Estudantes do Programa de Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá.

Extração de DNA e RNA de fígado e músculo em tilápia do Nilo Extraction of DNA and RNA from liver and muscle in Nile tilapia Extracción de ADN y ARN de hígado y músculo en tilapia del Nilo Eliane Gasparino 1, Fernanda Tanamati 2, Ariane Gomes Salles Tiburcio 3, Stefania Caroline Claudino da Silva 2, André Luiz Seccatto Garcia 4 e Angélica de Souza Khatlab 4 Resumo Na tilapicultura, os estudos em genética molecular têm se tornado cada vez mais importantes, havendo a necessidade de obtenção de protocolos funcionais para cada tecido. Foram utilizadas amostras de músculo e fígado de tilápias do Nilo, e adaptados protocolos para extração de DNA (para músculo e fígado) e RNA (para fígado). Para a extração de DNA do fígado houve a redução do tempo em banho-maria (de 12 para duas horas). Para a extração de DNA de fígado foram alteradas as seguintes etapas: redução do tempo em banho-maria (de 12 para duas horas), utilização de pequena fração de amostra inteira (sem maceração) e adição de uma etapa de decantação. Para a extração de RNA de fígado, a utilização de amostra macerada sugerida pelo protocolo foi substituída por uma pequena fração de amostra inteira. As adaptações de protocolo de extração de DNA de fígado e músculo e de extração de RNA de fígado em tilápias do Nilo foram apropriadas gerando boa relação de absorbância (A260/A280), e material genético de boa qualidade para análises subsequentes. Palavras-chave: Oreochromis niloticus, ácidos nucleicos, extração, protocolo 1 Professora do curso de Graduação em Zootecnia e Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá. 2 Estudantes do Programa de Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá. 3 Estudante de Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa. 4 Estudantes de Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá. Autora para correspondência: Stefania Caroline Claudino da Silva. E-mail: stefania_caroline@hotmail.com 385

Abstract In tilapia culture, molecular genetics studies have become increasingly important, with the need for obtaining functional protocols for each tissue. Samples of muscle and liver of tilapia were used and adapted protocols for DNA extraction (for muscle and liver) and RNA (for liver). For the extraction of DNA from the liver, the time of water bath was reduced (from 12 to two hours). For the extraction of DNA from the liver the following steps were changed: reducing time in the water bath (from12 to two hours), using a small fraction of the entire sample (without maceration) and adding a step of decantation. For extraction of RNA from liver, using the protocol suggested by the macerated sample was replaced by a small fraction of the entire sample. Alterations of DNA extraction protocol liver and muscle and liver RNA extraction in Nile tilapia were appropriate generating a good absorbance ratio (A260/A280), and good quality genetic material for subsequent analysis. Key words: Oreochromis niloticus, nucleic acids, extraction, protocol Resumen En el cultivo de Tilapia, los estudios en genética molecular se han convertido cada vez más importantes, viendo la necesidad de obtener protocolos funcionales para cada tejido. Fueron usadas muestras de músculo e hígado de tilapias del Nilo, y adaptados protocolos para extracción de ADN (para músculo e hígado) y ARN (para hígado). Para la extracción de ADN del hígado hubo una reducción del tiempo en el baño maría (de 12 para dos horas). Para la extracción de ADN de hígado fueron alteradas las siguientes etapas: reducción del tiempo en el baño maría (de 12 para dos horas), utilización de un pequeño fragmento de la muestra entera (sin maceración) y se agregó una etapa de decantación. Para la extracción de ARN de hígado, la utilización de la muestra macerada sugerida por el protocolo fue sustituida por un pequeño fragmento de la muestra entera. Las adaptaciones del protocolo de extracción de ADN de hígado y músculo y la extracción de ARN de hígado en tilapias del Nilo 386

