RTS110 Aspergillus ssp Q PCR Alert Kit

RTS110 Aspergillus ssp Q PCR Alert Kit 1) DESCRIÇÃO DA FINALIDADE OU USO DO PRODUTO O kit é ASPERGILLUS Q-PCR Alert Kit faz parte de um teste de amplificação quantitativa de ácidos nucleicos para a detecção e dosagem do DNA de Aspergillus spp. em amostras de DNA extraídas de lavado bronco-alveolar e aspirado brônquico. O teste pode identificar e dosar o DNA das seguintes espécies do genero Aspergillus: Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Aspergillus glaucus. O produto é para ser usado junto com dados clínicos e outros testes de laboratórios, no diagnóstico da infeção de Aspergillus spp. 2) PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO DO PRODUTO: base científica, explicação da metodologia, técnicas e reações envolvidas O procedimento envolve uma reação de amplificação em Tempo Real em microplaca em um equipamento com termostato programável fornecido com sistema óptico de detecção fluorescente (RT-PCR = termociclador em tempo real). Em cada poço, uma reação de amplificação específica é executada para uma região do gene rdna 18S de Aspergillus spp. (presente em cópia múltipla no genoma do fungo) e para uma região do gene da betaglobulina humana (com controle interno da amostra) utilizando o DNA extraído de amostras em teste. Uma sonda específica para Aspergillus, marcada com o fluoróforo FAM, é ativada quando hibridizada com o produto específico da reação de amplificação para Aspergillus spp. Uma outra sonda específica para o gene da betaglobulina humana marcada com o fluoróforo VIC, é ativada quando hibridizada com o produto da reação de amplificação para o gene da betaglobulina humana. A emissão da fluorescência aumenta com o aumento do produto específico da reação de amplificação e é medido e registrado pelo aparelho. O processo dos dados determina a presença e título de DNA de Aspergillus spp. na amostra inicial. A partir do momento que a probe TaqMan for ligada à parte específica do gabarito de DNA depois da desnaturação (alta temperatura) e resfriamento da reação, os primers anelam-se ao DNA. A TaqPolimerase então adiciona nucleotídeos e remove a probe TaqMan do DNA gabarito. Isso separa o 1

quencher do reporter, e permite ao reporter emitir sua energia. Isso é, então, quantificado usando um computador. Quanto mais ocorrer a desnaturação e anelamento, mais oportunidades a TaqMan terá de se ligar, e em contra partida, mais luz emitida será detectada. O corante do reporter é liberado da dupla-fita de DNA criada pela Taq Polimerase. Longe do corante quencher, a luz emitida do corante reporter dye em estado excitado pode agora ser observada. A padronização do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM série 7000. 3) COMPONENTES FORNECIDOS COM O PRODUTO: especificações ou características qualitativas ou quantitativas O kit vem completo com os seguintes componentes: Componente Descrição Quantidade Composição Aspergillus ssp Q-PCR Alert AmpliMIX - RTS110-M Mistura de primers de oligonucleotídeos 4 x 110 µl Oligonucleotídeos, TRIS (base e cloridrato), Glicerol, Triton X-100 Aspergillus ssp Q-PCR Alert AmpliPROBE - RTS110-P Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB-NFQ e com VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl Oligonucleotídeos fluorescentes, TRIS (base e cloridrato), Glicerol, Triton X-100 Q-PCR Alert AmpliMASTER - RTS000 Mistura de reagentes optimizados 4 x 340 µl Microplaca com 96 pocinhos de 0,2 ml TRIS (base e cloridrato), Glicerol, MgCl 2, Desoriboxinucleotídeos trifosfatos, ROX, Uracil-Nglicosilase, Taq DNA polimerase hot start 3 Plástico PP Lâmina adesiva vedante 3 Plástico e cola 4) RELAÇÃO DE TODOS OS MATERIAIS, ARTIGOS, ACESSÓRIOS, INSUMOS OU EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS, PARA USO COM O PRODUTO Equipamentos necessários, mas não fornecidos: - Capela de fluxo laminar. - Agitador tipo Vortex. - Microcentrífuga de mesa (12.000-14.000 RPM). - Micropipetas simples, volume variável. - Real Time ABI PRISM 7000, completo com microcomputador. 2

