DETECÇÃO DE Cryptosporidium spp. AO LONGO DA BACIA DE MANANCIAL DO RIBEIRÃO CAFEZAL, LONDRINA/PR. R. M. Kawata*, L. F. Maia** e K. V. M. C. Prates*** *Graduanda em Engenharia Ambiental / UTFPR, Londrina/PR, Brasil **Coordenação de Tecnologia em Alimentos / UTFPR, Londrina/PR, Brasil ***Coordenação em Engenharia Ambiental / UTFPR, Londrina/PR, Brasil e-mail: rafaela_mk@hotmail.com Resumo Visto que a presença de Cryptosporidium spp. em águas para o consumo revela-se um importante problema de saúde pública, o presente trabalho teve como objetivo detectar a presença de Cryptosporidium spp. na bacia de manancial do Ribeirão Cafezal, da cidade de Londrina. Foram avaliados 9 pontos ao longo da bacia, durante os meses de Agosto a Maio. As metodologias utilizadas neste trabalho foram a técnica da membrana filtrante, extração de DNA e reação de polimerase em cadeia (PCR). Oocistos de Cryptosporidium spp. foram encontrados em vários pontos do corpo d água avaliado. Palavras-chave: Ribeirão Cafezal, Cryptosporidium, PCR. Abstract As the presence of Cryptosporidium spp. in the water for consumption proves to be an important public health problem, this study aimed to detect the presence of Cryptosporidium spp. in the Ribeirão Cafezal basin, in the city of Londrina. We evaluated nine points along the basin, during the months of August to May. The methodologies used in this study were the technique of membrane filtration, DNA extraction and polymerase chain reaction (PCR). Cryptosporidium spp. was found in various samples of the collected water. Key words: Ribeirão Cafezal, Cryptosporidium, PCR. Introdução Cryptosporidium spp. é considerado como um importante patógeno emergente de veiculação hídrica, causador de gastroenterites e diarreias autolimitadas em indivíduos sadios e infecções crônicas em imunodeficientes [1]. Todas as espécies do gênero Cryptosporidium spp. são parasitas obrigatórios, porém a espécie mais relevante deste gênero é o C. parvum, que provoca infecção no homem. Eles infectam as microvilosidades das células epiteliais do trato digestivo e respiratório de vertebrados e são liberadas nas fezes do hospedeiro infectado. Os esporozoítos e oocistos que compõem seu ciclo de vida são de tamanho reduzindo, variando de 4 a 6 µm [2]. O mecanismo de transmissão deste protozoário é influenciado pelo nível de contaminação ambiental, sobrevivência do oocisto às condições do meio, resistência do oocisto aos mais variados métodos de tratamentos da água ou a incompleta remoção dos oocistos [3]. 1/8
Essas características de persistência ambiental e resistência aos processos usuais de desinfecção, aliadas à alta infecciosidade relativa, têm conferido ao Cryptosporidium spp. o status de micro-organismo de referência pela OMS e legislações de alguns países [2]. Desta forma, este trabalho visou investigar a ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. no percurso da bacia de manancial de abastecimento do Ribeirão Cafezal, da cidade de Londrina/PR. Para tanto foi utilizada a técnica da membrana filtrante e a confirmação molecular pela técnica da PCR (Polimerase Chain Reaction). Materiais e Métodos A área de análise compreendeu a bacia do Ribeirão Cafezal, que constitui um dos mananciais de abastecimento da cidade de Londrina, percorrendo ainda os municípios de Cambé e Rolândia. Para a análise da presença de Cryptosporidium spp foram coletados 2 litros de água de 9 pontos de coleta (Figura 1), com auxilio de frascos de vidro esterilizados, mergulhados a uma profundidade de aproximadamente 20 cm, e posteriormente armazenados em garrafas PET lavadas com solução 1% de Tween 80. Figura 1: Pontos de coleta de água distribuídos na Bacia de Manancial do Ribeirão Cafezal. Fonte: SANEPAR, 2011. 2/8
Como visto na Figura 1, os pontos abrangem os municípios de Rolândia, Cambé e Londrina. Descrevem-se os pontos como: - Ponto 1: Rio perto da antiga Big-frango em Rolândia; - Ponto 2: Rio perto do cemitério em Rolândia; - Ponto 3: Rio que passa embaixo da rodovia que da acesso à Rolândia; - Ponto 4: Rio que passa no fundo de um Clube; - Ponto 5: Parte mais barrenta do rio presente na parte rural entre Cambé e Rolândia; - Ponto 6: Parte mais cristalina do rio presente na parte rural entre Cambé e Rolândia; - Ponto 7: Rio presente na parte rural após Londrina; - Ponto 8: Rio presente no começo da parte rural após Londrina (Perto de um sítio); - Ponto 9: Estação de captação da SANEPAR. O isolamento do protozoário foi realizado pelo método da membrana filtrante, onde os 2 litros de água foram filtrados em um sistema de bomba a vácuo. Os oocistos retidos na membrana foram removidos por extração mecânica e