Uso de procedimentos de estatistica na obtenção de resultados de toxicidade Dean Leverett Senior Scientist UK Environment Agency Science Biological Effects Measures Plano Resultados dos testes de toxicidade Que resultados? Teste Design Obtenção Resultados Valores de CE NOEC/ LOEC testes com concentração única 1
Testes de toxicidade Organismos expostos a químicos/ efluentes Respostas definidas e mensuráveis nos organismos expostos Resultados expressos em termos de percentagem de efeito para certas concentrações teste (mg/l químico ou % v/v efluente) Principios básicos de toxicologia Causa-efeito (dose-resposta) magnitude de efeito proporcional à quantidade de tóxico presente Efeitos quantificados são reproductiveis Resultados dos testes de toxicidade Abordagem baseada na Regressão CE 10 / 20 CE 50 concentração derivada estatisticamente que causa 10 / 20% de efeito concentração derivada estatisticamente que causa 50% de efeito Resultados dos testes de toxicidade Abordagem baseada na significância LOEC Mais baixa concentração com efeito observado derivada estatisticamente NOEC concentração sem efeito observado derivada estatisticamente MATC Maxima Concentração Limite Aceitável Média geométrica de NOEC e LOEC Diferença estatística directa (conc. vs controlo) Limite de toxicidade visualmente derivado da NOEC 2
Resultados dos testes de toxicidade Response 0.0 0.01 NOEC LOEC 1 Dose mg/l CE 10 =0.075 CE 20 =0.09 CE 50 =1 Quais os resultados requeridos? Teste com uma substância química = CE 50, NOEC & LOEC DTA Triagem de Toxicidade = Estimativa da concentração Sem Efeitos (Limite de Toxicidade) DTA Caracterização de toxicidade = Concentração Robusta Sem Efeitos (ex.:matc, CE 20, CE 50 x 0,3) Testes de uma única Concentração = diferença significativa? (ex.:t-test) Teste Design Tentativa de obter dados adequados ao objectivo Permitindo a obtenção dos resultados requeridos Obtenção do nível de confiança desejado dos resultados Importa considerar Nível de réplicas intra-tratamentos Número de concentrações teste Intervalo entre concentrações teste Intervalo total de concentrações 3
Teste Design Testes com substâncias Procura do Intervalo (poucas, intervalo alargado) Teste definitivo (poucas, intervalo adequado, 2 respostas parciais) DTA triagem (poucas, intervalo alargado, procura da ausência de efeito) DTA caracterização (muitas, intervalo alargado, procura de dados para obter concentração sem efeito) do Valor de CE Esquema de decisão para calcular valores de CE baseado na proporcionalidade de dados (EPA) do valor de CE Scenario 1 Scenario 2 Scenario 3 Effluent Number Cumulative Lethality Cumulative Lethality Cumulative Lethality concentration* of Tisbe number of (%) number of (%) number of (%) (%) battagliai dead dead dead exposed organisms organisms organisms Control 20 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 2 20 0 0 0 0 0 0 6 20 2 10 0 0 0 0 20 4 20 0 0 0 0 2.2 20 8 40 0 0 0 0 4.6 20 11 55 9 45 20 100 10 20 15 75 20 100 20 100 22 20 19 95 20 100 20 100 46 20 20 100 20 100 20 100 100 20 20 100 20 100 20 100 * Range of concentrations expressed as a percent of the effluent sample concentration. 4
do valor de CE Scenario Statistical procedure 48 h-lc 50 (%) Slope Value Confidence limits 1 Probit (Tox Calc) 3.3 2.3-4.6 1.8 Probit 3.3 2.8-3.8 1.8 Moving average 3.2 2.7-3.7 Binomial 3.6 1-10 2 Probit approach not valid Moving average approach not valid Binomial 4.8 2.2-10 Spearman-Karber (Tox Calc) 4.8 4.1-5.7 3 Geometric mean 3.2 Estimativa do valor de CE - método Probit Maximum Likelihood-Probit Control Chi-Sq Parameter Value SE 95% Fiducial Limits Critical P-value Mu Sigma Iter Slope 6.35263 681 2.95346 9.75181 0.03491 16.7597 7.81472 7.9E-04-151 5742 11 Intercept 1134 597 7.44093 14.1858 TSCR 0.05298 0.00994 0.02134 0.08462 Chi 2 = 16.7597 Valor Crítico = 7.81472 Response Chi 2 > Crítico Modelo sem ajuste estatístico significativo (heterogeneidade significativa) 0.0 0.01 1 Dose mg/l Estimativa do valor de CE - método Probit Maximum Likelihood-Logit Control Chi-Sq Parameter Value SE 95% Fiducial Limits Critical P-value Mu Sigma Iter Slope 12.2245 1.30289 8.07806 16.3708 0.03491 15.6257 7.81472 1.4E-03 25 Intercept 11.3314 1.30025 7.19347 15.4694 TSCR 0.05245 0.00962 0.02182 0.08307 0.0 Chi 2 = 15.6257 Valor Crítico = 7.81472 Chi 2 > Crítico Modelo sem ajuste estatístico significativo (heterogeneidade significativa) Response 0.01 1 Dose mg/l 5
