FLÁVIA DANTAS SOARES

FLÁVIA DANTAS SOARES AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS P53, BCL-2 E ANTÍGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR KI-67 EM LESÕES HIPERPLÁSICAS, CANCERIZÁVEIS E CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS BUCAIS Orientadora: Profa. Dra.Simone de Queiroz Chaves Lourenço Co-orientadora: Profa. Eliene Carvalho da Fonseca Niterói 2005

FLÁVIA DANTAS SOARES AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS P53, BCL-2 E ANTÍGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR KI-67 EM LESÕES HIPERPLÁSICAS, CANCERIZÁVEIS E CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS BUCAIS Dissertação apresentada ao Curso de Pósgraduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Buco-Dental Orientadora: Profa. Simone de Queiroz Chaves Lourenço Co-orientadora: Profa. Eliene Carvalho da Fonseca Niterói 2005

Soares, Flávia Dantas Avaliação da expressão das proteínas p53, bcl-2 e antígeno de proliferação celular Ki-67 em lesões hiperplásicas, cancerizáveis e carcinomas de células escamosas bucais/ Flávia Dantas Soares. Niterói, 2005. 223f. Dissertação de Mestrado (Patologia Buco-Dental Curso de Pós- Graduação em Patologia Universidade Federal Fluminense) I. Leucoplasia. II. Apoptose. III. Proliferação celular. 1. Universidade Federal Fluminense. 2. Título. CDD:

Flávia Dantas Soares Avaliação da expressão das proteínas p53, bcl-2 e antígeno de proliferação celular ki-67 em lesões hiperplásicas, cancerizáveis e carcinomas de células escamosas bucais ORIENTADORA: Simone de Queiroz Chaves Lourenço CO-ORIENTADORA: Eliene Carvalho da Fonseca Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Buco-Dental Aprovada em 10 de março de 2005 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Carlos Eduardo Bacchi Doutor em Patologia Médico consultor em Patologia Prof. Dr. Abel Silveira Cardoso Universidade Federal do Rio de Janeiro Profa. Dra. Ana Maria Reis Ferreira Universidade Federal Fluminense Niterói 2005

Quando cortas uma flor para ti, começas a perdê-la... porque murchará em tuas mãos e não se fará semente para outras primaveras. Quando aprisionas um passarinho para ti, começas a perdê-lo... Porque não mais cantará no bosque para ti nem criará outros passarinhos em seu ninho. Quando guardas teu dinheiro começas a perdê-lo... porque o dinheiro não vale por si, mas pelo o que com ele se pode fazer. Quando não arriscas tua liberdade para tê-la, começas a perdê-la... porque a liberdade que tens se comprova quando te atiras optando e decidindo. Quando não deixas partir o teu filho para a vida, começas a perdê-lo... porque nunca o verás voltar para ti livre e maduro. Lembre-se sempre : Não existe preço para a Liberdade, mas uma belíssima recompensa para quem a utiliza com desprendimento de alma... Ter para sempre, junto a si a Fidelidade daqueles que livres dos grilhões, se comprazem em serem seus eternos admiradores! Quem Ama... Liberta com a certeza da volta espontânea ao aconchego! Aprende no caminho da vida a paradoxal lição da experiência: Sempre ganhas o que deixas e perdes o que reténs... (autor desconhecido)

Ao meu marido, Felipe, por compreender a minha ausência e pelo grande apoio dado à confecção desse trabalho.

AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Luiz Manoel Claro Soares e Tania Regina Dantas Soares, meus primeiros mestres e maiores exemplos de vida. Amo vocês! Á professora doutora, Simone de Queiroz Chaves Lourenço, minha orientadora e amiga que com seu jeito sereno soube me orientar de forma tão brilhante. Admiro-a pela sua capacidade, dedicação e espírito de liderança. Obrigada por ter acreditado em mim! Aos meus eternos mestres, Adriana Terezinha Neves Novellino Alves e Arley da Silva Junior, muito obrigada pelo apoio, incentivo e pela oportunidade de trabalhar com pessoas tão maravilhosas como vocês. À coordenadora do Curso de Pós-graduação em Patologia, Eliane Pedra Dias, pela seriedade e amor à docência. Obrigada pelos seus ensinamentos. Ao professor Licínio Esmeraldo da Silva, pela paciência e seriedade no minucioso trabalho de análise estatística.

Ao professor Eduardo Lourenço, pela sua contribuição na execução deste trabalho. Aos amigos, Karen Zavarro Balassiano, Adrianna Milagres, William Napolitano, Cristina Lazaro Loureiro e Ana Flávia Schueller, que muito contribuíram para a realização deste trabalho e no decorrer do curso de mestrado. Muito obrigada, adoro vocês!!!!! Aos colegas do Curso de Mestrado em Patologia Buco-Dental, por estarmos sempre juntos nessa difícil, porém gratificante jornada. Ao professor Renato Luiz dos Santos Cruz pela grande colaboração no difícil processo de captura de imagens. Às amigas Rita de Cássia, Thereza Fontana, Kátia Valéria e Alessandra Werneck pelos momentos de incentivo e carinho. Aos professores do Departamento de Patologia e do curso de Pósgraduação em Patologia. À professora Eliene de Carvalho da Fonseca, chefe do Laboratório de Imuno-histoquímica e Hibridação, pela orientação e ajuda na parte laboratorial deste trabalho. Aos professores Deílson Elgui de Oliveira e Carlos Eduardo Bacchi, pela grande oportunidade oferecida em compartilhar conhecimentos e principalmente pelo aprendizado gerado. Aos funcionários do Departamento de Patologia e do Hospital Universitário António Pedro, especialmente ao técnico de laboratório Antônio Carlos, por sempre atender aos meus pedidos com carinho e bom humor. Às funcionárias do arquivo de Patologia, por sempre atenderem às minhas solicitações com carinho e educação.

Ao Hospital Central do Exército e ao Laboratório O Aleph, pela contribuição de material para execução deste trabalho. Aos meus familiares e amigos, que me apoiaram, mesmo que indiretamente, nesses dois anos e na realização deste trabalho. A DEUS, pela vida e por permitir o conhecimento.

