ESTUDO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E PERFIL QUÍMICO DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE Aniba parviflora A. C. F. de OLIVERA 1, G. F. da SILVA 1, 2, S. DUVOISIN Jr.¹ e P. M. ALBUQUERQUE¹ ¹ Universidade do Estado do Amazonas, Escola Superior de Tecnologia, Curso de Engenharia Química 2 Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Química E-mail para contato: dressacfo@gmail.com RESUMO A Aniba parviflora (Lauraceae) é uma planta aromática que produz metabólitos secundários com diversas funções biológicas, como atividade antioxidante. Neste trabalho foi realizado um estudo químico de extratos obtidos desta espécie, a fim de identificar os metabólitos responsáveis pela atividade antioxidante. Os extratos de A. parviflora foram preparados por partição líquido-líquido a partir dos extratos etanólicos brutos de folhas e galhos. Fez-se a triagem fitoquímica em todas as fases e extratos, e na sequência aplicou-se a cromatografia em camada delgada e a cromatografia em coluna aberta na fase hidroalcoólica de folhas, que apresentou maior atividade antioxidante e presença de flavonóides e/ou taninos. 74 frações foram obtidas com a cromatografia em coluna aberta utilizando sílica como fase estacionária, As frações obtidas foram comparadas e agrupadas, resultando em 6 frações. Em seguida, as seis frações foram submetidas à cromatografia líquida de alta eficiência. Verificou-se pelo método do DPPH que duas frações possuem maior potencial antioxidante (acima de 90%). Assim, a fase hidroetanólica das folhas desta espécie mostrou-se como a mais promissora em potencial para uso em alimentos, fármacos e cosméticos. 1. INTRODUÇÃO As plantas aromáticas possuem inúmeras atividades biológicas, tal como as mais de 2500 espécies da família Lauraceae, agrupadas em 49 gêneros, presentes principalmente nos trópicos e subtrópicos do sudeste asiático até o continente americano (Glimn-Lacy e Kaufman, 2006). A Aniba parviflora (Lauraceae), conhecida como macacaporanga, é uma árvore aromática (Pereira, 2010), de médio porte, que pode ser encontrada ao redor de igarapés da floresta amazônica ocidental, distribuída nas localidades de Santarém, Faro e médio rio Tapajós (Revilla, 2002). Algumas substâncias já foram isoladas desta espécie, como diidrometisticina, tetraidroiangonina e 3-metoxitetraidroiangonina (Kubitzki e Renner, 1982). Seu óleo essencial apresenta atividade anti-inflamatória e analgésica devido à presença de linalol, um dos componentes majoritários do seu óleo essencial (Pereira, 2010).
Ultimamente as plantas tem sido instrumento de diversas descobertas medicinais. Segundo Queiroz et al. (2014), nos últimos dez anos há um grande número de medicamentos úteis para doenças como o Parkinson, Gaucher, entre outras, sendo diretamente relacionados ao metabolismo secundário das plantas. Os metabólitos secundários presentes nas plantas possuem diversas funções, como por exemplo, os esteroides vegetais que podem ser benéficos ao ser humano como redutores do risco de doenças cardiovasculares; os flavonóides, que são polifenólicos com diversos efeitos biológicos, como atividade antioxidante; as saponinas, que apresentam propriedades detergentes e surfactantes; os taninos, que são compostos fenólicos que podem atuar como antissépticos, entre outras funções; e os alcaloides, compostos formados por um ou mais átomos de azoto, tendo em geral elevada toxidade e reconhecidas propriedades farmacológicas (Cunha, 2010). Sendo assim, os metabólitos secundários estão diretamente envolvidos nos mecanismos que fazem com que as plantas se adequem ao meio em que vivem, eles são importantes na área da farmacologia devido a seus efeitos biológicos sobre a saúde humana, alguns possuindo inclusive atividade antioxidante (Pereira e Cardoso, 2012). Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações em cadeia de oxidação (Antunes e Canhos, 1984). Alguns antioxidantes são capazes de desempenhar papéis importantes na eliminação dos radicais livres e prevenção de lesões celulares. Os principais compostos secundários relacionados à atividade antioxidante são os fenóis e flavonoides, porém outros ainda estão sendo pesquisados. Recentemente, estudos realizados por nosso grupo de pesquisa verificaram a presença de atividade antioxidante em extratos de folhas e galhos de macacaporanga (Batista et al., 2013; Batista, 2014; Oliveira et al., 2015). Portanto, o presente trabalho tem como proposta realizar análises fitoquímicas em extratos de A. parviflora a fim de correlacionar seus metabólitos secundários à atividade antioxidante. 