Atracamento molecular (Docking)

O atracamento molecular O que é? Método para achar o melhor encaixe entre duas moléculas

O atracamento molecular O que é? Porquê? Método para achar o melhor encaixe entre duas moléculas Se assume que duas moléculas que encaixam bem devem ligar bem entre elas.

O atracamento molecular O que é? Porquê? Como? Método para achar o melhor encaixe entre dois moléculas Se assume que duas moléculas que encaixam bem devem ligar bem entre elas. Modificação das conformações/orientações delas para maximizar a interação. Minimização energética (a melhor modo de união deve ter a menor energia).

O atracamento molecular Objetivos 1. Determinar se o ligante pode-se unir com a proteína 2. Estimar a geometria do complexo 3. Estimar a energia de ligação Ferramenta s 1. Busca do modo de união ótima: atracamento rígido ou flexível 2. Uma função de avaliação (scoring function) para estimar a energia de união

O atracamento molecular Tipos 1. Atracamento Ligante-Proteína 2. Atracamento Proteína-Proteína 3. Atracamento Proteína-DNA

1. Identificação de sítios de ligação????

1. Identificação de sítios de ligação 1. Estrutura conhecida de complexos proteína/ligante 2. Conservação de resíduos entre espécies 3. Motivos estruturais típicos no sitio ativo de uma família de proteínas 4. Partes flexíveis das proteínas 5. Pontos quentes (Hot spots): A mutação deles por alanina causa um aumento significativo da energia de união 6. Dados de NMR como os desplazamentos químicos ou acoplamentos dipolares 7. Existência de grupos que podem formar enlaces de hidrogênio, de fissuras nas enzimas ou de grupos carregados na superfície da proteína 8. Ferramentas computacionais: predizem sitios de união baseados em distintas propriedades como áreas de superfície enterradas, desolvatação, energias de interação eletrostática, hidrofobicidade, conservação de resíduos

Prática 1 Vamos identificar cavidades e possíveis sitos de união de ligantes com o programa CASTp calculation Coloca um número de identificação do PDB ou sobe o PDB do HIV que enviei por email. Olha os possíveis sitos de união achados.

Prática 1

2. Caracterização do sitio de união

2. Caracterização do sitio de união Duas formas principais de representação 1 Representação molecular: geométricos de forma que representam a. Descritores superfície molecular (+ propriedades físico-químicas) Superfície de van der Waals: é a superfície de união das superfícies atômicas esféricas definidas pelos raios de Van der Waals. Superfície acessível ao solvente e Connolly surface : Todos os pontos da superfície de Van der Waals que o solvente pode tocar.

2. Caracterização do sito de união Duas formas principais de representação 2. Representação em grades: armazena a informação acerca das contribuições energéticas das moléculas em pontos da grade que serão necessárias durante a avaliação do atracamento Os pontos da grade armazenam principalmente dois tipos de potenciais: eletrostático e de Lennard Jones (van der Waals + repulsão interatômica) +

Prática 2 No programa Chimera, abre o pdb da HIV_protease que enviei por email Actions/Surface/Show Tools/Surface-Binding analysis/electros tacic potential Brinca com o resto de opções

Prática 2

3. Busca do modo de união Ligante rígido Receptor rígido (Atracamento rígido, geométrico ou por encaixe de superfícies) Ligante flexível Receptor rígido (Atracamento flexível) Ligante flexível Receptor flexível

3. Busca do modo de união Ligante rígido Receptor rígido (Atracamento rígido, geométrico Baseadoou na complementaridade entre ligante e receptor (chave / por encaixeestérica de superfícies) fechadura). Inclusão de propriedades físico-químicas. Objetivo: Achar a transformação (rotação + translação) que maximiza o número de pontos superficiais que encaixam entre ligante e proteína. Ligante Ligante Proteína Encaixe estérico Proteína Propriedades físico-químicas

3. Busca do modo de união Ligante fexível Receptor rígido (Atracamento flexível) Atracamento fragmentado Atracamento combinatorial

