Enzimas Alostéricas e com Múltiplos ítios Ativos A presença do substrato em um dos sítios influencia: - a ligação do substrato aos demais sítios vazios - a taxa de formação de produto nos sítios ocupados O próprio substrato atua como um modificador ou um efetor Ativação (incluindo respostas sigmoidais de v verus []) ou nibição
ítios não-cooperativos E E E E E E E E v V MAX = 1 [] [] [] [] V = MAX [E] t - constante de dissociação intrínseca
Constante de dissociação intrínseca constante de um sítio isolado, ou seja, a constante cinética de um sítio desconsiderando sua associação com os demais sítios da mesma molécula enzimática descreve o equilíbrio entre o substrato livre, o sítio ativo livre e o complexo sítio-substrato Constante de dissociação efetiva descreve o equilíbrio entre o substrato livre, enzima disponível e o complexo enzima-substrato
Ligações cooperativas e a ligação de uma molécula de substrato induz a mudanças estruturais ou eletrônicas que resultam em alterações nas afinidades dos sítios vazios a curva de velocidade não seguirá mais o modelo cinético de Henri-Michaelis-Menten Enzima Alostérica (curvas de velocidade sigmoidais)
Aumento das afinidades dos sítios vazios de ligação: ligação cooperativa ou cooperatividade positiva com respeito a ligação do substrato, ou resposta homotrópica positiva nterações entre substrato e inibidor ou substrato e ativador: respostas heterotróficas positivas (ativador) ou negativas (inibidor)
Resposta sigmoidal à variação do substrato proporciona um maior controle da taxa de reação pelas variações na concentração de substrato
Modelos de nteração eqüencial assumem mudanças seqüenciais ou progressivas nas afinidades dos sítios vazios a serem ocupados Modelos de imetria Orquestrada a enzima pré-existe como uma mistura em equilíbrio de oligômeros de alta afinidade e oligômeros de baixa afinidade
Modelo imples de nteração de Adair-auling E a E E ara enzimas com dois sítios de ligação idênticos: E E a E E [] [] v a = V MAX [] [] E 1 a ara enzimas com 4 sítios idênticos: a, b e c - fatores de interação v V MAX = 1 [] s 4[] 3[] a 6[] a 3 3[] a b 3 3 4[] a b a 3 3 b a [] 3 b 4 c [] 4 4 c 4
Distribuição das espécies enzimáticas enzima com 4 sítios catalíticos idênticos e sem cooperatividade enzima com 4 sítios catalíticos onde a ligação de cada molécula de substrato aumenta as constantes de ligação dos sítios vazios isocitrato desidrogenase - NAD dependente (leveduras)
Equação de Hill v V = [] n n MAX ' [] n = número de sítios de ligação ao substrato por molécula de enzima = n (a n-1 b n- c n-3...z 1 ) = constante envolvendo os fatores de interação (a, b, c,... z) e a constante de ligação intrínseca dv d[] = n' V MAX (' [] [] n ) n 1 d v / d[] = 0 - ponto de inflexão
lot de Lineweaver-Burk para Enzimas Alostéricas 1/v versus 1/[] 1/v versus 1/[]
Cooperatividade Negativa A curva de velocidade não é sigmoidal (a) sem cooperatividade; (b) cooperatividade negativa
nterações que afetam V MAX E E E E E 10 E E v V MAX = 0,[] [] [] [] 1 E (a) interação da cooperatividade entre as sub-unidades (b) dissociação da cooperatividade enzimática em sub-unidades (c) resposta hiperbólica
Formas de nibição em istemas Alostéricos 1. nibição Competitiva ura E E E E E E E E E
. nibição Competitiva em Dois ítios.1 - Ligação Cooperativa do ubstrato; nibidor simula a molécula de substrato a a E E E a a a E E E a a a E E E. - Ligação Cooperativa do ubstrato; nibidor não simula a molécula de substrato E E E E E E a a E E E.3 - Ligação Cooperativa do nibidor c E E E c E E E E E E
3. nibição Competitiva arcial se liga cooperativamente com o fator de interação a; aumenta a constante de dissociação dos sítios de ligação por um fator α, mas não tem efeito de interação entre os sítios de substrato 4. Ativação do ubstrato 4.1 - Ligação Ordenada 4. - Ligação Randômica E 1 = E E 1 = E = α = α = α E E E 1 = E E
E E ou E E A BA ou AB B Modelo Genérico de nteração eqüencial de oshland- Nemethy-Filmer Modelos tetraédricos: Modelos lineares: Modelos quadráticos:
Modelo de Geometria Orquestrada (Monod, Wyman e Changeux) T representa a conformação de baixa afinidade em equilíbrio com R a forma da enzima de alta afinidade
Modelos Híbridos primeira coluna - modelo de simetria orquestrada quarta coluna - modelo de interação seqüencial
Regulação da Atividade Enzimática Controle da Disponibilidade Enzimática: A quantidade de uma dada enzima na célula depende da sua taxa de síntese e da sua taxa de degradação Controle da Atividade Enzimática: A atividade catalítica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações conformacionais ou estruturais
Aspartato transcarbamoilase (ATCase) ligação cooperativa homotrópica positiva para ambos os substratos heterotropicamente inibida pela cistidina trifosfato (CT) heterotropicamente ativado pela adenosina trifosfato (AT) H N CO OO 3 - - OCO CH CH COO - ATCase - OCO CH CH COO - NH 3 NH carbamoil fosfato aspartato H N CO H O 4 -
Mudanças conformacionais na ATCase