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 25 2. REVISÃO DE LITERATURA 31 2.1. LEUCOPLASIA 31 2.1.1. Classificação da leucoplasia 37 2.2. CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS 40 2.2.1. Classificação do carcinoma de células escamosas 44 2.3. FATORES PROGNÓSTICOS 48 2.3.1. APOPTOSE 48 2.3.1.1. Proteína p53 52 2.3.1.2. Proteína bcl-2 58 2.3.2. PROLIFERAÇÃO CELULAR 65 2.3.2.1. Proteína ki-67 68 3. OBJETIVOS 74 4. MATERIAL E MÉTODOS 77 4.1. AMOSTRA 78 4.1.1 Dados epidemiológicos 78 4.1.2 Divisão da amostra 79 4.1.3 Preparo da amostra 79 4.2. METODOLOGIA 80 4.2.1 Técnica da imuno-histoquímica 80 4.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS 85 4.3.1. Análise descritiva em HE 85 4.3.2 Análise descritiva da imuno-histoquímica 87 4.3.3 Análise quantitativa da imuno-histoquímica 89 4.3.4 Análise estatística 93 5. RESULTADOS 95 5.1 ANÁLISE DOS DADOS EPIDEMIOLÓGICOS 95 5.1.1 Carcinomas de células escamosas 96 5.1.2 Leucoplasias 98 5.1.3 Hiperplasias fibrosas inflamatórias 100 5.1.4 Análise comparativa dos dados epidemiológicos 102 5.2 ANÁLISE DESCRITIVA EM HE 105 5.2.1 Carcinomas de células escamosas 105 5.2.2 Leucoplasias 109 5.2.3 Hiperplasias fibrosas inflamatórias 109

5.3 ANÁLISE DESCRITIVA DA IMUNO-HISTOQUÍMICA 113 5.3.1 CARCINOMAS 113 5.3.1.1 P53 (DO-7) 113 5.3.1.2 P53 (PAb-240) 116 5.3.1.3 Ki-67 119 5.3.1.4 Bcl-2 122 5.3.2 LEUCOPLASIAS 125 5.3.2.1 P53 (DO-7) 125 5.3.2.2 P53 (PAb-240) 130 5.3.2.3 Ki-67 135 5.3.2.4 Bcl-2 140 5.3.3 HIPERPLASIAS 145 5.3.3.1 P53 (DO-7) 145 5.3.3.2 P53 (PAb-240) 148 5.3.3.3 Ki-67 151 5.3.3.4 Bcl-2 154 5.3.4 ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE AS LEUCOPLASIAS SEM E COM DISPLASIA EPITELIAL COM RELAÇÃO À LOCALIZAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DA IMUNOMARCAÇÃO 157 5.3.4.1 P53 (DO-7) 157 5.3.4.2 P53 (PAb-240) 158 5.3.4.3 Ki-67 159 5.3.4.4 Bcl-2 160 5.4 ANÁLISE QUANTITATIVA DA IMUNO-HISTOQUÍMICA 161 5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 162 5.5.1 ANÁLISE DOS MARCADORES ENTRE OS GRUPOS ESTUDADOS 162 5.5.1.1 Marcador p53 (DO-7) 162 5.5.1.2 Marcador p53 (PAb-240) 163 5.5.1.3 Marcador ki-67 163 5.5.1.4 Marcador Bcl-2 164 5.5.2 ANÁLISE DOS GRUPOS ESTUDADOS ENTRE OS MARCADORES P53 (DO-7) e P53 (PAb-240) 165 5.5.2.1 Carcinomas de células escamosas 165 5.5.2.2 Leucoplasias 165 5.5.2.3 Hiperplasias Fibrosas Inflamatórias 165

5.5.3 COMPARAÇÃO ENTRE LEUCOPLASIAS SEM E COM DISPLASIA EPITELIAL COM RELAÇÃO À LOCALIZAÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DA IMUNOMARCAÇÃO 166 5.5.4 COMPARAÇÃO ENTRE A ÁREA RELATIVA DE MARCAÇÃO NAS LEUCOPLASIAS SEM E COM DISPLASIA EPITELIAL COM IMUNOMARCAÇÃO LOCALIZADA NA REGIÃO SUPRABASAL 167 6. DISCUSSÃO 169 6.1 CONCEPÇÃO DO TRABALHO 169 6.2 AMOSTRA 172 6.3 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS 174 6.4 METODOLOGIA 176 6.4.1 POR QUE ESTES MARCADORES? 180 6.4.1.1 P53 180 6.4.1.2 Bcl-2 184 6.4.1.3 Ki-67 187 6.6 PERSPECTIVAS 190 7. CONCLUSÕES 193 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 196 9. ANEXOS 209

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Padronização de cores no programa Image Pro Plus 4.5 para: A, p53 (DO-7); B, p53 (PAb-240); C, Ki-67; D, Bcl-2 (400x). 91 FIGURA 2: Delimitação do epitélio lesional no programa Image Pro Plus 4.5. 91 FIGURA 3: Marcação, em vermelho, da área imunomarcada no programa Image Pro Plus 4.5. 92 FIGURA 4: Contagem da área correspondente ao epitélio delimitado no programa Image Pro Plus 4.5. 92 FIGURA 5: A: Carcinoma de células escamosas bem diferenciado B: Maior aumento revelando a formação de pérolas de ceratina nas ilhas tumorais (HE Aumento original: A, 100x; B, 400x). 106 FIGURA 6: A: Carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado B: Destacam-se as figuras de mitose (HE - Aumento original: A,100x; B, 400x). 107 FIGURA 7: A: Carcinoma de células escamosas pouco diferenciado B: Neste aumento nota-se a 108 presença de grande pleomorfismo celular (HE - Aumento original: A, 100x; B, 400x). FIGURA 8: A: Leucoplasia sem displasia epitelial B: Maior aumento revelando estratificação 110 epitelial normal (HE - Aumento original: A,100x; B, 400x). FIGURA 9: A: Leucoplasia com displasia epitelial B: Neste aumento nota-se a perda da estratificação, hipercromatismo nuclear e figuras de mitose (HE - Aumento original: A,100x; B, 111 400x). FIGURA 10: A: Hiperplasia fibrosa inflamatória B: Em maior aumento nota-se uma acantose 112 epitelial (HE - Aumento original: A,100x; B, 400x). FIGURA 11: Carcinoma de células escamosas A: Marcação para p53 (DO-7) com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões periférica e central (IHQ Aumento original A,100x; B, 400x). 115 FIGURA 12: Carcinoma de células escamosas A: Marcação para p53 (PAb-240) com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões periférica e central (IHQ Aumento original: A,100x; B, 118 400x). FIGURA 13: Carcinoma de células escamosas A: Marcação para ki-67 com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões periférica e central, (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 121 FIGURA 14: Carcinoma de células escamosas A: Marcação para bcl-2 com distribuição focal B: Imunomarcação na região periférica (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 124 FIGURA 15: Leucoplasia sem displasia epitelial A: Marcação para p53 (DO-7) com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 127 400x). FIGURA 16: Leucoplasia com displasia epitelial A: Marcação para p53 (DO-7) com distribuição focal B: Imunomarcação na região suprabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 129