lavagem com solução a 1% de Tween 80. O liquido resultante foi transferido para tubos de centrífuga, com rotação a 6000 rpm por 15 minutos. O sedimento obtido foi suspenso em 1 ml de água destilada esterilizada. Alíquotas foram submetidas a coloração de oocistos, pelo método de Kinyoun e observadas em microscópio óptico comum com aumento de 400 vezes. O procedimento de extração de DNA foi realizado pela técnica do choque térmico. Inicialmente pegou-se 1 ml proveniente da obtenção dos oocistos e centrifugou-se a 10000 rpm a 5 minutos. Ao pellet resultante diluiu-se 500 µm de tampão (10 mm Tris-HCl ph 8,0; 25 mm EDTA ph 8,0; 100 mm NaCl e 1% de SDS). Em seguida prosseguiu-se com 5 ciclos de congelamento em gelo seco por 5 minutos e descongelamento em banho maria a 65ºC por 5 minutos, com posterior adição de 20 µm de proteinase K (10 mg/ml). As amostras foram incubadas a 56ºC por 2 horas com agitação a 1000 rpm a cada 5 minutos. Centrifugou-se a 10000 rpm por 15 minutos e ao sobrenadante foi acrescentado 1 ml de etanol gelado e colocado no freezer overnight. Centrifugou-se por 20 minutos a 12000 rpm, descartou-se o etanol e foi adicionado 50 µm etanol 70%. O DNA precipitado foi obtido por centrifugação a 12000 rpm por 20 minutos, seguido de adição de 50 µl de água destilada estéril. A amplificação do gene de identificação do gênero CRY18SF (5 : TTCTAGAGCTAATACATGCG3 ) e CRY18R (5 CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3 ) foi realizada em termocilador, utilizando uma mistura de 20µL contendo 2 µl de 1x tampão PCR, 1 µl de MgCl 2 (50mM), 1,4 µl de 3/8
dntp (10mM), 1 µl de cada oligonucleotideo iniciador, 0,5 µl da enzima Taq polimerase, 2 µl de amostra completando-se o volume para 20 µl com água bidestilada estéril. As condições de amplificação utilizadas foram as seguintes: um ciclo inicial a 94ºC por 10 minutos; 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min; anelamento a 55ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min e 30s; e um ciclo final a 72ºC por 10 minutos. A integridade do DNA foi visualizada em gel de agarose (1,5%, p/v) corados com solução de brometo de etídio (0,005%, p/v) e revelado em luz ultravioleta. Resultados A partir das análises microscópicas realizadas das amostras coletadas no período de Agosto de 2011 a Maio de 2012, obteviveram-se os resultados de presença ou ausência do Cryptosporidium spp (Tabela 1 e Tabela2). Tabela 1: Resultados da análise microscópica da presença de oocistos de Cryptosporidium spp. nas amostras realizadas em Agosto a Dezembro de 2011. Pontos de Agosto Setembro Outubro Novembro Dezembro Coleta P A P A P A P A P A Ponto 1 x x x x x Ponto 2 x x x x x Ponto 3 x x x x x Ponto 4 x x x x x Ponto 5 x x x x x Ponto 6 x x x x x Ponto 7 x x x x x Ponto 8 x x x x x Ponto 9 x x x x x Legenda: P Presença; A Ausência. Na Figura 2 pode-se visualizar alguns dos oocistos de cryptosporidium spp. A quantificação de DNA presente nas amostras está representada na Figura 3. Os códigos identificam os pontos e o mês da coleta: - C1E: Ponto 1 do mês de Agosto; - C2E: Ponto 2 do mês de Agosto; - C3E: Ponto 3 do mês de Agosto; - C5E: Ponto 5 do mês de Agosto; - C8E: Ponto 8 do mês de Agosto; - C6F: Ponto 6 do mês de Setembro; - C7F: Ponto 7 do mês de Setembro; - C8F: Ponto 8 do mês de Setembro; - C2G: Ponto 2 do mês de Outubro; - C2H: Ponto 2 do mês de Novembro; 4/8
- C6I: Ponto 6 do mês de Dezembro; - C8I: Ponto 8 do mês de Dezembro. Com relação ao aspecto da água, tem-se: - Turva: C1E, C5E, C8E, C6F, C7F, C8F, C6I, C8I. - Cristalina: C2E, C3E, C2G, C2H. Tabela 2: Resultados da análise microscópica da presença de oocistos de Cryptosporidium spp. nas amostras realizadas em Fevereiro a Maio de 2012. Pontos de Coleta Fevereiro Março Abril Maio P A P A P A P A Ponto 1 x x x x Ponto 2 x x x x Ponto 3 x x x x Ponto 4 x x x x Ponto 5 x x x x Ponto 6 x x x x Ponto 7 x x x x Ponto 8 x x x x Ponto 9 x x x x Legenda: P Presença; A Ausência. Figura 2: Oocistos de Cryptosporidium spp. (seta) observados ao microscópio óptico comum, após coloração pelo método de Kinyoun. A) Oocisto do Ponto 2 da coleta do mês de Outubro. B) Oocisto do Ponto 1 da coleta do mês de Dezembro. C) Oocisto do Ponto 8 da coleta do mês de Dezembro. Na técnica de PCR não apresentou amplificação para o gene gênero específico para Cryptosporidium spp. reajustes na técnica estão sendo realizadas. Os dados de precipitação da região da bacia de manancial do Ribeirão Cafezal estão dispostos na Tabela 3. 5/8
