Relato de Caso A Fraco

Relato de Caso A Fraco Rocha AE (1), Ferreira SM (2), Bertoletti JAJ (3), Giana HE (4), Beltrame N (5) Laboratório Oswaldo Cruz Praça Cândida Maria C. Sawaya Giana, 128, Jd. Nova América São José dos Campos, SP 12243-003 Resumo A tipagem sanguínea consiste na determinação dos grupos sanguíneos, que se caracterizam pela presença ou ausência de determinados antígenos na membrana eritrocitária. Resultados discrepantes podem estar relacionados a diferentes fatores, tais como subgrupos de A (principalmente o fenótipo A2) e o fenótipo D fraco, ambos causados por alterações que codificam esses antígenos. A técnica adotada pelo Laboratório é a realização da microtipagem em gel-centrifugação, e através desta foi observado um resultado inconclusivo associado ao sistema ABO, com a presença de um fenótipo variante de Afraco. Palavra-chave: Grupo Sanguíneo ABO, A Fraco, Gel-Centrifugação Abstract The blood typing is the determination of blood group, which are characterized by the presence or absence of certain antigens on the erythrocyte membrane. Discrepant results may be related to different factors such as the subgroups (especially A2 phenotype) and weak D phenotype, both caused by changes that encode these antigens. The technique used by the Laboratory is the realization of microtipagem gel-centrifugation, and through this we observed an inconclusive result associated with the ABO system, with the presence of a phenotype variant of Weak A. Keywords: ABO blood group, Weak A, Gel-Centrifugation (1) Biomédica do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos (2) Bioquímica do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos (3) Biomédica do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos (4) Diretor Presidente do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos (5) Gerente Técnico do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos

Introdução Em 1900 Karl Landsteiner descobriu o sistema ABO, classificando as amostras de sangue de seres humanos de acordo com a presença de dois antígenos A e B na superfície dos eritrócitos, e dois anticorpos correspondentes a imunoglobulina anti A e anti B no plasma (1). Mais tarde foram identificados outros sistemas, sendo o sistema ABO e Rh ou CDE os de maior expressão e importância na pratica transfusional, o qual é fundamental a compatibilidade para prevenção de reações hemolíticas, embora os outros sistemas como Kell, Kidd, Duffy e MNS tenham sua importância (2). Os antígenos eritrocitários são determinados geneticamente pelo cromossomo 9, definidos por proteínas com sequências de aminoácidos específicas ou por carboidratos ligados a esta proteína ou lipídio. O antígeno H é a base para a formação de todos os antígenos do sistema ABO. Para a formação dos antígenos é necessário ao menos um alelo ABO funcional para ocorrer o processo de transcrição dos mesmos. Os antígenos A e B são produzidos pela ação dos alelos A e B sobre a proteína H. O gene ABO codifica as glicosiltransferases que transferem novos açucares, mediado por respectiva enzima que converte ao antígeno A e B. No grupo O, o antígeno H fica inalterado, não ocorrendo fixação de açucares e com ausência de antígenos (3, 4, 10). Quadro 1 - Formação de Antígenos Antígeno A Antígeno B Antígeno AB Ausência de Antígeno O alelo A determina a expressão A transferase, que adiciona N-acetilgalactosamina à galactose terminal da substancia H. O alelo B determina a B transferase, que transfere uma molécula de galactose na mesma posição. O alelo A e o alelo B se manifestam simultaneamente, ocorrendo adição de galactosamina e galactose. O antígeno H permanece inalterado. Fonte: Autoria própria Após esta determinação os antígenos ficam incorporados na membrana dos eritrócitos, qualquer defeito neste complexo pode levar a reações sorológicas anormais, dando origem a subgrupos de A e B (5). Quando o antígeno está ausente no eritrócito, o anticorpo IgM correspondente está presente no plasma. Nos recém-nascidos, os anticorpos IgM estão ausentes e começam a se formar a partir de 3 a 6 meses de vida, ocorrendo a formação através de contato com substancias presentes na natureza, como: sementes, plantas, microorganismos, fontes exógenas, ou seja, exposição a polissacarídeos semelhantes à estrutura do antígeno ABO, que atuam como estimulo na formação do anticorpo (6, 4). Para se determinar o grupo sanguíneo, utilizamos provas direta e reversa. A tipagem é realizada em amostras de sangue testando as hemácias com anticorpos anti-a, anti-b e anti-ab (exceto quando utilizado anticorpos monoclonais, não há necessidade do anti-ab). A tipagem reversa utiliza o soro ou plasma com uma suspensão de hemácias conhecida A1 e B. Qualquer discrepância, é recomendada a investigação de subgrupo A (7, 8).