Material de Consumo: - EPI - ponteiras com filtro - Água ultra-pura - tubos de microcentrifugação (1.5mL a 2.0mL) Amostras: - DNA extraído por metodologia definida pelo usuário, seguindo as normas e padrões de amostras exigidos na descrição abaixo. 5) CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO Componente Referência modelo Quantidade Estocagem Aspergillus ssp Q-PCR Alert AmpliMIX RTS110-M 4 x 110 µl -20 C Aspergillus ssp Q-PCR Alert AmpliPROBE RTS110-P 4 x 110 µl -20 C Q-PCR Alert AmpliMASTER 4 x 340 µl + 2 / +8 C Microplaca para amplificação RTS000 3 RT Lâmina adesiva para amplificação 3 RT 6) PRECAUÇÕES E ESCLARECIMENTOS SOBRE RISCOS COM O USO DO PRODUTO Este kit é reservado para uso exclusivo em diagnóstico in vitro. Manuseio: ao manusear o kit e as amostras é necessário utilizarepi adequado ao tipo de laboratório onde os testes serão realizados, devido à natureza da amostra material biológico humano. Tratar como materiais potencialmente infecciosos por serem amostras de origem humana. Não beba ou coma na área de trabalho. A área de tarbalho deve ser ambiente limpo e com ventilação adequada. Deve se trabalhar dentro de capela de exaustão/fluxo Laminar. Não manuseie o kit sem luvas. a) Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas, reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas. Evitar a formação de aerossol durante o procedimento evite respingar material ao redor da área de trabalho ou fora dela. O material que está em contato com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% por, pelo menos, 30 minutos ou, ainda, tratado em autoclave a 121 C durante uma hora, antes de ser eliminado. O material descartável, caso seja combustível, deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contêm ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Lavar bem as mãos após de manipular as amostras e os reagentes. Eliminar reagentes e resíduos conforme as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar as instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não utilizar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. b) Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para evitar o risco de 3

resultados incorretos, especialmente por causa da degradação dos ácidos nucleicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e pós-pcr). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de biologia molecular. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas sob uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira/filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela área de trabalho. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira/filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse e sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo sua dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua área de trabalho. c) Advertências e precauções específicas para os componentes A ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX, ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliPROBE, ASPERGILLUS STANDARD, Q-PCR Alert AmpliMASTER, apresentam as seguintes advertências (S): S 23-25. Não respirar vapores/aerossol. Evitar o contato com os olhos. Observações importantes: Os tubos que contêm o ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX e o ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliPROBE são descartáveis e, portanto, devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reação. Os tubos que contêm o ASPERGILLUS STANDARD não podem ser congelados e descongelados por mais de 8 vezes. Ciclos repetidos de congelamento/descongelamento podem causar perda na titulação. Os tubos que contêm o Q-PCR Alert AmpliMASTER não podem ser congelados e descongelados mais que 1 vez. Ciclos repetidos de congelamento/descongelamento podem causar uma perda na eficiência da amplificação. 7) ORIENTAÇÃO SOBRE OS CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA OBJETO DO DIAGNÓSTICO A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa. 8) DESCRIÇÃO DO PROCESSO DE MEDIÇÃO: A) Amostras Este kit deve ser utilizado com DNA extraído das seguintes amostras biológicas: lavagem bronco-alveolar e broncoaspirado. Lavagem bronco-alveolar e broncoaspirado 4

As amostras de lavado bronco-alveolar e de aspirado brônquico, destinadas à extração do DNA, devem ser colhidas em solução fisiológica estéril ou PBS estéril de acordo com as normas do laboratório. Devem ser transportadas a +2 C/+8 C e conservadas a +2 C/+8 C por, no máximo, três dias. Não congelar as amostras de lavagem bronco-alveolar para evitar a lysine celular e a perda do título DNA do fungo. As instruções para o eventual pré-tratamento da amostra clínica e para a extração do DNA estão contidas nas Instruções de Uso do kit de extração EXTRAcell, quando for o caso. B) Substâncias interferentes O DNA extraído da amostra inicial não deve conter mucoproteínas ou hemoglobina para evitar fenômenos de inibição e a possibilidade de frequentes resultados inválidos. Não há disponibilidade de dados pertinentes a eventuais fenômenos de inibição causados por medicamentos antifúngicos, antivirais, quimioterápicos ou imunossupressores. Descrição do Procedimento Instruções de Uso: a) Preparo da etapa de amplificação real time área de pós-pcr: Antes de iniciar, é necessário: - conforme descrito no manual do equipamento, ligar o RT-PCR e seu computador, iniciar o software apropriado e abrir uma sessão absolute quantitation ; - conforme descrito no manual do equipamento, programar o detector para a sonda do Aspergillus spp. com o reporter = FAM e o quencher = none (NFQ é um quencher nãofluorescente, extintor de fluorescência = dark quencher); - conforme descrito no manual do equipamento, programar o detector para a sonda da betaglobina com o reporter = VIC e o quencher = none (NFQ é um quencher não fluorescente, extintor de fluorescência = dark quencher); - conforme descrito no manual do equipamento, para cada poço da microplaca, programar o "detector" (tipo de fluorescência a ser medida), o "passive reference" como "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controle de negativo de amplificação, controle positivo de amplificação, padrão com quantidade conhecida). Adicione esta informação na planilha de leitura que se encontra no final desta Instrução de Uso, escrevendo manualmente estas informações, ou imprima a montagem da placa com as respectivas disposições dos controles e localizações das amostras. A Planilha deve ser seguida criteriosamente durante a transferência das misturas de reação e amostras em seus poços. OBS.: para poder determinar o título de DNA alvo na amostra inicial, será necessário preparar uma série de reações usando DNA padrões com quantidades conhecidas (quantidade de cópias de 10 5, 10 4, 10 3, 10 2 ) para se obter a Curva Padrão. Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 11 amostras. 5