Estimativa do valor de CE - método Probit Maximum Likelihood-Weibull Control Chi-Sq Parameter Value SE 95% Fiducial Limits Critical P-value Mu Sigma Iter Slope 6.22539 6803 5.30805 7.14274 0.03491 2.19545 7.81472 3 10 Intercept TSCR 5.1481 7637 4.21442 6.08178 0.04215 0.00437 0.0336 0.05071 Chi 2 Value = 2.19545 Valor Crítico = 7.81472 0.0 0.01 1 Chi 2 < Crítico modelo estatístico ajustável Response Dose mg/l dos valores de NOEC/ LOEC Esquema de decisão para o cálculodanoec/ LOEC baseado na proporcionalidade de dados (EPA) dos valores de NOEC/ LOEC Transform: Arcsin Square Root 1-Tailed Conc-mg/L Mean N-Mean Mean Min Max CV% N t-stat Critical MSD D-Dil 0.0500 0.0000 850 255 636 41.771 4 0.022 000 632 699 255 847 487 4 2.181 2.513 283 0.046 500 105 189 636 847 21.301 4 1.790 2.513 283 000 579 594 255 847 423 4 1.335 2.513 283 2 000 632 693 636 861 37.104 4 2.176 2.513 283 *6 000 789 910 847 1.1071 19.366 4 4.639 2.513 283 *1 500 211 351 847 861 13.697 4 3.445 2.513 283 *2.2 000 684 798 636 1.1071 44.627 4 3.022 2.513 283 *4.6 000 842 966 861 1.1071 12.807 4 5.447 2.513 283 Hipótese nula = tratamento não sig. > efeito positivo do que o controlo Probabilidade a 95% nível significância - Unidirecional (1-tail) sem interesse nos efeitos negativos 6
dos valores de NOEC/ LOEC Auxiliary Tests Statistic Critical Skew Kurt Shapiro-Wilk's Test 6636 12 3883 1004 indicates normal distribution (p > 0.01) Bartlett's Test indicates equal variances (p = 4) 6.06208 20.0902 Hypothesis Test (1-tail, 0.05) NOEC LOEC ChV MSDu MSB F-Prob df TU MSDp MSE Dunnett's Test 2 6 1812 5225 7391 9183 0.03413 3.1E-04 8, 27 Treatments vs D-Dil Dose-Response Plot 1 24 hr Immobilisation 1-tail, 0.05 level of significance 0 D-Dil 0.022 0.046 2 *6 *1 *2.2 *4.6 dos valores de NOEC/ LOEC Auxiliary Tests Statistic Critical Skew Kurt Shapiro-Wilk's Test 7283 78 1.52347 3.81877 indicates non-normal distribution (p <= 0.01) Bartlett's Test indicates unequal variances (p = 9.24E-06) 28.642 13.2767 Hypothesis Test (1-tail, 0.05) NOEC LOEC ChV TU Wilcoxon Rank Sum Test <0.056 0 Treatments vs D-Dil Dose-Response Plot 1 0 ****D-Dil 0.056 8 2 Proportion Abnormal Atenção! Tests com concentração única Esquema de decisão para o cálculo de diferenças estatisticas baseado na proporcionalidade de dados (EPA) 7
Single Concentration Tests Conc-% 1 2 3 4 5 6 D-Dil 0.0935 0.0244 0.0533 0.0407 0.0377 0.0594 X1268 165 169 268 0.0759 X1269 0.0571 392 0.0575 0.0632 X1270 0.0602 0.0583 576 0.0526 X1271 288 566 798 275 Transform: Arcsin Square Root 2-Tailed Conc-% Mean N-Mean Mean Min Max CV% N t-stat Critical MSD D-Dil 0.0515 0.0000 242 568 107 23.478 6 *X1268 090 0.0607 351 792 640 11.333 4 3.604 2.306 0.0710 X1269 0.0793 0.0293 800 414 824 24.477 4 X1270 0.0822 0.0324 829 315 082 29.654 4 X1271 482 019 942 651 379 8.852 4 Hipótese nula = sem diferenças sig. entre controlo & amostra Probabilidade a 95% nível de significância - 2-tail - interesse nos positivo & negativo Tests com concentração única Auxiliary Tests Statistic Critical Skew Kurt Shapiro-Wilk's Test 5155 81 644 7739 indicates normal distribution (p > 0.01) F-Test indicates equal variances (p = 3) 1.92128 45.3911 Hypothesis Test (2-tail, 0.05) MSDu MSB F-Prob df MSDp MSE Homoscedastic t Test indicates 0.03519 0.03702 0.02952 0.00227 0.00694 1, 8 significant differences Treatments vs D-Dil Dose-Response Plot 1 Proportion Abnormal 0 2-tail, 0.05 level of significance D-Dil *X1268 X1269 X1270 X1271 Bibliografia Practical Statistics for Field Biology - Jim Fowler & Louis Cohen (1990) Choosing & Using Statistics, A Biologist s Guide - Calvin Dytham (1999) 8
Obrigado 9