Noções Básicas de Seqüenciamento Genético Maria do Carmo Debur LACEN/PR
Determinar a seqüência de nucleo3deos do DNA
Métodos Clássicos 1976 Allan Maxam e Walter Gilbert (EUA) Método da Degradação Química (Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleo9deos específicos) 1977 F. Sanger e A.R. Coulson (Reino Unido) Método enzimáqco, dideóxi ou do término da cadeia (Síntese enzimá@ca de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleo9deo)
Método de Sanger
Método de Sanger Animação
Seqüenciamento X PCR Sequenciamento: Amplificação linear Um primer dntps e ddntps PCR: Amplificação exponencial Dois primers dntps
Método de Sanger - MANUAL
GATTCGAGCTGddA GATTCGddA GddA +ddctp GATTCGAGddC GATTddC +ddgtp GATTCGAGCTddG GATTCGAddG GATTCddG ddg +ddttp GATTCGAGCddT GATddT GAddT
Método de Sanger - AUTOMATIZADO
Método de Sanger - AUTOMATIZADO
Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR 20 100 µm interno
Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR Os ácidos nucléicos migram para o ânodo, pois em ph neutro sua carga é nega@va
Método de Sanger AUTOMATIZADO ELETROFORESE CAPILAR A separação das fitas de DNA é dependente: Tempo de migração, Temperatura, Força iônica do tampão, Intensidade do campo elétrico, Viscosidade do meio.
Quais os passos necessários
SEQUENCIAMENTO O que seqüenciar? Produto de PCR Clone
PURIFICAÇÃO DNA
PURIFICAÇÃO DNA
QUANTIFICAÇÃO DO DNA
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO Reagent es BigDye QuanQda de 8 µl Mix Primer 4 µl (3,2 Água pmol) q.s.p. 20 DNA µl 5 µl
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO Reagent es BigDye QuanQda de 8 µl Mix Primer 4 µl (3,2 Água pmol) q.s.p. 20 DNA µl 5 µl
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO TERMOCICLAGEM: Inicial: 96ºC 1 min 25 40 ciclos Desnaturação: 96ºC 15 seg Anelamento: 50ºC 15 seg Extensão: 60ºC 4 min Final: 4-10ºC infinito Rampa: 1ºC/seg para facilitar o anelamento do primer
PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO G A A G T C C T T G G C T A A C C C A C A Isopropanol 70% Etanol/EDTA/Acetato de sódio Kit BigDye X- Terminator
PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG G ATGCTTCTGGC G ATGCTTCTGGCA T C A ATGCTTCTGGCAG A ATGCTTCTGGCAGA T T C C C ATGCTTCTGGCAGAT G ATGCTTCTGGCAGATC G C ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG C T A ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA C ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA A ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT A Isopropanol 70% Etanol/EDTA/Acetato de sódio Kit BigDye X- Terminator
SEQUENCIAMENTO
Dado Bruto
Analisando o Cromatograma
O que fazer com estes dados????
Para conhecimento...