Legenda: A1 - A11: Amostras para analisar; CN: Controle negativo de amplificação; 10 2 : Padrão 10 2 cópias; 10 3 : Padrão 10 3 cópias; 10 4 : Padrão 10 4 cópias; 10 5 : Padrão 10 5 cópias. - referindo-se ao Manual do equipamento, programar no termociclador os parâmetros do ciclo térmico e um volume de reação para 25µl. Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM TM da série 7000 escolher a opção "9600 emulation". Ciclo térmico para amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. 45 ciclos 95 C 15 seg. 60 C 1 min. b) Preparação da amplificação: Antes de iniciar, é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Centrifugar os tubos para que o material, após descongelamento, desça para o fundo do tubo, e mantenha-o em gelo; - retirar e descongelar os tubos de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX necessários para o processo, lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reações. Centrifugar os tubos por 5 segundos (pulso) para que os reagentes que estejam nas paredes, após o descongelamento, desçam para o fundo do tubo, e mantenha-o em gelo; - retirar e descongelar um número de tubos de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliPROBE iguais aos dos tubos de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX. Repita o pulso nesses tubos para que seu conteúdo desça para o fundo do tubo. Mantenha-os em gelo. - retire tantos tubos de Q-PCR Alert AmpliMASTER quantos os tubos de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX. Escreva ASPERGILUS e a data no tubo com caneta com tinta permanente. Dê um pulso nos tubos para que os reagentes após descongelados, desçam para o fundo do tubo. Mantenha em gelo. - retire e descongele os tubos de ASPERGILLUS STANDARD necessários. Dê um pulso nos tubos para que os reagentes após descongelados, desçam para o fundo do tubo. Mantenha em gelo. - se necessário, corte a placa de amplificação para separar a parte que será utilizada no ensaio tomando o devido cuidado de manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos poços, durante o corte/separação. 1. Transferir 100µL de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliMIX no tubo de Q-PCR Alert AmpliMASTER. Misturar bem, pipetando três vezes o volume de 100µL na mistura. 2. Transferir 100µL de ASPERGILLUS Q-PCR Alert AmpliPROBE no tubo de Q-PCR Alert AmpliMASTER. Misturar bem, pipetando três vezes o volume de 100µL na mistura. 3. Misturar em Vortex em baixa velocidade por 5 segundos, evitando a formação de espuma. 4. Centrifugar os tubos por 5 segundos (pulso) para que todo líquido escorra para o fundo do tubo. 5. Transferir 20µL da mistura de reação obtida para o fundo de cada poço na placa de reação de amplificação, conforme pré-elaborado na planilha. OBS.: Caso não seja utilizado toda a mistura de reagentes elaborado, o tubo identificado como ASPERGILUS poderá ser armazenado no escuro a -20 C, por no máximo um mês, contanto que esta mistura seja congelada e descongelada somente uma vez. 6. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poço, 5µL de DNA extraído, conforme posição definida na planilha elaborada. 7. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo do poço de controle negativo, 5µL de água ultrapura. 8. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poço, 5µL ASPERGILLUS STANDARD 10 2 cópias, conforme posição definida na planilha elaborada na mistura de reação. Proceder de igual modo, tomando-se o cuidado de dispensar cada qual em seu poço, 5µL de ASPERGILLUS STANDARD com 10 3, 10 4, 10 5 cópias. 6