fueron apropiadas generando buena relación de absorbancia (A260/A280), y buena calidad del material genético para análisis posteriores. Palabras clave: Oreochromis niloticus, ácidos nucleicos, extracción, protocolo Introdução Na tilapicultura, estudos em genética molecular têm se tornado cada vez mais importantes, uma vez que possibilitam estudos aprofundados de genes ligados a características de interesse econômico. Diversos são os protocolos existentes para o isolamento de DNA de peixes, sendo poucos os que fornecem DNA de boa qualidade e utilizam o DNA de tecidos sólidos 1. Embora já existam diferentes protocolos funcionais para diferentes tecidos, ainda surgem problemas relacionados à extração de DNA e RNA que demandam tempo e recursos financeiros para serem solucionados. A boa qualidade do DNA é essencial para se obter bons resultados em experimentos, especialmente no uso da reação da polimerase em cadeia (PCR), onde impurezas podem inibir o processo de amplificação 2. A obtenção de RNA de boa quantidade e em qualidade é fundamental para análises moleculares, como expressão gênica (qrt-pcr) ou preparação de bibliotecas de cdna. A maioria dos métodos de extração de RNA encontrados na literatura é baseada em precipitação por guanidina e fenol 3, sendo que estes geralmente levam em consideração o tecido alvo em detrimento da espécie animal, podendo haver necessidade de adaptações em caso de espécies muito divergentes. Um importante aspecto a ser avaliado para a extração de RNA é a composição tecidual. Alguns tecidos específicos apresentam problemas particulares, tais como elevado conteúdo de lipídio, além da presença de inibidores potencias. Outro fator importante a ser considerado é o nível de homogeneização da amostra, que é dependente de sua composição, 387

sendo que tecidos mais resistentes, como músculo, requerem mais homogeneização do que tecidos menos densos, como o fígado 4. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi adaptar protocolos para a extração de DNA e RNA de fígado e de DNA de músculo de tilápia do Nilo. Material e métodos Foram utilizadas amostras de tecido muscular e de fígado de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus), armazenadas em nitrogênio líquido e em freezer -80 C. Para a extração de DNA utilizou-se como base a metodologia descrita por Bardakci & Skibinski 5. Para a extração de RNA utilizou-se como base a metodologia recomendada pelo fabricante do reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Extração de DNA de músculo Uma amostra de aproximadamente 30mg foi acondicionada em microtubos (1,5mL), e adicionados 550 µl de tampão de lise, (50 mm de Tris-HCl, 50 mm de EDTA, 100 mm de NaCl e 1% de SDS), 30 µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) e 10 µl de proteinase K (200 µg ml -1 ). As amostras foram incubadas em banho-maria a 50ºC e retiradas após 2 horas. Acrescentou-se então 600 µl de solução de NaCl (5M) com posterior homogeneização e centrifugação por 15 minutos a 12.000 rpm. Em seguida, 800 µl de sobrenadante foram transferidos para novos microtubos, precipitado com 700 µl de álcool etílico absoluto gelado e incubado por uma hora a -20ºC. A amostra foi novamente centrifugada por 15 minutos a 12.000 rpm, descartado o sobrenadante, e o pellet de DNA seco a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. O pellet foi ressuspendido em 70 µl de TE (10 mm de Tris ph 8,0 e 1 mm de EDTA), levado ao banhomaria a 37ºC por uma hora e em seguida estocado no freezer a - 20ºC. 388

Extração de DNA de fígado Para a extração de DNA do fígado, uma amostra de aproximadamente 30 mg foi acondicionada em microtubos (1,5mL), e adicionados 550 µl de tampão de lise, 30 µl de SDS, 10 µl de Proteinase K, e incubados em banho-maria à 50 C por 2 horas. Em seguida, 600 µl de NaCl (5M) foram adicionados às amostras, que foram homogeneizadas e centrifugadas por 15 minutos a 12.000 rpm. Em seguida, 800 µl do sobrenadante foram transferidos para um novo microtubo, adicionando 700 µl de etanol absoluto gelado e mantido em repouso por 20 minutos à temperatura ambiente, para a decantação. Foram retirados 500 µl do sobrenadante, dando início novamente ao protocolo, adicionando na sequência 550 µl de tampão de lise, 30 µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) e 10 µl de proteinase K (200 µg ml -1 ). As amostras foram levadas ao banhomaria a 50ºC por uma hora; depois de retiradas, foram adicionados 600 µl de solução de NaCl (5 M), homogeneizadas e centrifugadas por 15 minutos a 12.000 rpm. Em seguida, 800 µl do sobrenadante foram transferidos para um novo microtubo, adicionando 700 µl de etanol absoluto gelado, e incubado por uma hora a -20 ºC. Após isso, realizou-se nova centrifugação por 15 minutos a 12.000 rpm, descartou-se o sobrenadante e o pellet de DNA seco a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. O pellet foi ressuspendido em 70 µl de TE (10 mm de Tris ph 8,0 e 1 mm de EDTA), levado ao banho-maria a 37ºC por 40 minutos e estocado no freezer a -20 ºC. A concentração do DNA total foi determinada por espectrofotometria a 260 nm e a qualidade determinada pelas razões A260/A280. As amostras de DNA (músculo e fígado) foram diluídas em TE para uma concentração de 20 ng/µl e a integridade do DNA verificada por eletroforese em gel de agarose a 0,8%, revelada com 0,5 µg/ml de brometo de etídio. A eletroforese foi conduzida em 100 volts por 60 minutos em cuba horizontal, usando tampão TBE 389