3. Busca do modo de união Ligante fexível Receptor rígido (Atracamento flexível) Atracamento fragmentado Ex. FlexX and Dock Dividir ligante em fragmentos Determinar o fragmento rígido central Adicionar fragmentos incrementamente Começar pelo fragmento rígido central

3. Busca do modo de união Ligante fexível Receptor flexível Atracamento combinatorial Atracamento Suave Métodos de amostragem

Métodos de amostragem Usados em: Busca conformacional de ligantes Busca conformacional de proteínas Busca conformacional de complexos São: Monte Carlo Dinâmica molecular Simmulated annealing Algoritmos genéticos Busca tabú Algoritmos genéticos Lamarkian

Métodos de amostragem Método de Monte Carlo (MC) Baseado em repetições de busca aleatória Passos: 1. Movimentos aleatórios no espaço conformacional (graus de liberdade rotacional, translacional e torsional) 2. Cálculo da energia da nova conformação 3. Aplicação do critério de aceitação. Critério Metrópolis: ΔE 0, Modo de união aceito ΔE 0, aplicação de um critério de probabilidade (P= ΔE/kT ) Combinado annealing com minimização e simmulated

Métodos de amostragem Dinâmica Molecular (MD) Baseado nas leis da mecânica molecular (Newton) No inicio é aplicada uma força para obrigar os átomos a se mexer, mas depois os átomos se mexem unicamente por as forças aplicadas neles por o resto do sistema As novas forças que moverão os átomos são calculadas a cada At. Vantagens É possível obter informação temporal dos movimentos Boa calculando mínimo local de energia Desvantagens Precisa um grande custo computacional Não é boa atravessando barreiras energéticas

Métodos de amostragem Simulated Annealing Baseado na aplicação rápida de altas temperaturas, e esfriamento lento do sistema Gera um movimento aleatório a partir de uma conformação inicial e calcula a nova energia ΔE 0, Pose aceita ΔE 0, aplicação de um critério de probabilidade (P= ΔE/kT ) Precisa aplicação de restrições Vantagens: Bom estudo do espaço conformacional Desvantagens: Não chega bem até o mínimo: minimização posterior

Métodos de amostragem Algoritmos genéticos Baseado no conceito de evolução Cromossoma = conformação, Gene = variável ou descritor (ângulo torção, distancia enlace,..), Fenótipo = energia Conformações de menor energia tem mais probabilidade de ser escolhidas para próximos cruzamentos

Métodos de amostragem Algoritmos genéticos Lamarkian Mesmo principio do algoritmo genético Diferencia com GA: as conformações (cromossomas) são minimizadas antes de fazer um novo cruzamento Mais rápida que SA e GA Busca tabú Busca aleatória. As novas soluções (conformações) são eliminadas se parecem com as anteriores, a menos que a energia delas seja menor que a melhor solução. Objetivo: Evitar ficar atracado no mínimo local.

3. Busca do modo de união Que método usar? Quando incluir flexibilidade??

4. A solvatação As moléculas na natureza estão presentes em meio aquoso

4. A solvatação Duas formas de tratar o problema da solvatação: Modelo explícito: A molécula que queremos simular é rodeada de uma capa de moléculas de água Modelo implícito: Representação do solvente como um meio contínuo, mediante a introdução de um término para a constante dielétrica na função de avaliação

4. A solvatação Exemplo (tratamento explícito): Molécula de água mediando a interação inibidor - HIV protease

5. Estimação da energia de união A energia de um sistema é calculada pela energia livre de Gibbs: Δ G = ΔH TΔ S G = Energia livre de Gibbs H = Entalpia S = Entropia Cálculo precisa alto custo computacional (Dinâmica Molecular) Inviável na busca do modo de união Funções de avaliação (estimação da energia de união)

5. Estimação da energia de união Funções de avaliação usadas com complexos liganteproteína: 1. Funções Baseadas em campo de forca (olhar tema 5, busca conformacional de ligantes) 2. Funções Baseadas em conhecimento (olhar tema 5, busca conformacional de ligantes) 3. Funções Empíricas Energias de ligação aproximadas pelo somatório de diferentes variáveis não correlacionadas (falso) Coeficientes obtidos por análises de regressão usando dados experimentais

6. Pós-processamento Inspeção visual Filtros Agrupamento (clusters) Cálculos energéticos mais precisos das soluções selecionadas

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Prática 3 Vamos fazer um docking com o programa SwissDock Entrar em SwissDock Clicar submit docking Subir o arquivo da proteína alvo HIVprotease.pdb que enviei por email, esperar que o programa o aceite. Subir o arquivo do ligante

Prática 3

Atracamento proteínaproteína

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo Superfícies, não cavidades!!!