FIGURA 17: Leucoplasia sem displasia epitelial A: Marcação para p53 (PAb-240) com distribuição focal B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 132 FIGURA 18: Leucoplasia com displasia epitelial A: Marcação para p53 (PAb-240) com distribuição difusa B: Imunomarcação na região suprabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 134 FIGURA 19: Leucoplasia sem displasia epitelial A: Marcação para ki-67 com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 137 FIGURA 20: Leucoplasia com displasia epitelial A: Marcação para ki-67 com distribuição difusa B: Imunomarcação na região suprabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 139 FIGURA 21: Leucoplasia sem displasia epitelial A: Marcação para bcl-2 com distribuição focal B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 142 FIGURA 22: Leucoplasia com displasia epitelial A: Marcação para bcl-2 com distribuição focal B: Imunomarcação na região suprabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 144 FIGURA 23: Hiperplasia fibrosa inflamatória A: Marcação para p53 (DO-7) com distribuição focal B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 147 FIGURA 24: Hiperplasia fibrosa inflamatória A: Marcação para p53 (PAb-240) com distribuição focal B: Imunomarcação na região suprabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 150 FIGURA 25: Hiperplasia fibrosa inflamatória A: Marcação para ki-67 com distribuição difusa B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original: A,100x; B, 400x). 153 FIGURA 26: Hiperplasia fibrosa inflamatória A: Marcação para bcl-2 com distribuição focal B: Imunomarcação nas regiões basal e parabasal (IHQ Aumento original A,100x; B, 400x). 156

LISTA DE TABELAS TABELA 1: Anticorpos utilizados no trabalho e suas especificações. 80 TABELA 2: Diluições dos anticorpos utilizados no trabalho. 83 TABELA 3: Tempo de revelação com DAB para cada anticorpo utilizado no trabalho. 84 TABELA 4: Percentual dos sexos no grupo dos carcinomas. 96 TABELA 5: Percentual das raças no grupo dos carcinomas. 96 TABELA 6: Percentual das localizações no grupo dos carcinomas. 97 TABELA 7: Percentual dos sexos no grupo das leucoplasias. 98 TABELA 8: Percentual das raças no grupo das leucoplasias. 98 TABELA 9: Percentual das localizações no grupo das leucoplasias 99 TABELA 10: Percentual dos sexos no grupo das hiperplasias. 100 TABELA 11: Percentual das raças no grupo das hiperplasias. 100 TABELA 12: Percentual das localizações no grupo das hiperplasias. 101 TABELA 13: Resultado referente ao grau de diferenciação dos carcinomas. 105 TABELA 14: Resultado referente à presença de displasia epitelial nas leucoplasias. 109 TABELA 15: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nos carcinomas. TABELA 16: Distribuição das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nos carcinomas. TABELA 17: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nos carcinomas. 113 114 116 TABELA 18: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nos carcinomas. 116 TABELA 19: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-ki-67 nos carcinomas. 119 TABELA 20: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-ki-67 nos carcinomas. 119 TABELA 21: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-bcl-2 nos carcinomas. 122 TABELA 22: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-bcl-2 nos carcinomas. 122

TABELA 23: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 125 TABELA 24: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 125 TABELA 25: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 130 TABELA 26: Distribuição das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 130 TABELA 27: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-ki-67 nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 135 TABELA 28: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-ki-67 nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 135 TABELA 29: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-bcl-2 nos casos de leucoplasias sem e com displasia epitelial. 140 TABELA 30: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-bcl-2 nas leucoplasias sem e com displasia epitelial. 140 TABELA 31: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nas hiperplasias. 145 TABELA 32: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-p53 (DO-7) nas hiperplasias. 145 TABELA 33: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nas hiperplasias. 148 TABELA 34: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-p53 (PAb-240) nas hiperplasias. 148 TABELA 35: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-ki-67 nas hiperplasias. 151 TABELA 36: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-ki-67 nas hiperplasias. 151 TABELA 37: Localização das marcações positivas para o anticorpo anti-bcl-2 nas hiperplasias. 154 TABELA 38: Distribuição da positividade para o anticorpo anti-bcl-2 nas hiperplasias. 154

LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1: Distribuição da idade dos pacientes com carcinoma de células escamosas bucal (n=15). 97 GRÁFICO 2: Distribuição da idade dos pacientes com leucoplasia bucal (n=16). 99 GRÁFICO 3: Distribuição da idade dos pacientes com hiperplasia fibrosa inflamatória 101 bucal (n=19). GRÁFICO 4: Percentual do total de casos (n=56) segundo o sexo para os três grupos 102 estudados. GRÁFICO 5: Percentual do total de casos (n=43) segundo a raça nos diferentes grupos 103 estudados. GRÁFICO 6: Percentual do total de casos (n=56) segundo a localização nos diferentes 104 grupos estudados. GRÁFICO 7: Percentual do total de casos (n=20) dos carcinomas apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (DO-7). 114 GRÁFICO 8: Percentual do total de casos (n=20) dos carcinomas apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (PAb-240). 117 GRÁFICO 9: Percentual do total de casos (n=20) dos carcinomas apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-ki-67. 120 GRÁFICO 10: Percentual do total de casos (n=20) dos carcinomas apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-bcl-2. 123 GRÁFICO 11: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias sem displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (DO-7). 126 GRÁFICO 12: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias com displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (DO-7). 128 GRÁFICO 13: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias sem displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (PAb-240). 131 GRÁFICO 14: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias com displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (PAb-240). 133 GRÁFICO 15: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias sem displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-ki-67. 136 GRÁFICO 16: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias com displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-ki-67. 138 GRÁFICO 17: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias sem displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-bcl-2. 141 GRÁFICO 18: Percentual do total de casos (n=10) das leucoplasias com displasia apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-bcl-2. 143 GRÁFICO 19: Percentual do total de casos (n=20) das hiperplasias apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (DO-7). 146

