PROTOCOLO USO DO ESPECTROFOTÔMETRO HITACHI (U-2900 UV-VIS) COM AUTOSIPER Figura 1. Imagem do espectrofotômetro. A: Botão Power. B: Tampa superior. C: Mangueira coletora. D: Botão Wash. 1º passo: ligando o espectrofotômetro Figura 2. Teclado do espectrofotômetro. 1. Retirar a capa que protege o aparelho; 2. Ligar o estabilizador na tomada (220v), ATENÇÃO!; 3. Ligar o estabilizador; 4. Ligar o aparelho no botão Power de cor preta que fica na lateral esquerda do aparelho (A- Figura 1); 5. Esperar até que a tela inicial (main menu) apareça no visor, enquanto ele checa os itens do sistema e realiza sua autocalibração (Figura 3). (nunca abrir caixa superiordireita (B-Figura 1) durante esta leitura, pois pode dar interferência na checagem da lâmpada!).
2º passo: limpando o espectrofotômetro Figura 3. Tela de inicialização do espectrofotômetro. O espectrofotômetro, quando em repouso, permanece com um pouco de detergente em seu sistema, é preciso removê-lo antes do início das análises. 1. Abra a tampa superior-direita (B-Figura 1), onde está localizado o sistema de fluxo e mangueira para entrada e saída de amostra; 2. Puxe o engate de metal que prende a mangueira, esticando-a; 3. Retire a proteção que envolve a mangueira coletora na sua entrada; 4. Coloque, ao final da mangueira, um recipiente que servirá para descarte das amostras, podendo ser este um pote qualquer ou béquer grande, de preferência cobrindo-o com papel filme para evitar que o cheiro dos reagentes se disperse no ar; 5. Abra a válvula de descarte, ao final da mangueira, de modo a permitir o fluxo das amostras pelo sistema; 6. Pegue um pequeno frasco (um béquer, por exemplo), com aproximadamente 50 ml de água destilada. Introduza a fina mangueira coletora (C- Figura 1), que se encontra na frente do espectrofotômetro, dentro do frasco e aperte o botão Wash (de cor verde (D-Figura 1)). Permaneça pressionando o botão por aproximadamente 30 segundos, ou até que aproximadamente 30 ml da água destilada tenha passado pelo aparelho, retirando, assim, todo o detergente que havia dentro da mangueira interna do aparelho. PRONTO! O espectrofotômetro está pronto para o uso. 3º passo: Preparando equipamento para análise colorimétrica 1. Na tela principal, selecione a partir dos botões direcionais a opção 1 Photometry e aperte a tecla Enter.
Figura 4. Menu principal na tela do espectrofotômetro. 2. Aparecerá então uma segunda tela com um submenu; 3. Na opção 1 Parameter Setup verifique se o modo Data Mode está selecionado para conc (concentração); 4. Os modos Initial Delay e Number of WL, aconselha-se que sejam sempre 0 e 1, respectivamente. 5. Com a seta cursor para baixo vá até a opção WL (nm)(comprimento de onda) e pressione a tecla Enter. Nesta opção você irá eleger o comprimento de onda pertinente a sua análise, por exemplo: 540 Nitrito e nitrato (NO 2+ NO 3) 630 N-amoniacal (NH 4) 880 Ortofosfato (PO 4) 810 Silicato SiOH 6. Digite o valor do comprimento de onda no teclado numérico e aperte Enter; 7. Aperte a tecla Return para voltar ao submenu; 8. Desça com a tecla usando as setas e vá para a opção 2 Sample Setup. Em Name selecione o nome do projeto referente às suas análises (para digitar uma letra pressione a tecla Shift+letra) e a unidade de leitura (ex: µm); 9. Na opção do submenu Curve Setup, selecione o número de amostras da curva: no caso dos nutrientes, serão 4, o branco (água destilada com os reagentes) + 3 diluições. Na linha de baixo deve ser digitado o número 3, já que o equipamento fará a média de três amostras (triplicata), conforme Figura 5;
Figura 5. Leitura da curva em triplicata. 10. Já na opção Curve Data, inserir o valor 0 (zero) do branco mais os valores da diluição da curva padrão para o nutriente em questão, conforme abaixo: AMÔNIA: 0 µm, 1 µm, 2 µm, 4 µm; FOSFATO: 0 µm, 0,5 µm, 1 µm, 2 µm; SILICATO: 0 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm; NITRITO E NITRATO: 0 µm, 1 µm, 2 µm, 4 µm para cada. (Obs: deverá ser aberto um procedimento p o NO3+2 coluna A e outro para a coluna B.) 11. Em Print Setup, todos os modos devem estar ON; 12. System Setup e Data Save Setup não precisam ser alterados; 13. Vá em Save Parameter. 3º passo: Elaborando a curva de calibração Após salvar seus dados para suas análises, vamos começar a passar as amostras: 1. Ir em Methods/Load e baixar a curva com as definições já salvas, caso a sua curva apresente informações diferentes das que estão salva, será necessário criar uma curva nova (seguindo os passos acima). JAMAIS altere as informações das curvas que estão salvas no equipamento; 2. Fazer Wash passando água destilada por 1 minuto, conforme já explicado anteriormente; 3. Sempre conferir se o valor da absorbância que aparece no topo direito da tela é 0, caso contrário deve-se sempre passar uma pequena fração de água destilada e clicar em Auto Zero, especialmente antes de passar a curva e antes de começar a passar as amostras; 4. Comece com a curva padrão, passando primeiramente o branco: inserir a mangueira de fluxo do espectro na amostra e pressionar rapidamente a chapa de metal na parte frontal direita do equipamento (E- figura 1), ao lado da entrada da mangueira, conforme Figura 6; 5. Lembrar que são três leituras para cada amostra!!! Leremos sempre em triplicata, afim de maior segurança e precisão!