2 METODOLOGIA 2.1 Obtenção dos Extratos Folhas e galhos finos de A. parviflora foram coletados na fazenda Experimental Curauá- PEMATEC, localizada no município de Santarém-PA, no período chuvoso, em 2012. O material vegetal foi macerado com álcool etílico de cereais 92,8 INPM em temperatura ambiente, sendo a extração realizada em três ciclos de 72 h, totalizando um período de nove dias, onde a cada 72 h o material vegetal foi filtrado e um novo solvente adicionado. Por fim, os filtrados foram submetidos ao rotaevaporador, até a retirada total do solvente (Silva, 2012). Uma fração do extrato bruto resultante foi dissolvido em etanol-água (1:3) e submetido à partição líquido-líquido, utilizando primeiramente o solvente hexano, seguido de diclorometano e acetato de etila. Após a partição obtiveram-se as fases solúveis em hexano,
diclorometano, e acetato de etila, as quais foram rotaevaporadas, e uma fração hidroalcoólica que foi liofilizada. 2.2 Triagem Fitoquímica Para fazer os testes fitoquímicos foram preparadas as soluções de cada partição (0,01 g/ml) e do extrato etanólico, tanto para folhas quanto para os galhos. Na sequência, a triagem fitoquímica foi feita segundo Matos (1997) para a verificação de esteroides, flavonoides, fenóis e taninos, saponinas e alcaloides. Esteroides: Colocou-se 2,0 ml da solução extrativa em 3 tubos de ensaio, adicionou-se 2,0 ml de clorofórmio em dois deles, em seguida foi feita a filtração em funil com algodão coberto com Na 2 SO 4, transferiu-se o filtrado para um tubo de ensaio completamente seco. Adicionou-se 1,0 ml de anidrido acético e agitou-se suavemente, em seguida, adicionou-se cuidadosamente, 3 gotas de H 2 SO 4 concentrado e agitou-se novamente. Flavonoides: transferiu-se para dois tubos de ensaio, 2,0 ml da mesma solução extrativa usada no teste anterior e acrescentou-se aproximadamente 0,5 cm de magnésio em fita, e 2,0 ml de HCl concentrado e aguardou-se efervescência. Fenóis e Taninos: Colocou-se 2,0 ml da solução extrativa preparada e adicionou-se três gotas de cloreto férrico (FeCl 3 ) em dois dos tubos de ensaio e observou-se a reação. Observou-se a coloração após a reação. Saponinas: Em 2,0 ml da solução extrativa em dois tubos de ensaio adicionou-se 2,0 ml de clorofórmio e 5,0 ml de água destilada. Em seguida a solução foi agitada energeticamente aproximadamente 15 segundos e observou-se se houve a formação de espuma. Alcaloides: Colocou-se 2,0 ml de solução extrativa em dois tubos de ensaio, adicionouse 15 gotas de NaOH 2 a 1% em seguida adicionou-se 2,0 ml de água e 2,0 ml de clorofórmio, separou-se a fração clorofórmica e adicionou-se 15 gotas de HCl a 1% e 2,0 ml de água, em seguida separou-se a fração aquosa acida e adicionou-se três gotas de reagente de Dragendorff e verificou-se se houve formação de precipitado ou turvação. 2.3 Métodos Cromatográficos Cromatografia em Camada Delgada (CCD): Para selecionar os solventes utilizados na cromatografia em coluna aberta, fez-se primeiramente a CCD, utilizando uma base de alumínio coberta por sílica gel. A amostra analisada foi a solução de fase hidroalcoólica de folhas de Aniba parviflora e o revelador utilizado foi metanol/ácido sulfúrico (4:1). Utilizaram-se os seguintes eluentes na fase móvel: acetona, acetato de etila/etanol (8:2), acetato de etila/etanol (1:1), acetona/etanol (1:1), acetona/etanol (8:2), etanol/acetona (8:2), metanol, metanol/ácido acético (8:2), metanol/água (8:2), metanol/ácido acético (1:1). Cromatografia em Coluna Aberta (CC): Utilizou-se 0,7925 g do extrato seco, usando sílica em gel (tamanho do poro 60Å, 35-70 µm) como fase estacionária e os solventes