GRÁFICO 20: Percentual do total de casos (n=20) das hiperplasias apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-p53 (PAb-240). 149 GRÁFICO 21: Percentual do total de casos (n=20) das hiperplasias apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-ki-67. 152 GRÁFICO 22: Percentual do total de casos (n=20) das hiperplasias apresentados em relação à distribuição e localização do anticorpo anti-bcl-2. 155 GRÁFICO 23: Comparação do percentual dos casos (n=20) das leucoplasias sem e com displasia epitelial apresentados em relação à localização e distribuição do anticorpo antip53 (DO-7). 157 GRÁFICO 24: Comparação do percentual dos casos (n=20) das leucoplasias sem e com displasia epitelial apresentados em relação à localização e distribuição do anticorpo antip53 (PAb-240). 158 GRÁFICO 25: Comparação do percentual dos casos (n=20) das leucoplasias sem e com displasia epitelial apresentados em relação à localização e distribuição do anticorpo antiki-67. 159 GRÁFICO 26: Comparação do percentual dos casos (n=20) das leucoplasias sem e com displasia epitelial apresentados em relação à localização e distribuição do anticorpo antibcl-2. 160 GRÁFICO 27: Comparação do percentual médio das áreas relativas para os anticorpos anti-p53 (DO-7), anti-p53 (PAb-240), anti-ki-67 e anti-bcl-2 entre os três grupos estudados 161 (n=60).

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1. µm: micrometro 2. AIDS: acquired immunodeficiency syndrome 3. AIF: fator indutor de apoptose 4. ATP: adenosinatrifosfato 5. bcl-2: B-cell lymphoma/leukemia 2 6. bcl-x: bcl-2 homologous x 7. bcl-xl: bcl-2 homologous x long 8. bcl-xs: bcl-2 homologous x short 9. CCE- carcinoma de células escamosas 10. CIN: cervical intraepithelial neoplasia 11. DAB: dimethylaminoazobenzene 12. DNA: deoxyribonucleic acid 13. EBV: Epstein Barr virus 14. Fas: membro da família dos receptores de TNF 15. G1 : gap 1 16. HE: hematoxilina e eosina 17. HIV: human immunodeficiency virus 18. HOIN: high grade OIN 19. HPV: human papilloma virus 20. IA: índice de apoptose 21. kda: quilodalton 22. Ki-67: Kiel 67 23. LMP-1: latent membran protein 24. LOIN: low grade OIN

25. LSAB: labelled streptavidin biotin 26. MDM 2: murine double minute 2 27. MN: mononuclear 28. PCR: polymerase chain reaction 29. PMN: polimorfonuclear 30. OIN: oral intraepithelial neoplasia 31. OMS: Organização Mundial de Saúde 32. p53: protein 53kDa 33. PCNA: proliferating cell nuclear antigen 34. S: synthesis (phase) 35. ssdna: single strand DNA 36. TBS: Tris buffer saline 37. TNF: tumor necrosis factor 38. TNM: sistema de estadiamento clínico dos carcinomas de células escamosas 39. TRIS: hidroxi-metil-aminometano 40. TUNEL: TdT dutp - biotin Nick End Labeling 41. WHO: World Health Organization

RESUMO A leucoplasia apresenta-se como a lesão cancerizável mais comum da mucosa bucal, entretanto, suas características clínicas e histopatológicas não são específicas. A associação dos parâmetros clínicos e morfológicos com a análise de marcadores imuno-histoquímicos expressos na indução ou inibição da proliferação celular e da apoptose vem sendo estudados no intuito de elucidar o processo da carcinogênese bucal. O presente trabalho teve por objetivo avaliar através da técnica de imuno-histoquímica, a expressão das proteínas p53, Bcl-2 e Ki-67 em 20 blocos parafinados de hiperplasias fibrosas inflamatórias, 20 de leucoplasias, sendo dez com displasia epitelial e 20 de carcinomas de células escamosas bucais. Realizou-se uma análise descritiva dos resultados obtidos em HE e na imunohistoquímica e, com o auxílio do programa Image Pro Plus, uma análise quantitativa da imunomarcação. Os dados dos estudos imuno-histoquímicos foram avaliados estatisticamente. Os resultados mostraram que a expressão da proteína p53, detectada pelo clone DO-7, foi mais encontrada no grupo das leucoplasias, a maioria apresentando localização na região suprabasal e distribuição focal. O grupo dos carcinomas apresentou-se maior positividade para os anticorpos anti-p53 (PAb-240) e anti-ki-67, com predomínio das marcações nas regiões periférica e central e com distribuição difusa. Maior imunopositividade para o anticorpo anti-bcl-2 foi observada no grupo das hiperplasias, com predomínio pela localização basal e parabasal com distribuição focal. A diferença das áreas positivas entre os marcadores p53, clone DO-7 e p53, clone PAb-240 foi significativa nas leucoplasias e nas hiperplasias, entretanto não se observou diferença estatisticamente significativa nos carcinomas. A marcação das proteínas estudadas foi observada mais comumente na região suprabasal nas leucoplasias com displasia epitelial mas também foi identificada em

leucoplasias sem displasia epitelial. As leucoplasias e os carcinomas apresentaramse estatisticamente semelhantes quanto às áreas relativas dos marcadores p53 clones DO-7 e PAb-240 e do marcador bcl-2. A expressão das proteínas avaliadas neste estudo sugere que o desequilíbrio na regulação da apoptose e da proliferação celular ocorre numa fase inicial do desenvolvimento das lesões cancerizáveis, inclusive nas lesões onde morfologicamente não é possível detectar ainda nenhuma alteração. Estes dados reforçam a importância do estudo de imunomarcadores envolvidos na carcinogênese bucal para avaliação do prognóstico de lesões cancerizáveis e malignas e consequentemente a indicação de procedimentos terapêuticos e preventivos mais eficazes.