0,5X (500 mm de Tris-HCl, 60 mm de ácido bórico e 83 mm de EDTA), e a imagem capturada por um sistema da L-pix (Loccus biotecnologia). Para a validação dos protocolos de extração de DNA no músculo e fígado foram realizadas amplificações através da técnica de PCR utilizando primer específico de β-actina. Extração de RNA de fígado Para a extração de RNA, uma amostra de aproximadamente 30 mg foi acondicionada em microtubos (1,5 ml), com adição de 750 µl de Trizol, adaptando o sugerido pelos fabricantes (1 ml/100 mg de tecido). Foram adicionados 250 µl de água ultra pura com posterior homogeneização em vortex, seguido de 5 minutos à temperatura ambiente. A seguir foram adicionados 200 µl de clorofórmio, com nova homogeneização em vortex e repouso a temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12.000 rpm, transferidos 500 µl de sobrenadante a um novo microtubo, e adicionados 500 µl de álcool isopropílico, deixando-as por 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm, por 10 minutos, descartado o sobrenadante, restando apenas o pellet. Este foi lavado com 1 ml de etanol 75% até se desprender do fundo do microtubo e transportado para a centrifuga por 10 minutos a 12.000 rpm. Após a centrifugação, o pellet foi seco por aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente e 100 µl de água ultra pura foi acrescentado para estocagem. A concentração do RNA total foi determinada por espectrofotometria a 260 nm, a qualidade determinada pelas razões A260/A280. A integridade do RNA total foi verificada por eletroforese em gel desnaturante de agarose 0,8 % (tampão MOPS 1X [0,02 M de ácido 3- propaneusulfonico, 0,005 M de acetato de sódio e 0,001 M EDTA] e 2,5 % de formaldeído). Para a visualização foram utilizados 5, 10 e 15µL de RNA em tampão de 390

carregamento, revelado com 0,5 µg/ml de brometo de etídio, sendo a eletroforese conduzida em 100 volts por 60 minutos em cuba horizontal, usando tampão TBE 0,5X e a imagem capturada por um sistema da L-pix (Loccus biotecnologia). Para o teste de validação do protocolo foi utilizado primer específico de β actina e análise de qrt-pcr. Resultado e discussão Para a extração de DNA de músculo, a principal modificação realizada foi a redução do banhomaria de 12 horas do protocolo original para 2 horas, tornando mais rápido o procedimento de extração sem alterar a qualidade e quantidade do DNA total extraído. O protocolo utilizado neste experimento consistiu em uma adaptação ao protocolo de Bardakci & Skibinski 5, além da substituição de fenol-clorofórmio por solução salina 6. Outros autores também observaram bons resultados de extração de DNA em Jundiá (Rhamdia quelen) 7 com a utilização de um protocolo com substituição de fenol-clorofórmio por solução salina em músculo, entretanto, com tempo de 12 horas de banho-maria. Bardakci & Skibinski 5 utilizaram amostras de nadadeira caudal cortadas em pequenos fragmentos para a extração de DNA. Neste trabalho, as amostras de músculo foram submetidas à extração em duas formas distintas, inteiras ou maceradas formando pequenos fragmentos. As amostras maceradas se mostraram aparentemente mais sujas durante o processo, entretanto, a razão das absorbâncias (Tabela 1) demonstrou pouca diferença entre os resultados de razão A260/A280 entre as amostras inteiras ou fragmentadas. Os valores de absorbância evidenciam ainda que amostras inteiras promoveram não só uma menor liberação de resíduos (A280), mas também reduziram a quantidade de material genético (A260). 391