9. Fechar a microplaca de amplificação com a lâmina adesiva de amplificação, certificando-se de que a placa fique bem selada, usando acessório adequado para tal procedimento. 10. Transferir a placa de amplificação para o termociclador Real Time, que deve estar em área específica e destinada para produtos amplificados (pós-pcr). 9) PROCEDIMENTOS DE CALIBRAÇÃO DO PROCESSO DE MEDIÇÃO Para este tipo de ensaio e metodologia não existe procedimento de calibração para o processo de medição. 10) PROCEDIMENTOS DE CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS DA MEDIÇÃO a) Interpretação dos resultados Os valores registrados da fluorescência emitida pela sonda específica para Aspergillus spp. (fluorescência FAM) e pela sonda específica para o Controle Interno (fluorescência VIC) nas reações de amplificação devem ser analisadas pelo software específico. Antes de iniciar a análise é necessário: - referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente a faixa de cálculo para o Nível de Fluorescência de Background (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15*; *Nota : No caso de uma amostra positiva com alto título de Aspergillus spp., a fluorescência FAM da sonda específica para Aspergillus spp. pode começar a crescer antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo da "baseline" deve ser ajustado do ciclo 6 ao ciclo no qual a fluoresdcencia FAM começa a crescer, por exemplo ciclo 10. - referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente o Limiar (Thereshold) da fluorescência FAM para 0,2; - referindo-se à documentação do equipamento, programar manualmente o Limiar (Thereshold) da fluorescência VIC para 0,1; Os valores de fluorescência emitidos pela sonda FAM específica para Aspergillus spp. na reação de amplificação e o valor de Threshold permite deteminar o Ciclo Threshold (Ct), ciclo no qual a fluorescência alcança o valor de Threshold. Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para Aspergillus spp. nas reações de amplificação dos quatro DNA padrões (Standard) são utilizados para calcular a Curva Padrão (Standard Curve) da sessão de amplificação e para validar a sessão de amplificação e detecção como descrito na tabela seguinte: Ct do Standard 10 5 Aspergillus spp. (FAM) Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 25 POSITIVO CORRETO Curva Padrão Aspergillus spp. (FAM) Faixa aceitável Amplificação/Detecção Coeficiente de Correlação (R2) 0,990 R2 1,000 CORRETO Se o resultado da reação de amplificação para o Standard 10 5 é Ct > 25 ou Indeterminado, ou se o valor do Coeficiente de correlação (R2) não está dentro dos limites, isso significa que não foi possível calcular uma Curva padrão significativa. Nesse caso, um problema ocorreu durante a fase de amplificação ou de detecção (volumes incorretos das misturas das reações, degradação da sonda, degradação dos padrões, posicionamento dos padrões incorretos, aliquotagem incorreta dos padrões, programação incorreta do termociclador) que podem causar resultados incorretos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para Aspergillus spp. na amplificação do Controle Negativo e a Curva Padrão da sessão de amplificação são utilizados para calcular a Quantidade (Quantity) de DNA alvo presente na reação e para validar a sessão de 7

amplificação e detecção como descrito na tabela seguinte: Resultado do Controle negativo Aspergillus spp. (FAM) Indeterminado ou Quantity < 7 DNA de Aspergillus spp. na reação NÃO DETECTADO ou INFERIOR A < 7 CÓPIAS Amplificação/Detecção CORRETO Nota: Neste teste o valor de baseline estabelecido para o DNA alvo na reação de amplificação do Controle negativo é de 7 cópias de rdna 18S do fungo. (Verificar dados no parágrafo que trata de Características de Desempenho.) Se o resultado da reação de amplificação do Controle negativo é Quantity > 7 cópias, isto significa que foi detectada a presença de DNA de rdna 18S do fungo na reação de amplificação acima da baseline. Nesse caso, problemas ocorreram durante a fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorretos. A sessão é inválida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para Aspergillus spp. nas reações de amplificação de cada amostra são usados para detectar a presença do DNA alvo, enquanto os valores de Ct da probe específica para o Controle Interno são usados para validar as etapas de amplificação, detecção e extração. Verificar no software do instrumento que o Ct foi determinado por um rápido e regular crescimento dos valores de fluorescência e não por picos ou incremento de sinal background. Este kit pode dosar de 1.000.000 a 10 cópias de DNA do gene rdna 18S de Aspergillus spp. por reação de amplificação. (Verificar dados no parágrafo que trata de Características de Desempenho, a seguir). Neste teste, o valor de Threshold estabelecido para o DNA alvo na reação de amplificação da amostra é de 70 cópias de rdna 18S de Aspergillus spp. Limites significantes foram definidos com relação ao limite Threshold para a presença de DNA alvo (verificar dados no parágrafo que trata de Características de Desempenho). Os resultados para cada amostra são utilizados para detectar a presença de Aspergillus spp., como descrito na tabela seguinte: Reação da amostra Aspergillus spp (FAM) Indeterminado Controle interno (VIC) Ct > 35 ou Indeterminado Ct 35 Adequação da amostra Resultado do teste DNA de Aspergillus spp Inadequado Inválido - Adequado Válido, negativo NÃO DETECTADO Quantity < 63 63 Quantity 77 Ct > 35 ou Indeterminado Ct 35 Ct > 35 ou Indeterminado Ct 35 Inadequado Inválido - Adequado Válido, negativo PRESENTE mas NÃO SIGNIFICATIVO Inadequado Inválido - Adequado Válido, indeterminado PRESENTE mas INDETERMINADO Quantity > 77 Ct > 35 ou Indeterminado Ct 35 Adequado* Adequado Válido, positivo Válido, positivo PRESENTE e SIGNIFICATIVO PRESENTE e SIGNIFICATIVO Se o resultados da reação de amplificação de uma amostra é Ct Indeterminado ou Quantity 77 para o 8