ABSTRACT Leukoplakia is the most common oral premalignancy; however, their clinical and pathological characteristics are not specific. The association of the clinical and morphologic parameters with the analysis of immunohistochemical markers expressed in the induction or inhibition of the cellular proliferation and apoptosis are being studied to elucidating the process of oral carcinogenesis. The aim of this work was to evaluate, immunohistochemically the expression of the p53, bcl-2 and ki-67 proteins in 20 paraffin embedded oral tissues of inflammatory fibrous hiperplasias, 20 of leukoplakias, being ten with epithelial dysplasia and 20 of oral squamous cells carcinoma. A descriptive analysis of the results obtained in HE and immunohistochemically was done and, with the aid of the program Image Pro Plus, a quantitative analysis of the demarcations. The data of the immunohistochemical studies were appraised estatistically. The results showed that the expression of the p53 protein (DO-7) was more common in the group of the leukoplakias, most in the suprabasal region and with focal distribution. The group of the carcinomas was more expressive for the antibodies anti-p53 (PAb-240) and anti-ki-67, with prevalence of the demarcations in the outlying and central areas and with diffuse distribution. Larger immunopositivity for the bcl-2 protein was observed in the group of hyperplasias, with prevalence for the basal and parabasal region with focal distribution. The difference of the positive areas among the markers p53 (DO-7) and p53 (PAb-240) was significant in the leukoplakias and in the hyperplasias; however, there was no difference statistically significant observed in the carcinomas. The demarcation of the studied proteins was observed more commonly in the suprabasal region in the leukoplakias with epithelial dysplasia but it was also found in leukoplakias without epithelial dysplasia. Leukoplakias and carcinomas were similar

statistically as for the relative areas of the markers p53 clones DO-7 and PAb-240 and Bcl-2. The expression detected in this study for these markers in all the lesions suggests that the loss of the regulation of apoptosis and the cellular proliferation occurs in an initial phase of the development of the premalignant lesions including those where it is not possible to detect any alteration morphologically. These data reinforce the importance of the immunomarkers study involved in oral carcinogenesis for evaluation of the prognostic of premalignant and malignant lesions and the indication of more efficient therapeutical and preventive procedures.

1. INTRODUÇÃO

Introdução 25 1. INTRODUÇÃO O mecanismo de transição da mucosa normal para o carcinoma de células escamosas apresenta-se como um processo complexo, de etiologia multifatorial e constituído por várias etapas. Em cada uma das etapas, ocorrem alterações genéticas em células susceptíveis, as quais acabam adquirindo crescimento seletivo e expansão clonal. Nesta fase de transição do padrão de normalidade para o desenvolvimento do carcinoma podem aparecer lesões intermediárias denominadas cancerizáveis ou pré-malignas. Segundo a classificação da Organização Mundial de Saúde, (WHO - World Health Organization), as leucoplasias são consideradas lesões clinicamente cancerizáveis da mucosa bucal. Estas lesões apresentam a capacidade de se transformar em carcinomas de células escamosas,

Introdução 26 especialmente quando apresentam alterações histopatológicas de displasia epitelial; portanto podem representar uma das etapas no processo da carcinogênese bucal (PINDBORG et al., 1997). Estudos recentes demonstraram algumas mudanças moleculares freqüentemente encontradas no câncer bucal e nas lesões cancerizáveis. Essas lesões resultam de um aumento da população celular conseqüente a uma proliferação celular exacerbada e/ou a uma morte celular diminuída (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; OLIVEIRA, 2000). A proliferação celular desempenha papel importante em todas as etapas da carcinogênese, pois as células submetidas a estímulos contínuos de proliferação são mais susceptíveis à persistência de lesões do DNA e aparecimento de novas mutações resultando em células transformadas (OLIVEIRA, 2000). Mudanças na capacidade proliferativa de lesões cancerizáveis bucais podem indicar, precocemente, risco de transformação maligna. Trabalhos prévios com ênfase na capacidade proliferativa do epitélio bucal normal e de leucoplasias sugeriram que desordens na proliferação em conseqüência da exposição a carcinógenos podem ser detectadas mais precocemente na imuno-histoquímica que as alterações morfológicas como hiperplasias ou displasias epiteliais. O aumento do índice de proliferação, apesar de não específico, pode ser um marcador precoce do crescimento desordenado (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000). Estudos imuno-histoquímicos para avaliar a

Introdução 27 proliferação celular utilizam marcadores como o PCNA, o antígeno de proliferação celular Ki-67 e a ciclina D1 (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000). A avaliação da proliferação celular remonta o início dos estudos das neoplasias ao nível celular. Por outro lado, só recentemente a morte celular, notadamente a apoptose, tem recebido maior atenção (LOWE & LIN, 2000). Na morte por apoptose, a célula parece iniciar sua própria destruição, através da ativação de proteases endógenas comandadas por um programa genético. Este fenômeno não induz resposta inflamatória em contraste com a necrose, não provoca efeitos deletérios para o organismo. (KERR et al., 1972; CARSON & RIBEIRO, 1993; THOMPSON, 1995). O gene TBcl-2 pode atuar como um oncogene por prolongar a vida útil da célula, prevenindo a apoptose enquanto o gene supressor de tumor, o TP53, encontra-se implicado na interrupção do ciclo celular e na apoptose mediante danos ao DNA, sendo um regulador negativo do TBcl-2 (GESKE & GERSCHENSON, 2001). Translocação do TBcl-2 da posição 18q21 para 14q32 resulta na superexpressão de suas proteínas (REED, 1994; LORO et al., 2003). A presença de altos níveis da proteína bcl-2, aumentando a sobrevida da célula pode facilitar a aquisição de mutações em outros genes supressores tumorais e oncogenes resultando numa expansão clonal atípica (KANNAN, et al., 1998).

Introdução 28 O TP53 apresenta-se como o gene mais comumente mutado nos carcinomas de células escamosas da cabeça e pescoço. A mutação do TP53 ocorre mais freqüentemente em tumores mais agressivos e está relacionado à pior sobrevida (CULOTTA & KOSHLAND, 1993; LORO, et al., 2003). A detecção das proteínas p53, bcl-2 e ki-67 em tecidos bucais normais restringe-se à camada basal, compartimento proliferativo do epitélio. Em outros compartimentos do epitélio, onde as células perderam a capacidade de se dividir, essa marcação não é esperada. A expressão dessas proteínas nas células suprabasais sugere alteração dos genes correspondentes e pode ser encontrada em lesões cancerizáveis, principalmente quando apresentam alterações displásicas epiteliais à análise microscópica (LIU & KLEIN-SZANTO, 2000; TANDA et al., 2000, CRUZ et al., 2002). A avaliação de proteínas e marcadores expressos na indução ou inibição da proliferação celular e da apoptose em lesões cancerizáveis e em carcinomas de células escamosas bucais pode contribuir no entendimento da etiopatogenia do câncer bucal, bem como ser importante fator prognóstico na carcinogênese bucal. Pelo exposto, justifica-se investigar a expressão das proteínas p53, bcl-2 e a expressão do marcador de proliferação celular ki-67 em lesões hiperplásicas, lesões cancerizáveis, como as leucoplasias, e em carcinomas de células escamosas bucais.