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação proteínas da superfície molecular das

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação da superfície proteínas 3. Atracamento molecular rígido Porquê rígido??? molecular das

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação da superfície proteínas 3. Atracamento molecular rígido molecular das Porquê rígido??? Atracamento de superfícies, se lembra?!!

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação da superfície proteínas 3. Atracamento molecular rígido molecular das 4. Avaliação dos complexos formados e seleção do/s melhor/es (funções de avaliação e informação experimental)

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação da superfície proteínas 3. Atracamento molecular rígido molecular das 4. Avaliação dos complexos formados e seleção do/s melhor/es (funções de avaliação e informação experimental) 5. Tratamento da flexibilidade

Passos 1. Obtenção de informação sobre o sito ativo 2. Representação da superfície proteínas 3. Atracamento molecular rígido molecular das 4. Avaliação dos complexos formados e seleção do/s melhor/es (funções de avaliação e informação experimental) 5. Tratamento da flexibilidade 6. Avaliação dos complexos formados e seleção do/s melhor/es (funções de avaliação e informação experimental)

Tratamento da flexibilidade Atracamento suave (soft docking) Baseado na redução da alta penalidade de energia aplicada quando um átomo de uma proteína sobrepor um átomo da outra

Tratamento da flexibilidade Atracamento combinatorial Geração de diferentes conformações das proteínas para usar em atracamento rígido

Tratamento da flexibilidade Movimentos das cadeias laterais 1. Bibliotecas de rotâmeros Conformações das cadeias laterais são pegas de bibliotecas de rotâmeros derivadas de estruturas resolvidas de proteínas 2. Estudo do espaço conformacional: Monte Carlo (MC), Algoritmo genético (GA),... Todas as cadeias laterais são estudadas???

Tratamento da flexibilidade Movimentos das cadeias laterais Seleção das cadeias laterais a estudar: 1. Perto do sito de união 2. SOFTSPOTS: usa uma função baseada em conhecimento para determinar os resíduos que mais provavelmente vão sofrer mudança conformacional no atracamento. 3. Flexibilidade dos aminoácidos: lisina < arginina < metionina < glutamina < ácido glutâmico < isoleucin < leucina < asparagina < treonina < tirosina < serina < histidina < ácid aspártico < cisteína < triptófano < fenilalanina

Tratamento da flexibilidade Separação partes rígidas e flexíveis Todas as partes da proteína são estudadas??? Hinge-Find: analisa estruturas de dois proteínas homólogas em distintas conformações e identifica as partes rígidas.

Tratamento da flexibilidade Atracamento fragmentado Algoritmo FlexXDock: 1. Predição de regiões flexíveis e rígidas (HingeProt) 2. Partição da proteína por as dobradiças (loops) 3. Atracamento molecular simultânea e separadamente. de cada fragmento 4. Avaliação das distintas poses de cada fragmento. 5. Construção da proteína usando a pose melhor avaliada para cada fragmento

Tratamento da flexibilidade Análise de modos normais Perto do mínimo, a função de energia potencial pode ser aproximada como uma função harmônica (suma de modos normais) Função harmônica Função de Energia potencial Modo normal: oscilações harmônicas no redor do mínimo de energia Movimentos de grande amplitude correspondem a modos normais de baixa freqüência Grandes movimentos Baixa freqüência Cadeias laterais Proteín a Pequenos movimentos Alta freqüência

Tratamento da flexibilidade Análise de modos normais Podemos selecionar somente os modos de baixa frequência (grande amplitude) Diminuição de grados de liberdade Permitem representar a flexibilidade de toda a proteína sem grande custo computacional Possibilidade de estudar grandes movimentos

Tratamento da flexibilidade Dinâmica essencial Neste caso os modos normais de maior amplitude são obtidos a partir de um grupo de conformações da mesma molécula

Tratamento da flexibilidade Métodos de amostragem Monte Carlo, Dinâmica molecular, simulated annealing,... Maior custo computacional: Usados para gerar diferentes conformacoes Ou para um último estudo quando um/s poucos complexos finais foram selecionados.