DNA da região do gene rdna 18S de Aspergillus spp. E Ct > 35 ou Indeterminado para o DNA do gene da beglobina humana, significa que não foi possível detectar eficientemente o DNA do gene da betaglobina humana. Neste caso problemas ocorreram durante a fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extração (ausência de DNA, presença de inibidores ou números de células insuficiente nas amostras iniciais) que podem causar resultados incorretos e falsos negativos. A amostra não é adequada, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extração de uma nova amostra. Se o resultado da reação de amplificação de uma amostra for Quantity <63 para o DNA do gene na região 18S rdna de Aspergillus spp. e Ct 35 para o DNA do gene da betaglobulina humana, isso significa que o DNA de Aspergillus spp. foi detectado mas está disponível em quantidade abaixo ao limite significativo estabelecido para esse teste. Neste caso a presença do DNA de Aspergillus spp. na reação de amplificação da amostra não é significativa. Se o resultado da reação de amplificação de uma amostra é 63 Quantity 77 para o DNA do gene na região 18S rdna de Aspergillus spp. e Ct 35 para o DNA do gene da betaglobina humana, isso significa que o DNA de Aspergillus spp. foi detectado em quantidade próxima ao limite significativo estabelecido para este teste mas não acima dele (verificar dados no parágrafo que trata de Características de Desempenho, a seguir). Neste caso o resultado é indeterminado. A amostra é adequada, mas o teste precisa ser repetido a partir da extração de uma nova amostra. Se o resultado da reação de amplificação de uma amostra é Quantidade > 77 para o DNA do gene na região 18S rdna de Aspergillus spp., significa que o DNA de Aspergillus spp. foi detectado e está disponível em quantidade acima do limite significativo estabelecido para este teste (verificar dados no parágrafo que trata de Características de Desempenho). Neste caso a presença do DNA de Aspergillus spp. na reação de amplificação da amostra é significativa. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório realizados com o paciente. Quando um Quantity > 77 do DNA de Aspergillus spp. foi detectado na reação de amplificação da amostra, a amplificação do gene da betaglobina humana pode resultar em Ct > 35 ou Indeterminado. De fato, a baixa eficiência na reação de amplificação da betaglobina humana pode ser causada pela competição com a alta eficiência da reação de amplificação do Aspergillus spp. Neste caso, a amostra ainda é válida e o resultado positivo do teste é válido. 11) LIMITAÇÕES DO PROCESSO DE MEDIÇÃO (utilização de testes adicionais mais específicos ou sensíveis, quando os resultados obtidos assim o sugerirem) Use somente DNA extraído das seguintes amostras humanas: lavado broncoalveolar e aspirado brônquico. Não use DNA extraído que esteja contaminado com mucoproteínas ou hemoglobinas com este produto: as mucoproteínas e as hemoglobinas inibem a reação de amplificação de ácidos nucleicos e podem causar resultados inválidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenômenos de inibição por parte dos medicamentos antifúngicos, antivirais, quimioterápicos ou imunossupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorretos é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extração dos ácidos nucleicos. O método de amplificação Real Time dos ácidos nucleicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para o DNA de ASPERGILLUS, dos controles positivos e dos mesmos produtos da reação de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenômenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas nestas Instruções de Uso. Este produto requer pessoal instruído para as manipulações de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupa de trabalho (EPI) e área de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos, para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o usuário ou outras pessoas. 9

Este produto requer pessoal instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extração, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos para evitar resultados incorrectos. Este produto requer uma área separada para a extração/preparação das reacções de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos - áreas de pré e pós-pcr (áreas de Pós e Pré-PCR). Este produto requer o uso de roupas de trabalho (EPI) e instrumentos destinados à extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de ASPERGILLUS não está detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de ASPERGILLUS esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto, neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco residual não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco residual em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões incorretas com consequências graves para o paciente. 12) CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE A SER ADOTADO PELO USUÁRIO PARA ASSEGURAR O DESEMPENHO ADEQUADO DO PROCESSO DE MEDIÇÃO Controle de Qualidade É aconselhável confirmar o procedimento completo de análises de cada sessão, extração e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva. Como amostra negativa, utilizar uma amostra negativa já testada ou ainda da água bidestilada estéril. Como amostra positiva, utilizar uma amostra positiva para Aspergillus spp. já testado. Controles de Amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reação de controlo negativo e uma reação de controlo positivo. Para o controle negativo, utilizar água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reação no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controle positivo, utilizar o DNA obtido de uma amostra positiva já testada ou o Padrão Aspergillus. 13) VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão. 14) CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PRODUTO Sensibilidade Analítica: Limite de Detecção O Valor de Baseline do DNA alvo para este teste foi estabelecido para 7 cópias de DNA do gene rdna 18S do fungo na reação de amplificação. O Valor de Baseline do DNA alvo é estabelecido utilizando água ultrapura para biologia molecular como controle negativo. A água foi empregada em 68 repetições em diversas sessões para 10