Tabela 1: Valores de absorbância obtidos na quantificação de DNA e a razão AMOSTRAS A260 A280 A260/A280 Músculo macerado Músculo inteiro 0,1558 0,0867 0,0409 0,0227 1,7970 1,8017 A integridade do DNA e RNA total foi verificada por eletroforese em gel de agarose 0,8% (Figura 1), comprovando a eficiência dos três protocolos testados. Figura 1: Gel de desnaturante de agarose: canaleta 1 e 2 - Músculo inteiro (DNA); canaleta 3 e 4 Fígado inteiro (DNA); canaleta 5 e 6 Fígado inteiro Em experimentos anteriores com a utilização de amostras de fígado de tilápia do Nilo observou-se a formação de grumos durante o processo de extração de RNA utilizando protocolos obtidos na 392

JBCA Jornal Brasileiro rasileiro de Ciência Animal 2012 5 (10): 385 3 396. literatura, e de uma película de DNA utilizando o protocolo aparência gordurosa na extração de Bardakci & Skibinski (Figura 2). de Figura 2: Amostras com formação da película de gordura sobre a solução. A seta indica a película de gordura. Para a extração de DNA do anteri no descrito no protocolo anterior, fígado, assim como no músculo, intuito de precipitar esta película. houve redução permanência do das tempo de Após amostras em sobrenadante foi transferido para banho-maria de 12 para 2 horas. esta decantação decantação, o um novo microtubo, reiniciando o procedimento de extração. Além Para aparência que a película gordurosa de não prejudicasse o processo, processo uma etapa de 20 minutos de decantação foi adicionada em substituição a ao tempo de 1 hora no freezer a -20 C destas modificações, a duração do segundo banho-maria maria à 37 C foi reduzida para 40 minutos, minutos e testes entre amostras inteiras e maceradas também foram realizadas, como nas amostras de músculo.. 393

As razões de absorbância entre as amostra de fígado inteiro e macerado mostram melhores resultados para as amostras inteiras (Tabela 2). Tabela 2: Valores de absorbância obtidos na quantificação de DNA e a razão AMOSTRAS A260 A280 A260/A280 Fígado macerado 0,0167 0,0105 1,5905 Fígado inteiro 0,0129 0,0068 1,8970 Os valores de absorbância a 280nm sugerem ainda maior liberação de resíduos nas amostras maceradas, podendo prejudicar futuros processos. Para o processo de extração de RNA de fígado foi utilizado como base o protocolo indicado pelos fabricantes de Trizol. Neste protocolo, os fabricantes indicam a maceração da amostra para melhorar o contato com o reagente. Entretanto, logo após a etapa de precipitação observou-se a formação de grumos de aspecto gorduroso em todo o sobrenadante, e não apenas na superfície como observado na extração de DNA do fígado. Assim como na extração de DNA do fígado, uma etapa de decantação foi proposta na tentativa de eliminar os grumos (possivelmente proteína), entretanto, para a extração de RNA essa etapa não foi bem sucedida, ocorrendo o surgimento de novos grumos assim que o protocolo foi reiniciado. Os fabricantes do Trizol sugerem ainda a adição de uma etapa extra de isolamento para amostras com alto conteúdo de proteínas, gordura, polissacarídeos ou material extracelular, geralmente observados em tecido muscular e tecido gorduroso, entretanto, após a adição desta etapa extra de 394

isolamento, ainda se observou a formação dos grumos de aspecto gorduroso. proporcionou o não surgimento dos grumos, e melhores valores de absorbância (Tabela 3). A substituição de amostras maceradas por uma amostra inteira Tabela 3: Valores de absorbância obtidos na quantificação de RNA e a razão AMOSTRAS A260 A280 A260/A280 Fígado macerado 0,223 0,1521 1,4661 Fígado inteiro 0,241 0,1472 1,6372 A utilização de amostra inteira em substituição às maceradas promoveu melhores resultados de concentração (260nm) e qualidade (A260/A280) do material genético, além de diminuir as concentrações de resíduos na amostra (280nm). Os testes de validação realizados (primer específico de β actina e análise de PCR para DNA e qrt-pcr para RNA) confirmaram a eficiência das modificações realizadas, podendo estas serem aplicadas em outros trabalhos. Conclusão As adaptações feitas nos protocolos originais apresentaram resultados satisfatórios tanto para a extração de DNA e RNA de fígado quanto para extração de DNA de músculo em amostras oriundas de tilápia do Nilo. 395

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