Capri Critical Assesment Prediction of Interactions Experimento internacional desenhado para avaliar as aproximações computacionais disponíveis para o estudo do atracamento molecular proteína-proteína. Criada na conferencia de modelagem de interações de proteínas em genomas, em 2001 Processo: Quando os pesquisadores resolvem a estrutura de um complexo, enviam as estruturas das proteínas não ligadas para CAPRI. Eles tem umas poucas semanas para predizer a estrutura do complexo com as ferramentas computacionais disponíveis. Depois a estrutura experimental do complexo é publicada e comparada com os modelos de CAPRI.

Programas

Atracamento proteína-dna

Interfase Proteína DNA 1. Superfície de ligação rica em resíduos positivos e polares (R,K,T,S). 2. Abundancia de enlaces de hidrogênio, sobre todo com o esqueleto de DNA (inespecíficos) 3. Interações hidrofóbicas também importantes 4. Não existe preferência por um elemento de estrutura secundaria protéico 5. Grande quantidade de moléculas de água na interfase Padrão conservado de hidratação de DNA (regiões ricas em A-T) Estabilizacao DNA, e possível envolvimento na identificação da região de ligação 6. Preferências Arg-G, Asn-A e Lys-G 7. Flexibilidade intrínseca do DNA

Informação experimental 1. Mutação de resíduos na proteína: informação sobre envolvimento da ligação 2. Interferência por etilação do esqueleto de DNA: informação sobre envolvimento da ligação 3. Marcação das purinas com dimetilsulfato: informação sobre envolvimento da ligação 4. Mutação das proteínas a nucleasas com sito de reconhecimento especifico: informação sobre proximidade 5. Métodos DNA footprint (DNAase): informação sobre região de ligação no DNA 6. Espectrometria de massas ou NMR para o intercambio hidrogênio deutério: informação sobre acessibilidade de resíduos. El DNA no intercambia? 7. Informação de sitos de união e outros aspectos do reconhecimento DNA-proteína em bancos de dados (PFAM, PROSITE, SMART)

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA Obtenção por métodos experimentais: Difícil Não ajuda muito a estrutura dela não-ligada Geração computacional: Geralmente usando blocos de nucleotídeos com parâmetros derivados de estudos de difração Exemplos de programas: NAMOT, NAB, 3DNA, MDDNA, DNAtools, CURVES/JUMNA. Grupos de conformações: Usando dados de dobradura obtidos por métodos bioquímicos: NAMOT e NAB. Usando estruturas de DNA em complexos de proteínas relacionadas. Usando simulações MD + informação sobre a dobratura.

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA 2. Estudo de atracamento rígido Igual que proteína-ligante, e proteínaproteína!!!

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA 2. Estudo de atracamento rígido 3. Introdução da flexibilidade

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA 2. Estudo de atracamento rígido 3. Introdução da flexibilidade Atracamento suave (Soft Docking) Atracamento de grupos de conformações Análise de modos normais Métodos de amostragem Bibliotecas de rotámeros (cadeias laterais)

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA 2. Estudo de atracamento rígido 3. Introdução da flexibilidade 4. Funções de avaliação

Passos 1. Preparação das estruturas de partida: proteína e DNA 2. Estudo de atracamento rígido 3. Introdução da flexibilidade 4. Funções de avaliação Conceitos específicos para a avaliação do atracamento proteína-dna Termo extra para favorecer soluções com maior número de enlaces de hidrogênio Usa complementaridade eletrostática para favorecer seleção de sitos polares na proteína Necessidade de uso de informação experimental para eliminar falsos positivos

Programas