executar a amplificação, usando nossos produtos. O Valor de Baseline do DNA alvo foi calculado como a média dos resultados obtidos mais três vezes o desvio padrão. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N Média Desvio Padrão Baseline Água 68 1,9 cópias de DNA 1,6 cópias de DNA 7 (6,8) cópias de DNA O valor limiar do DNA alvo para este teste foi estabelecido em 70 cópias de DNA do gene rdna 18S Aspergillus spp. na reação de amplificação. O valor limiar do DNA alvo foi calculado como dez vezes o Valor de Baseline do DNA alvo. Limites de significância foram definidos com relação ao limite limiar do DNA alvo para a presença de DNA alvo na reação de amplificação. Os resultados são mostrados na tabela seguinte. Valores limite do DNA alvo na reação de amplificação Presença significativa Quantidade > 77 cópias de DNA (70 + 10%) Resultado indeterminado 63 Quantidade 77 cópias de DNA (70 ± 10%) Presença não significativa Quantidade < 63 cópias de DNA (70-10%) Sensibilidade Analítica: Faixa de Medição Linear Em termos de Faixa de Medição Linear, a sensibilidade analítica deste teste permite determinar um título de 1.000.000 a 10 moléculas de DNA alvo nos 5µl de DNA extraído adicionado à reação de amplificação. Em termos de Faixa de Medição Linear, a sensibilidade analítica do teste foi determinada utilizando um painel de diluições (1 log 10 entre uma diluição e a seguinte) de DNA plasmídico contendo o produto de amplificação, (a região rdna 18S de Aspergillus fumigatus) cuja concentração inicial foi medida por espectrofotometro. Os pontos do painel de 10 7 moléculas por reações a 10 1 moléculas por reação foram usadas em 9 repetições para realizar a amplificação com nossos produtos. A análise dos dados obtidos, realizada com a regressão linear, demostrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação linear maior que 0,99). O limite superior da faixa de medição linear, foi fixado a 10 6 moléculas/5 µl, dentro de um logaritmo de maior concentração do padrão de amplificação AmpliSTANDARD (10 5 moléculas/5 µl). O limite inferior da faixa de medição linear, foi fixado a 10 moléculas/5 µl, dentro de um logaritmo de menor concentração do padrão de amplificação AmpliSTANDARD (10 2 moléculas/5 µl). Os resultados finais estão resumidos na tabela a seguir: Limite superior Limite inferior Faixa de Medição Linear 1.000.000 cópias DNA / reação 10 cópias DNA / reação Sensibilidade Analítica: Precisão O estudo da precisão do teste, entendida como variabilidade dos resultados obtidos em diferentes repetições de uma amostra com a mesma concentração analisadas em uma única sessão, permitiu determinar um Coeficiente de Variação (CV %) de 13,3% na Faixa de Medição Linear de 10 6 moléculas/5µl a 10 moléculas/5µl. Sensibilidade Analítica: Exatidão O estudo da exatidão do teste, entendida como a diferença entre os resultados médios obtidos em uma única sessão com diferentes repetições de uma amostra a mesma concentração e o valor teórico da concentração das amostras, permitiu determinar uma inexatidão percentual média de 10,8% na faixa linear 10 6 moléculas/5µl de 10 moléculas/5µl. 11

Sensibilidade Diagnóstica: Eficiência de Detecção e Quantificação em Diversas Espécies A sensibilidade diagnóstica do teste, que é a eficiência de detecção e quantificação do teste sobre as espécies de interesse do gênero Aspergillus, foi avaliada por comparação de sequências com bancos de dados de nucleotídicos. O teste de alinhamento das regiões selecionadas para a hibridação de primer de oligonucleotídeo AmpliMIX e a sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponíveis no banco de dados da região 18s do rdna do Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Aspergillus glaucus demonstrou sua conservação e a ausência de mutações. A sensibilidade diagnóstica do teste, que é a eficiência de detecção do ensaio em espécies relevantes do gene Aspergillus, foi testada usando amostras provenientes de culturas de Aspergillus fumigatus e de Aspergillus terreus. Estas amostras foram usadas para realizar o procedimento completo de análise da extração até amplificação com nossos produtos. Ambas as espécies geraram resultados positivos. Sensibilidade Diagnóstica: Amostras Positivas A sensibilidade diagnóstica do teste, confirmando amostras clínicas positivas, foi verificada analisando amostras que eram positivas para Aspergillus spp. O material de referência utilizado na sensibilidade diagnóstica foram 6 amostras de lavado bronco-alveolar (BAL) ou broncoaspirado (BA) que deram positivos em cultura de Aspergillus spp. em meio Sabouraud. Estas amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de análise da extração à amplificação com nossos produtos. Os resultados estão mostrados na tabela abaixo: Amostras N Positivos Negativos Inválidos Positivos à cultura para Aspergillus spp. 6 6 0 0 A sensibilidade diagnóstica deste teste permite identificar como positivas todas as amostras testadas. Especificidade Diagnóstica: Amostras Negativas A especificidade diagnóstica do teste, confirmando amostras clínicas negativas, foi testada pela análise de amostras que eram negativas para Aspergillus spp. e provaram sua negatividade em 88%. O material de referência utilizado na especificidade diagnóstica foi um painel com 111 amostras de lavado bronco-alveolar (BAL) o aspirado brônquico (BA) que eram negativas para Aspergillus spp. no teste em cultura em meio Sabouraud. Estas amostras foram empregadas para realizar o procedimento completo de análise, extração e amplificação. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N Positivos Negativos Não válidos Negativos à cultura para Aspergillus spp. 111 10 75 26 O teste identifica como positivas 10 amostras que eram negativas no teste de cultura. Este resultado pode ser explicado de duas maneiras: - as amostras eram positivas para o DNA de Aspergillus spp. mas o fungo não era vital e não cresceu no teste de cultura; - as amostras eram positivas para o DNA de um outro fungo (por exemplo Penicillum) mas o fungo não era vital e/ou não cresceu no teste de cultura. Especificidade Analítica: Marcadores Potencialmente Interferentes A especificidade analítica do teste, que é a reação cruzada com outros marcadores interferentes em potencial, foram avaliados por comparação de sequências com um banco de dados. O teste de alinhamento dos primers oligonucleotídeos da AmpliMIX e da sonda fluorescente do AmpliPROBE com as sequências disponíveis em banco de dados de organismos diferentes das espécies relevantes ao género Aspergillus monstrou: - a sua especificidade e a ausência de homologias significativas com respeito ás seguintes espécies do gênero Candida: Candida albicans, Candida glabrata (Turulopsis glabrata), Candida tropicalis, Candida kruzei; 12