utilizados como fase móvel foram modificados conforme o aumento da polaridade, sendo os que se mostraram eficientes na cromatografia em camada delgada. Foram recolhidas 74 frações da coluna cromatográfica, sendo analisadas por CCD para verificar as frações semelhantes, utilizando etanol como fase móvel. As frações semelhantes, foram unidas e secas, sendo utilizadas, na sequência, para análise da atividade antioxidante. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): Utilizou-se o cromatógrafo da marca Shimadzu modelo Promience com detector DAD (Diode Array Detector) e uma coluna Shimpack 2,0 mm ID x 100 mm, e acetonitrila/água como eluente (35:65). As amostras foram preparadas em balão volumétrico de 100 ml em acetonitrila com massa seca de cada fração igual a 50 mg. Assim que solubilizadas, cada amostra foi filtrada em filtro de 0,45 m e injetada no equipamento. 2.4 Avaliação da Atividade Antioxidante Para avaliar a atividade antioxidante foi utilizado o método do radical livre DPPH (2,2- difenil-1-1picril-hidrazila), que consiste na avaliação da capacidade de sequestrar o DPPH, que possui absorção máxima em 517 nm. Na presença de um antioxidante ou de uma espécie radicalar, o DPPH é reduzido, formando difenil-picril-hidrazina, e a solução a ser analisada muda da cor púrpura para amarela. A metodologia utilizada neste estudo foi descrita por Brand-Williams et al. (1995) e modificada por Silva (2012). As soluções foram preparadas com a amostra solubilizada em metanol (1280 mg/ml) e na sequência fez-se diluições sucessivas em progressão geométrica com razão igual a 0,5 e o metanol foi utilizado como solvente, sendo diluídos em microtubos até a concentração de 5,0 g/ml. A solução de DPPH foi preparada a 0,06 mol/l e foi envolvida em papel alumínio para ser protegida da exposição luminosa. O padrão utilizado foi o ácido ascórbico, o qual foi diluído em metanol (800 g/ml). Na sequência fez-se 7 diluições e obteve-se as concentrações finais iguais a 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50 e 0 g/ml para que fosse possível construir as curvas analíticas. Para o ensaio da atividade antioxidante transferiu-se 50 L de cada concentração da amostra teste para tubos de ensaio, em triplicata, e na sequência adicionou-se 1950 L da solução de DPPH e esperou-se 30 minutos de reação, verificou-se a absorbância em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 517 nm. Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição de DPPH, a partir da Equação 1, e por meio de regressão linear determinou-se a Concentração Eficiente (CE 50 ), que é a concentração de amostra necessária para o sequestrar de 50% dos radicais livres (Silva, 2012). AA% = x 100 (1)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Triagem Fitoquímica Os testes químicos qualitativos são rápidos e de baixo custo, sendo utilizados, neste trabalho, para conhecer a composição dos extratos etanólicos de folhas e galhos de A. parviflora e de suas fases. Os resultados dos ensaios fitoquímicos realizados para identificar as classes de metabólitos secundários presentes nesta planta estão expressos na Tabela 1. Tabela 1 - Testes fitoquímicos dos extratos e fases particionadas de Aniba parviflora Amostras Esteróides Flavonóides Taninos Saponina Alcaloides EEF - + + - - EEG + - + + - FHXF + - - + - FHXG - - - + + FDCMF + - - - - FDCMG - - - - + FACETF - + + - - FACETG + - + - + FHAF + + + - - FHAG - - + + + EEF = Extrato etanólico de folhas, EEG = Extrato etanólico de galhos, FHXF = Fase hexânica de folhas, FHXG = Fase hexânica de galhos, FDCMF = Fase diclorometano de folhas, FDCMG = Fase diclorometano de galhos, FACETF = Fase acetato de etila de folhas, FACETG = Fase acetato de etila de galhos, FHAF = Fase hidroalcoólica de folhas, FHAG = Fase hidroalcoólica de galhos. Devido à coloração verde quando o teste para análise de taninos foi feito, entende-se que estes são taninos condensados. No extrato das folhas também se identificou a presença de esteroides, a partir da coloração verde observada após a reação. No extrato dos galhos identificaram-se além dos taninos, saponina e alcaloides, já que após a reação observou-se formação de espuma e precipitado com a coloração vermelho tijolo, respectivamente. Todos os resultados foram confirmados segundo metodologia descrita por Barbosa (2001) e Matos (1997). Segundo Batista et al. (2013) a fase hidroalcoólica de folhas de A. parviflora tem o melhor potencial antioxidante quando comparado com as demais fases e extratos etanólicos, sendo 2,38 vezes menor que o padrão utilizado, ácido ascórbico. Segundo Pereira e Cardoso (2012), tal atividade provavelmente está associada à presença de taninos e flavonóides, ambos compostos fenólicos, conhecidos por possuírem propriedades antioxidantes. Como verificado por Oliveira et al. (2015) a FHAF de A. parviflora também foi eficiente na captura do radical livre ABTS.