Introdução 29 HIPÓTESES 1. Uma maior positividade do marcador de proliferação celular Ki-67 e das proteínas p53 e bcl-2 está relacionado há uma maior agressividade da lesão. 2. A imunopositividade para os anticorpos anti-ki-67, anti-p53 e anti-bcl- 2 pode ser também observada em leucoplasias sem displasia epitelial, pois alterações moleculares precedem as alterações morfológicas na carcinogênese bucal. 3. Marcação das proteínas p53, ki-67 e bcl-2 na região suprabasal de lesões cancerizáveis sugere mutação dos genes correspondentes.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura 31 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 LEUCOPLASIA O termo leucoplasia, criado por SCHWIMMER em 1877, se origina do Grego onde leucos significa branco e plakos, bloco (SPRAGUE, 1963). A Organização Mundial de Saúde (OMS) define a leucoplasia como uma lesão predominantemente branca que não pode ser caracterizada como qualquer outra lesão (PINDBORG et al., 1997). O diagnóstico da leucoplasia é clinico e deve ser feito após a eliminação de outras lesões que se apresentam como placa branca, por exemplo, o líquen plano, a ceratose friccional, o leucoedema, a estomatite nicotínica e a candidíase pseudomembranosa. A candidíase hiperplásica não pode ser distinguida clinicamente da leucoplasia, só podendo ser eliminada após terapia

Revisão de Literatura 32 antifúngica ou após biópsia (VAN DER WAAL et al., 1997). Quando presente no lábio, o diagnóstico diferencial deve ser feito com a queilite actínica, somente sendo confirmado a partir do exame histopatológico, que nesta última apresenta elastose na lâmina própria e submucosa. A leucoplasia apresenta-se como a lesão cancerizável mais comum na cavidade oral, representando 85% destas lesões. Predominantemente acomete homens (70%), brancos, com mais de 40 anos (PETTI, 2003). A frequência anual de transformação maligna da leucoplasia varia de acordo com a região geográfica analisada provavelmente sendo resultado de hábitos culturais como a dieta e o uso do tabaco (VAN DER WAAL et al., 1997). Entretanto, alguns autores sugerem um potencial médio de transformação maligna de 1 a 6,3% (WALDRON & SHAFER, 1975; NEVILLE et al., 1998; SAITO et al., 2001). O vício de fumar tabaco parece ser o fator etiológico mais comumente relacionado ao aparecimento de leucoplasias, mais de 80% dos casos acometem pacientes fumantes. Apesar do uso de álcool freqüentemente estar associado à etiopatogenia do câncer bucal, não apresenta relação com o aparecimento da leucoplasia (NEVILLE & DAY, 2002). Clinicamente, as leucoplasias são classificadas em homogêneas e nãohomogêneas. Leucoplasias homogêneas são lesões planas com superfície lisa, corrugada, pregueada ou estriada e responsável por 90% dos casos de leucoplasia bucal. Maior risco de transformação maligna é observado no tipo não homogêneo que se apresenta como uma lesão branca ou branco-

Revisão de Literatura 33 avermelhada (Leucoplasia Mosqueada), de superfície irregular, nodular ou verrucosa (PINDBORG et al., 1997, VAN DER WALL et al., 1997). As leucoplasias de aspecto verrucoso são consideradas entidades distintas por apresentarem projeções superficiais observadas tanto clinicamente quanto histopatologicamente. Tais lesões frequentemente recidivam, resultam em lesões múltiplas ou se transformam em carcinoma verrucoso ou carcinoma de células escamosas, sendo nesses casos chamadas de leucoplasias verrucosas proliferativas (BATSAKIS et al., 1999; VAN DER WAAL & AXELL, 2002). SILVERMAN & GORSKY, em 1997, analisaram 54 pacientes com leucoplasia verrucosa proliferativa e observaram um índice de transformação maligna de 70,3% num período de um a 27 anos de proservação. (SILVERMAN & GORSKY, 1997) Aproximadamente 70% das leucoplasias são encontradas no vermelhão do lábio, mucosas jugal e gengiva. As lesões leucoplásicas localizadas em língua, assoalho bucal e vermelhão labial frequentemente apresentam alterações displásicas ou malignas (WALDRON & SHAFER, 1975; NEVILLE & DAY, 2002).

Revisão de Literatura 34 A remoção de fatores de risco como o álcool e o tabaco associados à terapia tópica com antifúngico e antiinflamatório é usualmente o tratamento inicial para as lesões sugestivas de leucoplasias (TRADATI et al., 1997). Alguns casos de leucoplasia regridem após a retirada desses fatores. A avaliação da regressão parcial ou total da lesão deve ser feita baseada na diminuição do tamanho da lesão e não na diminuição da intensidade da coloração ou da textura da lesão (VAN DER WAAL & AXELL, 2002). Após duas a quatro semanas, nas lesões persistentes, biópsia com análise histopatológica deve ser feita para excluir com precisão outras lesões brancas e definir, quando presente, o grau de displasia epitelial (VAN DER WAAL et al., 1997). A leucoplasia é um diagnóstico clínico, não apresenta características histopatológicas específicas, entretanto pode-se observar microscopicamente aumento da camada de ceratina da superfície do epitélio (hiperceratose) e/ou aumento da camada espinhosa (acantose). A camada de ceratina pode consistir de ortoceratose, paraceratose ou ambos. Células inflamatórias crônicas podem ser notadas no conjuntivo subjacente. Displasia epitelial está presente em 5 a 25% das leucoplasias bucais. As alterações displásicas das células epiteliais são semelhantes àquelas do carcinoma de células escamosas e incluem: núcleos e células maiores e pleomórficos, nucléolos grandes e proeminentes, aumento da razão núcleo/citoplasma, núcleos hipercromáticos, disceratose, aumento do número de mitoses e mitoses atípicas (SHAFER & HINE, 1987; REGEZI & SCIUBA, 1991; PINDBORG et al., 1997; NEVILLE & DAY, 2002).