Figura 6. Inserção de amostra no aparelho para leitura. 6. Inserir as demais amostras na ordem que foi indicada na etapa anterior item 9, sempre da menos concentrada para as mais concentradas; 7. Ao final da inserção das amostras da curva em triplicata, o equipamento calcula a média das três amostras e gera a reta que aparecerá em um quadro ao lado das absorbâncias e concentrações, além dos fatores da curva, conforme Figura 7; Figura 7. Curva gerada pelo aparelho, onde aparecem os quatro fatores gerados. 8. O R da curva deve ficar o mais próximo de 1, e o fator K1 deve ficar entre 80 e 120, o que indica que a curva está correta e as amostras podem então ser lidas. Se os fatores não ficarem bons, a curva deve ser refeita; 9. Salvar a curva. 4º passo: fazendo uma análise colorimétrica: passando as amostras 1. Para começar a analisar as suas amostras, vá em File Manager, Internal Memory Flash Memory, dependendo de onde salvou sua curva e Load (clicando no nome que você salvou sua curva); 2. Clicar em Measure;
3. Realizar o Auto Zero, quando se zera o valor da absorbância no canto superior direito da tela após inserir água destilada no circuito (pelo menos 5 ml), conforme já descrito; 4. Começar a passar as amostras experimentais, que também serão feitas em triplicata (três amostras em reação, não três leituras), sempre as homogeneizando antes de inserir no aparelho; 5. Quando acabar de passar as amostras é só teclar Stop e a medição é encerrada. 6. Salve seus dados conforme passo 5. 5 º passo: Salvando seus dados 1. Para salvar tanto a curva quanto os seus dados das amostras, clique em Save; 2. Deve-se escolher entre salvar os dados na Memória Interna (Internal Memory) ou no Pen Drive (Flash Memory); 3. Clique em Flash Memory (pen drive) e com o teclado nomeie os seus dados; 4. Clique em Save. * O Pen Drive fica aos cuidados da Coordenadora do Laboratório. Inserir o pen drive no aparelho antes de ligá-lo. Após o uso removê-lo e entregá-lo a coordenadora. Sempre que fizer uma análise é necessário passar imediatamente seus dados para seu computador, pois o pen drive é formatado periodicamente. 6º passo: convertendo seus dados 1. Após salvar seus dados, dê um Return até a tela inicial (Figura 4); 2. Selecione a opção de número 6 no menu, File Manager; 3. Selecione Convert to txt; 4. Selecione os seus dados (os que você acaba de salvar no aparelho); 5. Nomeie seus dados (ou mantenha o mesmo nome); 6. Pronto, seus dados estarão salvos no Pen Drive e prontos para serem trabalhados no programa Excel. 7º passo: desligando o aparelho Após finalizadas as leituras das amostras e os dados salvos: 1. Voltar para o menu inicial no visor, clicando em Return (o aparelho questionará se pode limpar os seus dados, você pode dar Enter, uma vez que os dados já estão salvos); 2. Lavar novamente a mangueira com água destilada por um minuto ou até passar o volume de 50 ml no Wash (idem item 6 do 2º passo); 3. Secar a parte externa da mangueira com papel toalha; 4. Desligar o botão Power na lateral do aparelho; 5. Desligar o estabilizador; 6. Tirar o espectrofotômetro da tomada;
7. Soltar a mangueira pressionando o engate de metal no interior do compartimento da mangueira; 8. Cobrir com a capa a porção da mangueira que entra em contato com a amostra ; 9. Fechar a saída da mangueira; 10. Cobrir o aparelho com a capa protetora. IMPORTANTE: - JAMAIS PASSAR AMOSTRA CUJO SOLVENTE SEJA ACETONA OU ÁCIDO!! As mangueiras do sistema de fluxo não são adequadas para este tipo de químico e ressecam. O uso de álcool é permitido. Para utilizar com acetona e ácidos é necessário trocar as mangueiras por modelo indicado no manual do equipamento, que são de silicone especiais para estes solventes, as quais podem ser adquiridas no fornecedor do equipamento (empresa Micronal SP, telefone (11) 2163-5100, página www.micronal.com.br ou micronal@micronal.com.br). - Nunca descongele suas amostras sem antes conferir se a curva padrão está OK, caso contrário você poderá perder suas amostras. Em caso de dúvidas, visite a página do fabricante: http://www.scientific-instruments.de/pdf-uv-vis-spektroskopie/hitachi-u-2900.pdf
ANEXO 1 Descrição das teclas do equipamento.