- a sua especificidade e homologias significativas em relação a outras espécies de fungos, incluíndo um número de espécies do gênero Aspergillus e do gênero Penicillium os quais, portanto poderiam dar que podem por isso originar resultados falso positivos. A especificidade analítica foi testada utilizando amostras de cultura de Candida albicans e de Candida kruzei e amostras de lavado bronco-alveolar (BAL) ou de aspirado brônquico (BA) que deram resultado positivos para teste em cultura para Candida albicans ou para Candida glabarata em meio Sabouraud. Estas amostras foram usadas para procedimento completo de análise desde a extração até a amplificação, usando nossos produtos. As três espécies de Candida deram resultados negativos. 15) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Loeffler.J et al. (2001) J Clin Microbiology 39: 1626-1629 Origem do produto, indicando o nome do fabricante e seu endereço País de Origem: Itália Fabricante: Nanogen Advanced Diagnostics s.p.a. C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO) Nome do Distribuidor, CNPJ e endereço Indicação do serviço de atendimento ao consumidor Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR CEP: 82840-360 Tel: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800-7260504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br WWW.biometrix.com.br CNPJ: 06.145.976/0001-39 Número de registro na ANVISA RTS110-M: 80298490094 RTS110-P: 80298490038 Responsável Técnica Ana Carolina Martins CRF/PR: 12700 Revisões Revisão Descrição da Alteração Data 01 Revisão geral do texto 05/2011 02 Correção da tabela de componentes e correção dos componentes da tabela de armazenamento, alteração da razão social do fabricante, inclusão de numeração nos tópicos, revisão do texto do item 10 (resultados), alteração do DDG. 09/2012 13

STD110 Aspergillus spp. Q PCR Standard 1) USO PRETENDIDO «Aspergillus spp. Q-PCR Standard» é destinado ao uso como um controle positivo e como padrão de quantidade conhecida de DNA para obter uma curva padrão em ensaios de amplificação quantitativa de ácidos nucleicos para a detecção e dosagem do DNA do Aspergillus spp. com os produtos «Q - PCR Alert AmpliMASTER», «Aspergillus spp. Q-PCR Alert AmpliMIX» e «Aspergillus spp. Q-PCR Alert AmpliPROBE» da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. 2) DESCRIÇÃO DO PRODUTO O produto Q PCR Standard inclui quatro soluções de plasmídeos estabilizadas com titulação conhecida, contendo a sequências requerida, divididas em dois tubos de alíquotas prontas para uso. Cada tubo teste contém 50µl de solução, suficiente para oito sessões. O plasmídeo contém a região gênica 18s rdna do Aspergillus spp.. A detecção do DNA alvo durante a reação de amplificação em tempo real confirma a habilidade de identificar a presença do DNA Aspergillus spp. e permite o cálculo da curva padrão. O kit possibilita a execução de 16 sessões de análise separadas. * A concentração inicial do padrão foi determinada por espectrofotômetro, pela medição da absorção da preparação inicial de DNA de plasmídeo. 3) MATERIAIS FORNECIDOS NO KIT Componente Descrição Quantidade Composição Rotulagem Solução de Plasmídeo, TRIS base, _ Aspergillus spp. Q - plasmídeo em TRIS cloridrato, EDTA, PCR Standard 10 5 2 x 50µl tubo com tampa RNA total de levedura Aspergillus spp. Q - PCR Standard 10 4 Aspergillus spp. Q - PCR Standard 10 3 Aspergillus spp. Q - PCR Standard 10 2 Armazenar a -20 C ou inferior. vermelha Solução de plasmídeo em tubo com tampa azul Solução de plasmídeo em tubo com tampa verde Solução de plasmídeo em tubo com tampa amarela 2 x 50µl 2 x 50µl 2 x 50µl Plasmídeo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA, RNA total de levedura Plasmídeo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA, RNA total de levedura Plasmídeo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA, RNA total de levedura _ 4) MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS NO KIT - Fluxo laminar. - Luvas descartáveis sem talco. - Agitador vortex. 14