Revisão de Literatura 35 WALDRON & SHAFER, em 1975, analisaram 3256 biópsias de lesões diagnosticadas clinicamente como leucoplasia bucal. Observaram que microscopicamente 80,1% dessas lesões apresentavam hiperceratose e acantose sem evidências de displasia epitelial. Displasia epitelial leve à moderada foi encontrada em 12,2% das lesões, displasia epitelial severa ou carcinoma in situ em 4,5% e carcinoma de células escamosas foi diagnosticado em 3,1% dos casos. REID et al., 2000, analisaram entre os anos de 1976 a 1995, 3160 carcinomas in situ da região de cabeça e pescoço sendo 326 localizados no lábio, 1073 na mucosa bucal, 199 na faringe e 1562 na laringe. As características do carcinoma in situ e do carcinoma invasivo foram muito semelhantes com relação à idade, sexo e raça dos pacientes e localização da lesão. Entretanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos é maior nos casos in situ. Aumento no diagnóstico de lesões de carcinoma in situ pode resultar numa diminuição de lesões invasivas pois o tratamento para as lesões in situ é eficaz e quando não tratadas, uma grande proporção se transforma em carcinoma invasivo apesar da ausência de sinais nítidos da transição. A excisão cirúrgica total da lesão apresenta-se como o tratamento mais adequado para as leucoplasias pois permite uma avaliação de todo o tecido alterado, então, um diagnóstico mais fidedigno (EPHROS, 1997; TRADATI et al., 1997).

Revisão de Literatura 36 Recorrências após a excisão cirúrgica da lesão são incomuns (VAN DER WAAL & AXELL, 2002). SAITO et al., em 2001 acompanharam 142 pacientes com leucoplasia bucal por em média quatro anos. Análise histopatológica da biópsia inicial revelou sete casos com displasia epitelial severa, 36 com displasia moderada, 48 com displasia leve e 51 sem displasia epitelial. Excisão cirúrgica total foi feita em 75 lesões, criocirurgia em 16 e os outros 51 pacientes foram acompanhados sem receberem tratamento cirúrgico. Observaram que nove pacientes (6,3%) apresentaram transformação maligna sendo o grupo das lesões tratadas pela criocirurgia o mais afetado (4/16) seguido do grupo sem tratamento cirúrgico (4/51) e apenas 1/75 das lesões excisionadas cirurgicamente. Ressaltaram ainda que não há relação entre o grau de displasia epitelial e o risco de transformação maligna pois dos casos com displasia epitelial severa, nenhum evoluiu para o carcinoma de células escamosas e 2/51 leucoplasias sem displasia epitelial apresentaram transformação maligna. Concluíram que todos os pacientes com leucoplasia devem ser acompanhados regularmente independente do grau de displasia epitelial e a excisão cirúrgica total pode reduzir o risco de evolução para o câncer.

Revisão de Literatura 37 2.1.1 CLASSIFICAÇÃO DA LEUCOPLASIA A definição da leucoplasia até os dias atuais implica em um diagnóstico de exclusão e não em uma entidade já que suas características clínicas histopatológicas não são específicas. Muitos estudos tentam, por sua vez, estudá-la propondo classificações. SPRAGUE, em 1963, propôs uma classificação histopatológica das leucoplasias separando-as em 4 categorias: ceratose difusa ou localizada, disceratose com atipias (mínima, moderada ou severa), carcinoma in situ e carcinoma de células escamosas. Avaliou, ainda a utilização clínica e/ou histopatológica do termo leucoplasia através de questionários respondidos por 43 especialistas em patologia oral. Destes, 36% utilizavam o termo leucoplasia apenas como diagnóstico clínico, 17% como diagnóstico clínico e histopatológico e 40% apenas como diagnóstico histopatológico. SCHEPMAN & VAN DER WAAL, em 1995, realizaram um sistema de estadiamento para leucoplasias bucais com a finalidade de melhor classificálas e distinguí-las, facilitando o seu tratamento. Como parâmetros foram utilizados: tamanho, localização intraoral, aspecto clínico homogêneo e não homogêneo e presença ou não de displasia epitelial. O tamanho foi dividido em três categorias (<2cm; de 2-4cm; > 4cm), sendo análogo à classificação TNM de câncer bucal. A localização, região da mucosa oral acometida, foi catalogada em sítios de alto e baixo risco. VAN DER WAAL, et al., em 2000, verificaram que havia alguns equívocos nesta proposta. Questionou-se a divisão em sítios de alto e baixo risco, já que isto depende dos vícios do

Revisão de Literatura 38 paciente. A classificação clínica também se tornou redundante, pois os casos não-homogêneos geralmente são os que apresentam displasia epitelial, observada em exames histopatológicos. Tal classificação foi então simplificada e apenas o tamanho da lesão e a presença de displasia epitelial foram considerados importantes parâmetros para serem analisados. As leucoplasias de aspecto verrucoso foram excluídas dessa classificação, tornando necessário futuramente um estadiamento próprio. Na tentativa de dar mais fidelidade ao diagnóstico da leucoplasia, VAN DER WAAL & AXELL, em 2002, propuseram, um grau de certeza C, onde C1 representa o diagnóstico clínico provisório; C2, diagnóstico clínico definitivo após eliminação de fatores suspeitos; C3, após biópsia dos casos de C2, e exclusão histopatológica das demais lesões brancas e C4, após remoção total da lesão e confirmação do diagnóstico. SCHEPMAN et al., em 1998, analisaram 166 pacientes com leucoplasia bucal por no mínimo seis meses. Como tratamento inicial, excisão total da lesão foi realizada em 37 casos, laser em cinco casos, criocirurgia também em cinco casos, aplicação de retinóides em um caso e os 118 restantes foram apenas acompanhados. Revelaram uma média de transformação maligna de 2,9% por ano. Parâmetros associados ao maior risco de transformação maligna das leucoplasias, foram: sexo feminino, paciente não-fumante, aspecto clínico não-homogêneo, displasia epitelial moderada e severa. Ressaltaram que, a localização da lesão, o uso do álcool e tratamento realizado, ativo ou só

Revisão de Literatura 39 acompanhamento, não tiveram relação com um maior risco de transformação maligna. De acordo com a OMS, o grau de displasia epitelial é subdividido em: leve, moderado e severo. Todavia, tal estadiamento mostra-se subjetivo e não propicia um diagnóstico exato. RICHART, em 1967 sugeriu uma classificação para as lesões cancerizáveis bucais baseada no modelo ginecológico, denominado CIN (neoplasia intraepitelial do cérvix-uterino) e propôs a OIN para mucosa bucal. Nessa classificação, as leucoplasias foram divididas em: lesões de risco (lesões sem displasia epitelial), e lesões precursoras do carcinoma de células escamosas bucal (lesões com displasia epitelial). O grau de displasia epitelial foi avaliado segundo uma análise da espessura do epitélio acometido por alterações displásicas e classificado em OIN I, II e III (apud KUFFER & LOMBARDI, 2002). KUFFER & LOMBARDI, em 2002, modificaram tal classificação graduando a displasia epitelial em LOIN, neoplasia intraepitelial oral de baixo grau e HOIN, neoplasia intraepitelial oral de alto grau. A LOIN corresponderia à displasia epitelial leve e a HOIN, a displasia epitelial moderada, severa ou carcinoma in situ. A presença da displasia epitelial nem sempre indica transformação maligna enquanto a ausência não exclui essa possibilidade (CRUZ et al., 1998). Estudos moleculares de lesões precursoras, podem demonstrar alterações que predizem transformação maligna independentemente da presença de alterações morfológicas.