Quadro 2 - Determinação do Grupo Sanguíneo Grupo Sanguíneo ABO Antígenos Anticorpos A A Anti-B B B Anti-A AB AB Ausente O H Anti-A e Anti-B Fonte: Autoria própria. O antígeno A mais comum nos indivíduos é o A1, mas temos o A2 e outras variantes (A3, Ax, Am, Aend) que reagem fracamente com os soros de tipagem anti-a. A principal distinção entre o subgrupo A está relacionada com a tipagem correta dos eritrócitos, prova direta e reversa, se não, podem ser classificados como pertencentes ao grupo O (4). O fenótipo A2 é detectado por aglutinar na presença de soro anti-a e não aglutinar com o soro lectina anti-a1. O termo lectina refere-se a uma classe de proteínas de origem não imunológica, que aglutina hemácias devido a propriedade de se ligar reversivelmente a carboidratos. Os anticorpos monoclonais anti-a e/ou anti-b reconhecem à maioria dos subgrupos ABO; a determinação da baixa expressão antigênica é tecnicamente trabalhosa. Os grupos definidos como A fraco tem uma prevalência de acordo com o lugar e raça, sendo mais freqüentes em populações negras e japonesas (8). O sistema Rh foi descoberto em 1939, por Levine e Stetson, ao estimular uma reação transfusional. Este é um sistema polimórfico, sendo os principais antígenos os D, C, c, E, e, com uma alta capacidade imunológica, ou seja, induz à formação de anticorpos causando doenças hemolíticas, perinatal e transfusional. O significado de Rh positivo e Rh negativo refere-se à presença ou ausência do antígeno D, o RhD fraco refere-se ao antígeno D reduzido na membrana do eritrócito (4, 9, 10). A determinação da tipagem sanguínea originalmente realizada em laminas, atualmente é realizada em métodos mais precisos, podendo ser utilizados microplacas escavadas, tubos de ensaio ou gel-centrifugação, existindo muitos reagentes comerciais, mas a tendência é a substituição do tradicional policlonal pelo monoclonal ou oligoclonal (10, 11). Figura 1 Aglutinação de hemácias nas técnicas em coluna de aglutinação/gel centrifugação (A), tubo (B) e microplaca (C). Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/tecnico_hemoterapia_livro_texto.pdf

A reação de hemoaglutinação consiste na interação de antígenos eritrocitarios com anticorpos que reconhecem o respectivo antígeno. Está reação pode ser visualizada macroscopicamente devido à aglutinação (12). Na técnica de gel-centrifugação, as colunas são preenchidas por um gel fino que pode ser neutro, apresentar anticorpo ou soro antiglobulina humano. A aglutinação ocorre durante o estágio de centrifugação, onde as hemácias são mais densas que o gel e tendem a passar através dele. Quando não reagem com os anticorpos sedimentam-se no fundo da coluna e formam aglutinados pela ação do anticorpo. As hemácias ficam retidas no gel durante a centrifugação, podendo apresentar intensidade de 1 a 4 cruzes na leitura do cartão(12), como pode ser observado na figura 2. Figura 2 Padrão de leitura: técnica coluna de aglutinação/ gel-centrifugação. Fonte: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/tecnico_hemoterapia_livro_texto.pdf Descrição do Caso O setor de Imunohematologia do Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos, em sua rotina utilizando a técnica de gel-centrifugação (Pesquisa de Antígenos ABO e Rh em cartão contendo anticorpos monoclonais anti-a, anti-b e anti-d, suspensos em gel, com contra prova (Gel neutro para a prova reversa utilizando hemácias A1 e B)), observou um resultado discrepante de um paciente adulto entre a prova direta e reversa. A prova direta apresentou ausência de antígenos, e a prova reversa apresentou ausência de anticorpo A e presença de anticorpo B. Após confirmação, o resultado persistiu, e frente ao caso foi solicitado nova amostra para encaminhamento ao centro de referência, pois a provável discrepância seria devido a uma expressão fraca do antígeno A. Através da técnica de fixação-eluição, realizada pelo centro de referência Diamed, o qual consiste em incubar as hemácias com o anti-a, lavar, e levar a diferentes temperaturas (congelamento e aquecimento), foram realizadas as seguintes análises:

TESTE: Grupo Sanguíneo: ABO/Rh (DiaClon) (D(VI+)) Cartão: ID-Clon ABO/Rh Doador Resultado - Grupo: O - Rh(D): Positivo (D(VI)) TESTE: Grupo Sanguíneo: ABO/Rh Cartão: ID-ABO/Rh Resultado - Grupo: O - Rh(D): Positivo TESTE: Fenótipo: C-Cw-c-E-e-K Cartão: ID-Subgrupos Rh+Cw+K Resultado - Fenótipo: CC..ee - Kell: Negativo

TESTE: Prova Reversa + PAI: A1-A2-B-O-I-II Cartão: ID-Prova Reversa+PAI Resultado - Reações Atípicas! (verificar!) - Ab.screen: Negativo TESTE: Teste de Antiglobulina Direto (TAD) Cartão: ID-LISS/Coombs Resultado - Direct Coombs: Negativo TESTE: PAI:I-II-AC Coombs Cartão: ID-LISS/Coombs Resultado - Ab. screen: Coombs Negativo Através da Fenotipagem Eritrocitária ABO/RhD, determinou-se: Grupo Sanguíneo (ABO): A fraco (provável subgrupoael) - RhD: Positivo

Foi realizada fixação-eluição com reagente Anti-A (monoclonal/policlonal), para verificar a presença do antígeno A, fracamente expresso (provável subgrupo Ael) e a presença de anti-a1 natural a partir da metodologia ID-System, ID-LISS/ Coombs e ID-Papaína. Comentário Concluímos que devido a metodologia foi possível rastrear a discrepância do sistema ABO encontrada, pois a prova direta tem que ser concordante com a reversa. Primeiramente o resultado do paciente seria de um fenótipo O, mas a prova reversa alertou a necessidade de uma analise detalhada da expressão antigênica, apresentando um fenótipo de Afraco. Bibliografia 1. Karl Landsteiner Biography. Nobelprize.org 2 Jul 2012. Available from: http;//www.nobelprize.org/nobel_prize/medicine/laureates/1930/landsteiner.htm 2. Cozac AP. Estudo do potencial antigênico relativo dos antígenos de grupos sanguíneos menores em participantes sob esquema de transfusão. Ribeirão Preto: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2009. 3. Batissoco AC, Novaretti MCZ. Aspectos moleculares do Sistema Sanguíneo ABO. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia.2003;25:47-58. 4. José Eduardo Cavalcanti Teixeira. Diagnostico Laboratorial em Hematologia. 2006; 1º.Edição;23:57-60. 5. Chaves G. Maestro Máster Sofware DiaMed. 2007. 6. Harmening D. Técnicas Modernas em Banco de Sangue e Transfusão. 4º. Ed: Revinter;2006. 7. Brasil MdS. Portaria MS no. 1353 de 13 de Junho de 2011. Brasil 2011. 8. Shastry S, Bhat S. Imbalance in A(2) and A(2)B phenotype frequency of ABO group in South Índia. Blood Tranfus. 2010 Oct;8(4):267-70. PubMed PMID:20967168. Pubmed Central PMCID: 2957492. Epub 2010/10/23.eng. 9. Nardozza LMN, Szulman A, Barreto JA, JUNIOR EA, Moron AF. Bases Moleculares do Sistema Rh e Suas Aplicações em Obstetrícia e Medicina Transfusional. Ver. Assoc. Brás. Méd.2010;56(6):724-8 10. Liu IP. Analise de Resultados da Tipagem Sanguínea Antes e Após a Implantação da Técnica de Semi-automação. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2012. 11. Chester MA, Olsson ML. The ABO blood group gene: a locus of considerable genetic diversity. Transfus Med Rev. 2001 Jul; 15(3): 177-200. PubMed PMID: 11471121. Epub 2001/07/27. eng. 12. Castilho, S.: Ubiali, EMA. Carvalho, MA. Controle de qualidade de reagentes em imunohematologia. In: BRASIL. Ministério da Saúde. Técnico em Hemoterapia: livro texto. Brasília: Ministério da Saúde, 2013. Imuno-Hematologia do Doador e do Receptor: 143-161. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/tecnico_hemoterapia_livro_texto.pdf