- Microcentrífuga de bancada (12,000-14,000 RPM). - Micropipetas estéreis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo (0.5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, 50-200 µl, 200-1000 µl). - Água bidestilada estéril. - Real Time ABI PRISM 7000, completo com computador. 5) ACESSÓRIOS Os reagentes otimizados para amplificação, os primers (oligonucleotídeos) e os reagentes de detecção (probes fluorescentes) não estão inclusas neste produto. Para realizar estes passos analíticos, os produtos a seguir são recomendados «Q-PCR Alert AmpliMASTER» (RTS000), combinação de reagentes otimizados, microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determinação alélica; total de 96 reações. «Aspergillus spp. Q-PCR Alert AmpliMIX» (RTS110-M), primers oligonucleotídeos para PCR em tempo real; total de 96 reações. «Aspergillus spp. Q-PCR Alert AmpliPROBE» (RTS110-P), probes fluorescentes para PCR em tempo real; total de 96 reações. 6) ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é exclusivamente para uso in vitro. Advertências e precauções gerais Manuseie e descarte todas as amostras biológicas como potencialmente infecciosas. Evite o contato direto com amostras biológicas. Evite respingos. Os materiais que entram em contato com amostras biológicas devem ser tratados com hipoclorito de sódio 3% por, no mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados. Manuseie e descarte todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos. Evite contato direto com reagentes. Evite respingos. Os resíduos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos contendo ácidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte. Use jaleco, luvas e óculos de proteção. Nunca pipete soluções com a boca. Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos dentro da área de trabalho. Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. Descarte as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de segurança. Leia as instruções de uso antes de utilizar o produto. Siga as instruções. Não use produtos após o prazo de validade estabelecido. Somente use os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes de outros fabricantes. Advertências e precauções de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos, em particular devido à degradação dos ácidos nucleicos das amostras ou devido a contaminação das amostras por produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e pós PCR). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de biologia molecular. Nunca transfira materiais da área de amplificação/detecção para a área de extração/preparação de reações. As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser 15

destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este propósito. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua área de trabalho. Advertências e precauções para componentes específicos Os tubos contendo Q - PCR Standard podem ser congelados e descongelados por no máximo 8 vezes. Um número maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redução do título. Q - PCR Standard apresenta as seguintes advertências (S): S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos. 7) PROCEDIMENTO O produto «Aspergillus spp. Q - PCR Standard» deve ser usado com a mistura de reação obtida com os produtos «Q - PCR Alert AmpliMASTER», «Aspergillus spp. Q - PCR Alert AmpliMIX» e «Aspergillus spp. Q - PCR Alert AmpliPROBE». Q - PCR Standard está pronto para o uso, portanto deve ser usado adicionando 5 µl diretamente na mistura de reação. O procedimento completo envolve preparação e execução de reação de amplificação em tempo real em uma microplaca com termociclador com sistema óptico de detecção de fluorescência. É descrito em detalhes nas instruções de uso do produto «Aspergillus spp. Q - PCR Alert AmpliMIX», bem como informações sobre as características de performance e limitações do procedimento. Nota.: Q - PCR Standard pode ser congelado e descongelado por no máximo 8 vezes. Um número maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redução do título. 8) REFERÊNCIAS Loeffler. J et al. (2001) J Clin Microbiology 39: 1626-1629 16

Origem do produto, indicando o nome do fabricante e seu endereço País de Origem: Itália Fabricante: Nanogen Advanced Diagnostics s.p.a. C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO) Nome do solicitante, CNPJ e endereço Indicação do serviço de atendimento ao consumidor Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR CEP: 82840-360 Tel: (41) 2108-5250 Fax: (41) 2108-5252 DDG: 0800-7260504 E-mail: biometrix@biometrix.com.br WWW.biometrix.com.br CNPJ: 06.145.976/0001-39 Número de registro na ANVISA 80298490060 Responsável Técnica Ana Carolina Martins CRF/PR: 12700 Revisões Revisão Descrição da Alteração Data 01 Revisão geral do texto 05/2011 17

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