gráfica da Tabela 2 Nas Tabelas 3 e 4 estão apresentados os resultados dos dados estatísticos por pontos de coleta, para coliformes totais e fecais, comparando-se os métodos analisados. Verificou-se que mais de 50% dos resultados tanto para coliformes totais como para fecais, apresentaram boa correlação (r>0,5). Tabela 3: Dados estatísticos por ponto de coleta para coliformes total ( x ) Praias Nº de Média Desvio Padrão amostras Correlaçã o (r) Areião 10 3,084 3,617 0,512 0,638-0, ,176 3,653 0,596 0,461 0,618 Farol 10 3,519 3,900 0,874 0,427 0,830 Chapel Virado 10 3,248 3,737 0,854 0,579 0,516 Porto Artur 10 3,075 4,053 0,808 0,331 0,381 Murubira 10 3,235 3,811 0,817 0,421 0,599 Ariramba 10 3,054 3,817 0,996 0,340 0,492 São Francisco 10 3,145 3,985 0,868 0,368 0,424 Marahú 10 2,600 3,686 0,514 0,297 0,386 Paraíso 10 2,792 3,622 0,531 0,325 0,832 Barro Branco 15 3,485 3,972 0,600 0,493 0, ,428 3,824 0,549 0,399 0,777 Brasília 15 3,472 3,794 0,391 0,360 0,374 Cruzeiro ,164 4,360 0,395 0,395 0,510 Cruzeiro ,169 4,571 0,634 0,419 0,372 4 ABES Trabalhos Técnicos

5 Tabela 4: Dados estatísticos por ponto de coleta para coliformes fecais ( x A1) Praias Nº de Média Desvio Padrão Correlação amostras A1 A1 (r) Areião 14 2,666 2,753 0,734 0,678 0, ,468 2,946 0,662 1,140 0,781 Farol 14 3,054 2,590 1,321 0,777 0,609 Chapel Virado 14 2,833 2,965 0,876 0,705 0,403 Porto Artur 15 2,649 2,939 0,632 1,123 0,487 Murubira 15 2,831 2,822 1,077 1,126 0,908 Ariramba 15 2,853 3,130 1,206 1,035 0,864 São Francisco 15 2,773 3,133 0,724 1,061 0,542 Marahú 15 2,459 2,372 1,140 0,947 0,658 Paraíso 14 2,453 2,756 0,618 1,135 0,496 Barro Branco 16 3,034 3,344 0,587 0,633 0, ,914 3,112 0,537 0,641 0,461 Brasília 16 3,012 2,931 0,401 0,457 0,396 Cruzeiro ,587 3,586 0,510 0,581 0,256 Cruzeiro ,652 3,570 0,392 0,518-0,322 Nas Figuras 3 e 4 estão representadas graficamente as médias gerais dos logaritmos dos resultados por pontos de coleta para coliforme total e fecal respectivamente. Os índices de correlação obtidos foram de: r= 0,824, entre x para coliforme fecal r= 0,762, entre xa1 para coliforme fecal NMP/100mL 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 r=0,824 Areião Farol Chapéu Virado Porto Arthur Murubira Ariramba São Francisco Pontos de Coleta Marahú Paraíso Barro Branco Brasília Cruzeiro 1 Cruzeiro 2 Figura 3: Média geral do logaritimo dos resultados de coliforme total ( x ) por ponto ABES Trabalhos Técnicos 5

6 NMP/100mL 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 r=0,762 A1 Areião Farol Chapéu Virado Porto Arthur Murubira Ariramba São Francisco Marahú Paraíso Barro Branco Brasília Cruzeiro 1 Cruzeiro 2 Pontos de Coleta Figura 4: Média geral do logaritimo dos resultados de coliforme fecal ( x A1) por ponto Verificando a significância dos resultados pelo Teste F de Snedecor, a nível de 5% conforme Tabela 5, encontram-se os valores de 8,55x10-9 para x e 0,342 para x A1, o que comprova a correlação apresentada nas Figuras 3 e 4. Tabela 5: Resultados dos valores obtidos e do Teste F de Snedecor Comparações A1 Dados n= 175 n = 225 Média 3,413 3,948 2,925 3,028 Valor máximo 5,477 5,384 6,204 6,204 Valor mínimo 1,301 2,000 0,903 0,041 Desvio Padrão 0,764 0,504 0,837 0,890 Máximo calculado 4,177 4,452 3,762 3,918 Mínimo calculado 2,650 3,444 2,087 2,139 Teste F 8,55x ,342 Teste F tabelado p/ n>120 α = 5% 3,84 α = 5% 3,84 CONCLUSÕES Pelos resultados encontrados, verifica-se boa correlação entre as metodologias testadas, indicando a possibilidade de utilização dos métodos rápidos em estudos de balneabilidade e outros de natureza semelhante em águas brutas. Os mesmos estudos deverão ser efetuados para águas subterrâneas e tratadas, para verificar a pertinência do uso dos métodos. Deverão também ser desenvolvidas análises comparativas entre os valores de E.coli, obtidos pela técnica de Tubos Múltiplos e pela técnica cromogênica. 6 ABES Trabalhos Técnicos

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