Revisão de Literatura 40 2.2 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS O câncer de boca representa cerca de 3% de todas as neoplasias malignas nos homens e 2% nas mulheres, segundo a Sociedade Americana de Câncer, em 2002 (NEVILLE & DAY, 2002). A estimativa da incidência do câncer de boca para o ano de 2005, segundo o Instituto Nacional do Câncer, mostra-se maior nas regiões sul e sudeste. No estado do Rio de Janeiro, a estimativa de casos novos pode alcançar a taxa de 20,56/100.000 para os homens e 7,37/100.000 para as mulheres (INCA). O carcinoma de células escamosas apresenta-se como o tipo histológico mais comum, chegando a cerca de 90% das neoplasias malignas na mucosa bucal (NEVILLE & DAY, 2002). Em muitos estudos epidemiológicos verifica-se maior incidência do carcinoma de células escamosas bucal em adultos, acima de 40 anos de idade, do sexo masculino, no entanto a proporção entre homem e mulher vem se tornando semelhante, provavelmente pelo aumento da exposição a agentes carcinógenos no sexo feminino (NOVELLINO, 1998; MELO, 1999; SALIM, 2001; CARVALHO, 2002; NEVILLE & DAY, 2002). Não há um agente ou um fator causador isolado claramente definido, tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos podem estar em atividade, caracterizando-se de etiologia multifatorial. Dentre os principais fatores extrínsecos o tabaco apresenta-se como a maior causa isolada, o risco aumenta significantemente de acordo com o número de cigarros fumados por

Revisão de Literatura 41 dia e a duração do hábito (LA VECHIA et al., 1997; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). O consumo do álcool também parece contribuir para o risco de desenvolvimento do câncer de boca. A identificação do álcool como fator carcinogênico isolado tem sido difícil devido à associação constante do fumo com a bebida na maioria dos portadores de câncer de boca (REGEZI & SCIUBBA, 1991). Alguns mecanismos foram sugeridos para explicar o papel do álcool no desenvolvimento do câncer bucal, entre eles a ação como solvente facilitando a passagem do carcinógeno através da membrana celular e alteração do metabolismo das células epiteliais. O consumo do etanol pode, ainda, acentuar o metabolismo do fígado, ativando substâncias carcinogênicas (LA VECCHIA et al., 1997). A associação do tabaco com o álcool multiplica o risco de desenvolvimento do câncer bucal (LA VECCHIA et al., 1997; NEVILLE & DAY, 2002). A ação de microorganismos virais tem papel importante entre os carcinógenos. O vírus Epstein-Barr (EBV) tem sido relacionado com o linfoma de Burkitt e com o carcinoma nasofaríngeo e vem sendo estudado em carcinomas de células escamosas bucais enquanto o vírus papiloma humano (HPV), reconhecido como importante causa de câncer no trato ano-genital, encontra-se envolvido também na etiologia de cânceres da cavidade oral e faringe (LA VECCHIA et al., 1997; GONZALES-MOLES et al., 2000). Alguns tipos de HPV, principalmente o HPV 16 pode ser detectado em uma proporção significativa de casos de carcinoma de células escamosas na cabeça e pescoço e estão comumente associados a presença do gene p53 selvagem (GASCO & CROOK, 2003). Os subtipos 16, 18, 31, 33 são os que mais

Revisão de Literatura 42 freqüentemente se associam às displasias epiteliais e ao carcinoma de células escamosas bucais (NEVILLE et al., 1998). SALIM, em 2001 investigou a associação do vírus Epstein-Barr com o carcinoma de células escamosas de língua e laringe e em mucosas bucais normais através da identificação imuno-histoquímica, da proteína latente de membrana (LMP-1) do vírus. Dos 47 casos de carcinoma de células escamosas, 78,8% apresentaram imuno-positividade para a LMP-1 do EBV enquanto das 13 mucosas bucais normais, 54% foram positivas. Os fatores intrínsecos incluem a herança genética, idade, sexo e os estados gerais como a imunossupressão, deficiências vitamínicas, desnutrição e anemias ferroprivas. Na população imunocomprometida pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e naquela sob terapia imunossupressiva para o câncer ou transplante de órgãos há um aumento no risco para o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas bucal (NEVILLE et al., 1998). O aumento do consumo de frutas e vegetais, particularmente cenoura, tomate e pimenta verde, está associado a uma redução do risco de câncer bucal e faríngeo. Dieta deficiente ou desequilibrada pode contribuir com aproximadamente 15% desses tipos de câncer (LA VECCHIA et al., 1997).

Revisão de Literatura 43 O câncer bucal pode ser dividido em três categorias: carcinoma da cavidade oral propriamente dita, carcinoma de lábio e carcinoma de orofaringe (NEVILLE & DAY, 2002). O carcinoma da mucosa bucal propriamente dita clinicamente pode apresentar-se de várias formas: lesão exofítica, endofítica, eritroplásica, leucoplásica e leuco-eritroplásica (NEVILLE & DAY, 2002). A forma clínica mais freqüente manifesta-se como uma lesão ulcerada, de bordas elevadas e endurecidas, com fundo necrótico e granuloso que não cicatriza em um período de duas semanas. Pode haver destruição do osso subjacente por contigüidade da lesão em mucosa e quando presente pode mostrar imagem radiográfica de radiotransparência com margens mal definidas e aspecto semelhante a osteomielite (NEVILLE et al., 1998). A localização mais comum é a língua, sendo mais atingida as porções látero-posterior e ventral (CARVALHO, 2002). O carcinoma de língua corresponde a 50% dos carcinomas da mucosa bucal propriamente dita e sua incidência em pacientes jovens, com menos de 40 anos, aumentou no período de 1973-1997 nos Estados Unidos provavelmente pelo consumo de maconha, cuspo de tabaco ou infecção pelo HPV (NEVILLE et al., 1998; SCHANTZ & YU, 2002).