3.2 Métodos Cromatográficos e Atividade Antioxidante As 74 frações obtidas por cromatografia em coluna aberta do extrato etanólico de folhas foram recolhidas e, após análise por CCD, foram unidas, conforme sua semelhança química, resultando em seis frações. As seis frações foram submetidas à análise por cromatografia líquida de alta eficiência e à avaliação de atividade antioxidante. Os resultados obtidos para as seis frações em relação à atividade antioxidante estão expressos na Tabela 2. É possível observar que as frações 3 e 5 se mostraram as mais promissoras, pois apresentam as maiores porcentagens de inibição do radical livre DPPH e as menores concentrações efetivas. Tabela 2 Análise de atividade antioxidante das frações de Aniba parviflora Amostras CE 50 % de inibição do radical livre DPPH ± desvio padrão da média Fração 1 1.866,66 37,67% ± 15,40 Fração 2 1.210,94 51,82% ± 6,47 Fração 3 202,60 91,84% ± 0,48 Fração 4 1.205,68 53,15% ± 13,55 Fração 5 247,66 90,60% ± 0,21 Fração 6 4.310,79 13,67% ± 2,49 Ácido Ascórbico 170,91 94,26% ± 0,11 Na Tabela 2 verifica-se que a inibição de DPPH foi maior na presença das frações 3 e 5, sendo igual a 91,82% e 90,60% respectivamente. Por meio de regressão linear foram determinados os valores de CE 50 do ácido ascórbico (170,91 g/ml) e das frações obtidas por cromatografia em coluna aberta, sendo a fração 3 apenas 1,2 vez menos eficiente que o ácido ascórbico, com CE 50 igual a 202,6 g/ml, e a fração 5 apenas 1,5 vez menos eficiente que o padrão, com CE 50 de 247,66 g/ml. Na Figura 1 estão apresentados os cromatogramas obtidos para as frações 3, 4 e 5. A B Figura 1 Cromatogramas das frações 3 e 4 (A) e 4 e 5 (B).
Analisando o cromatograma A, verifica-se que existe a possibilidade de que a substância destacada (tempo de retenção = 17,55 min) seja a responsável pela atividade antioxidante da fração 3, pois a fração 4 não possui a mesma substância e também não apresenta bom potencial antioxidante (CE 50 de 1.205,68 g/ml). Entretanto, o isolamento desta substância deverá ser realizado e a atividade antioxidante analisada, a fim de se confirmar se esta é a molécula bioativa. No cromatograma B não se observam os mesmos picos da fração 3, então supõe-se que a substância responsável pela atividade antioxidante da fração 5 seja diferente da presente na fração 3. A separação das substâncias presentes nessa fração torna-se necessário, a fim de se conhecer a molécula detentora da atividade de interesse. 4. CONCLUSÕES Os resultados indicaram que a fase hidroalcoólica do extrato etanólico de folhas de A. parviflora possui bom potencial antioxidante. Foi possível separar duas frações que contêm substâncias com alta atividade antioxidante, com valores de CE 50 próximos ao do ácido ascórbico e alta porcentagem de inibição de radicais livres. A continuidade dos estudos com estas frações se faz necessário, a fim de que seja possível identificar as moléculas bioativas. A partir da análise fitoquímica foi possível correlacionar a atividade antioxidante da fase hidroalcoólica de folhas de A. parviflora com a presença dos metabólitos secundários taninos e/ou flavonoides. Dessa forma, verifica-se com este trabalho que a espécie A. parviflora mostra-se promissora para ser utilizada nas indústrias farmacêutica, de alimentos e cosmética, como agente antioxidante. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à CAPES e à FAPEAM pelo suporte financeiro, e à EST/UEA pela infraestrutura concedida para a realização deste trabalho. 6. REFERÊNCIAS ANTUNES, A. J; CANHOS, V. Aditivos em Alimentos. Campinas: Editora da UNICAMP, 1984. BARBOSA, W. L. R.; QUIGNARD, E.; TAVARES, I.C.C.; PINTO, L.N.; OLIVEIRA, F.Q.; OLIVEIRA, R.M. Manual para análise fitoquímica e cromatográfica de extratos vegetais. Universidade Federal do Pará, Belém, 2001.
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