Figura 3: Canaletas C1E a C8I: DNA genômico de Cryptosporidium spp. após a técnica de extração (seta). λ: DNA do fago λ em concentração de 10 ng/µl. Tabela 3: Dados de precipitação da região da bacia do Ribeirão Cafezal. Mês Precipitação (mm) Agosto 31,7 Setembro 7 Outubro 278,3 Novembro 140,1 Dezembro 86,4 Fevereiro 40,3 Março 87,8 Abril 159 Maio 64,5 Discussão A agregação de patógenos ao material particulado, ou a integração de patógenos a matéria orgânica influencia na taxa de sedimentação de patógenos e favorece o decaimento dos mesmos na coluna d água. Embora a sedimentação individual dos oocistos seja extremamente lenta, a capacidade dos oocistos de se aderirem às partículas aumenta potencialmente sua velocidade de sedimentação [4]. Como em diversos pontos a água encontrava-se aparentemente cristalina, constatou-se que a sedimentação provavelmente contribui para uma menor concentração de oocistos na camada superficial que foi a região na qual a água foi coletada. É interessante ressaltar que os organismos patogênicos costumam estar associados às partículas responsáveis pela turbidez, que parecem utilizá-las como substrato e forma de proteção. Assim, ao remover a turbidez da água, são também removidos os patogênicos a ela associados [5]. No estudo do Ribeirão Cafezal o fator turbidez seguiu o mencionado por Silva [5], onde a maioria dos pontos analisados que apresentaram o oocisto de Cryptosporidium spp. possuía uma turbidez notável. Reforçando então a probabilidade de encontrar oocistos em águas com turbidez elevada. Em estudos quanto à influência de chuvas sobre a ocorrência de oocistos em ambientes aquáticos, observou-se uma elevação de 10 a 100 vezes a concentração de oocistos durante períodos chuvosos em relação aos não chuvosos [2]. A partir de dados de precipitação da região da área de estudo há uma contradição ao relatado por Cerqueiria [2]. Os meses que apresentaram positivamente o Cryptosporidium spp. não foram os com maior precipitação mensal. O mês com precipitação 6/8
mais elevada obteve apenas um ponto com a presença do Cryptosporidium spp. É de extrema importância que os processos hidrodinâmicos sejam mais bem avaliados, em pesquisas mais longas, pois tais processos influenciam diretamente na distribuição e transporte dos patógenos no corpo d água [6]. A presença de Cryptosporidium spp. também pode ser fortemente influenciada pela sazonalidade e pelo uso do solo [6]. O ponto com mais frequência na detecção de oocistos foi o ponto 8 que consiste justamente em uma área de criação de gado. Na técnica de PCR não observamos amplificação do gene gênero específico para este protozoário. Provavelmente a temperatura de anelamento do oligonucleotideo não foi adequada. Demais testes estão sendo realizados. Conclusão Embora a detecção de Cryptosporidium spp. tenha ocorrido em alguns pontos de coleta deve-se considerar fatores como temperatura, radiação, variações do ph, pois estes possivelmente favorecem a inativação dos patógenos na água e consequente não detecção dos mesmos nas análises. Além disso, não se pode esquecer que o uso e ocupação do solo é um fator indispensável na avaliação da presença do Cryptosporidium spp. Agradecimentos A Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR, a Fundação Araucária e ao CNPq pelo suporte financeiro. Referências [1] Muller, A.P.B. (1999), Detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. em águas de abastecimento superficiais e tratadas da região metropolitana de São Paulo, Dissertação de Mestrado, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, São Paulo, p. 3. [2] Cerqueira, D.A. (2008), Remoção de oocistos de Cryptosporidium parvum e de indicadores no tratamento de água por ciclo completo, filtração direta descendente e dupla filtração, em escala piloto, Tese de Pós-graduação em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Engenharia da UFMG, Belo Horizonte, p., 2, 19. [3] Lima, E.C., Stamford, T.L.M. Cryptosporidium spp. no ambiente aquático: aspectos relevantes da disseminação e diagnóstico. Ciência & Saúde Coletiva, 8930: 791-800, 2003. 7/8
[4] Brookes, D.J., Antenucci, J., Hipsey, M., Burch, D.M., Ashbolt, J.N., Ferguson, C. Fate and transport of pathogens in lakes and reservoirs. Environment International, v.30, p.741-759, 2004. [5] Silva, C.F. (2008), Remoção de oocistos e de indicadores físicos de Cryptosporidium parvum em águas de abastecimento por meio da decantação estudo em escala piloto, Dissertação de Mestrado, Escola de Engenharia da UFMG, Belo Horizonte, p.42. [6] Lopes, A.M.M.B. (2009), Avaliação da ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. e de cistos de Giardia spp. e sua associação com indicadores bacteriológicos e turbidez na represa de Vargem das Flores MG, Dissertação de Mestrado, Escola de Engenharia da UFMG, Belo Horizonte, p. 88. 8/8