Versão: 01 Pg: 1/9 ELABORADO POR DE ACORDO NOME FUNÇÃO ASSINATURA DATA Dr. Renato de Lacerda Barra Filho Dr. Ivo Fernandes Biomédico 01/10/2009 Gerente da Qualidade Biomédico 20/10/2009 Dr. Jose Carlos APROVADO POR Diretor Executivo 30/10/2009 dos Santos HISTÓRICO DAS REVISÕES Versão Revisado por Data Assinatura Aprovado por Data Assinatura REVALIDAÇÃO ANUAL Versão Responsável Data Versão Responsável Data 1 Ivo 01/10/2013 1. NOME/ SINONÍMIAS/ MNE SEMEADURA PRIMÁRIA SEMEADURA MICROBIOLÓGICA SEMEADURA DE MATERIAIS BIOLÓGICOS 2. PRINCÍPIO DO TESTE A semeadura primária adequada é uma etapa importante e fundamental na rotina microbiológica, da mesma maneira que a boa qualidade da amostra clínica, a seleção correta dos meios de cultura e a metodologia adotada para cada procedimento. Estes fatores são decisivos para o sucesso final do exame microbiológico. Quando as amostras chegam ao laboratório devem levar em consideração alguns pontos importantes, tais como: Natureza do material clínico; Se a amostra está devidamente identificada. Se o volume da amostra é suficiente para a realização dos exames solicitados; Observar se o transporte e acondicionamento do material coletado são adequados; Seleção dos meios de cultura (qual será utilizado em cada procedimento). Antes de semear os materiais, deve-se observar alguns pontos como: Validade, aspecto e ausência de contaminação; Os materiais devem ser semeados de acordo com a sua seletividade. Inocular primeiramente os meios menos seletivos para evitar que substâncias inibidoras sejam transferidas de um meio para outro. Semear sempre na seguinte ordem: Ágar Chocolate, Ágar Sangue, MacConckey e o caldo THIO. Existem duas técnicas básicas de semeadura: - Semeadura quantitativa em estrias com alça calibrada: com uma alça calibrada (1:1000 ou 1:100) flambada, faz o inóculo inicial traçando uma linha central, em seguida são traçadas estrias verticalmente a esta linha central em zig-zag na superfície do meio. (Vide anexo 2) - Semeadura por esgotamento: descarregar o material na área 1 (podendo passar o próprio swab ou se for líquido tocar com alça flambada no material e espalhar na área 1), com a mesma alça toca na área 1 e faz estrias (área 2), em seguida toca na área 2 novamente fazendo estrias de forma bem ampla para se ter um bom isolamento bacteriano (vide anexo 3).
Versão: 01 Pg: 2/9 3. SIGNIFICADO CLÍNICO 4. COLETA E TRATAMENTO DA AMOSTRA 4.1 Coleta da amostra: Consultar Manual de Coleta 4.2 Tipos de amostra: todos os materiais biológicos 4.3 Volume mínimo para análise: Consultar Manual de Coleta 4.4 Rejeição de amostras: Consultar Manual de Coleta 4.5 Condições de acondicionamento: Consultar Manual de Coleta 4.6 Tratamento e pré-tratamento da amostra: 5. MATERIAL REQUERIDO 5.1 Estufa bacteriológica 5.2 Bico de Bunsen 5.3 Alça calibrada para semeadura (1:1000 ou 1:100) 5.4 Luva Máscara 5.5 Óculos de proteção 5.6 Fluxo Laminar 6. REAGENTES 6.1 Placa de Petri com Agar Sangue. 6.2 Placa de Petri com MacConkey. 6.3 Placa de Petri com Agar Chocolate. 6.4 Placa de Petri com Muiller Hinton. 6.5 Placa de Petri com SS. 6.6 Tioglicolato 6.7 Selenito 6.8 Cled 7. PROCEDIMENTO DETALHADO RECEBIMENTO DAS AMOSTRAS: Ao receber as amostras biológicas, o setor deve verificar: - Se as amostras estão devidamente identificadas. - Se o volume das amostras está adequado para a realização dos exames solicitados; - Se as amostras foram coletadas em meios de transportes, swabs e ou frascos apropriados; - Se a solicitação do exame está conforme digitação. SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA: No momento da semeadura, os seguintes itens deverão ser observados:
Versão: 01 Pg: 3/9 - Examinar os meios quanto à aparência, validade e ausência de contaminação; - Identificar os meios individualmente, colocando o número da ordem de serviço do paciente (OS), Número da OS - Selecionar cada meio de acordo com a amostra biológica a ser semeada (anexo 1). PREPARO DOS MATERIAIS CLÍNICOS E SEMEADURA INICIAL: Cada material clínico tem um processo diferenciado para a realização da cultura: AMOSTRAS ENVIADAS EM SWABS Quando houver solicitação de Gram/Ziehl colher em dois swabs. Um deve ser utilizado para fazer o esfregaço nas lâminas (swab seco) e outro com caldo de cultura para realização da cultura. Semear por esgotamento nos meios apropriados; AMOSTRAS DE ASPIRADO E EXSUDATOS Se a amostra for recebida em seringa, transferir para um tubo estéril, homogeneizar, proceder a semeadura em meios apropriados (consultar anexo 1). Semear por esgotamento em meios apropriados. Montar a lâmina de solicitação ou de controle (Consultar POP esfregaço) ESCARRO Separar a porção mais purulenta e/ou sanguinolenta. Semear por esgotamento (Anexo3) com alça calibrada 1:1000 ou 1:100 em meios apropriados (anexo 1); Montar a lâmina de solicitação ou de controle; (Consultar POP esfregaço)
Versão: 01 Pg: 4/9 LÍQUIDOS ORGÂNICOS (PERITONIAL, ASCITICO, PLEURAL, BILIAR E SINOVIAL) Materiais com volume inferior a 2,5 ml devem ser centrifugados por 15 minutos entre 1.500 a 3.000 rpm, desprezar o sobrenadante e semear por esgotamento nos meios apropriados. Montar a lâmina de solicitação ou de controle (Consultar POP esfregaço); URINA Homogeneizar bem a urina no próprio frasco; Semear com alça calibrada por estrias em meio apropriado, na falta do uribac meio pronto para uso. (Anexo 1); OBS.: Toda urina após semeada deve ser entregues no Setor de urinálise para realização da sedimentoscopia. FRAGMENTOS DE BIÓPSIA E TECIDO Transferir a amostra para uma placa estéril e fragmentar com o auxílio de um bisturi; Semear os fragmentos em meios apropriados (anexo 1); Utilizar um fragmento para preparar lâmina para eventuais colorações; Montar a lâmina de solicitação ou de controle (Consultar POP esfregaço). PONTA DE CATETER (CENTRAL, PERIFÉRICO, ARTERIAL, SWANZ- GANZ) Usar tesoura estéril para cortar o catéter se este for maior que a placa e uma pinça estéril para realização da técnica de rolamento; Retirar o catéter do tubo estéril com o auxilio de pinça estéril, semear em meio apropriado; Com o auxilio da pinça, rolar o catéter por toda a superfície do meio. Para frente e para trás, duas vezes. O catéter deve rolar na placa e não ser esfregado, para assegurar que as colônias fiquem bem isoladas; PLACA DE PETRI CATETER
Versão: 01 Pg: 5/9 FEZES As fezes devem ser encaminhadas sem conservantes e processadas no máximo dentro de 1 hora após a coleta (ex: a Shigella sp é uma bactéria muito frágil e não resiste por muito tempo); Semear uma alçada de fezes em placas de SS e MacConckey (grande) após descarregar as fezes; Colocar no selenito, homogeneizar e então colocar uma alçada de fezes; Incubar as placas e o selenito na estufa a 35ºC ± 1º C. HEMOCULTURA Limpar a superficie do frasco com álcool 70% e esperar secar antes de inocular o sangue; LAVADO BRONCO ALVEOLAR Homogeneizar o material. Imergir a alça calibrada na amostra de forma vertical e semear de forma quantitativa na placa de CHOC; Repetir o mesmo procedimento acima com alça calibrada, semeando na placa de AS e MC ; Incubar a 35ºC ± 1ºC em atmosfera adequada (anexo 1) ASPIRADO TRAQUEAL Se necessário diluir 1:10 com solução fisiológica 0,9% (0,1 ml da amostra + 0,9 ml de sol. Fisiológia a 0,9%); Semear com a alça calibrada na placa de CHOC. Semear com a alça calibrada de nas placas de AS e MC. Incubar a 35ºC ± 1ºC em atmosfera adequada (anexo 1) LÍQUOR Centrifugar a amostra a 4500-5000 rpm por 15 minutos; Semear em meios apropriados (anexo 1) por esgotamento; Incubar as placas a 35ºC ± 1ºC em atmosfera adequada (anexo 1). 8. CÁLCULOS/ LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS 9. CONTROLE DE QUALIDADE Consultar Plano de Qualidade PRO/MIC-0001. 10. INTERVALO DE REFERÊNCIA
Versão: 01 Pg: 6/9 11. INTERVALO CRÍTICO 12. CONFIABILIDADE ANALÍTICA 13. INTERFERENTES Placa com meio vencido Meio contaminado Semeadura inadequada Semeadura em meios não recomendáveis 14. INTERVENÇÕES 15. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS - Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds): Manual of Clinical Microbiology, 7ª ed. American Society for Microbiology, Washington, DC, 1999. - Silva CPHM: Bacteriologia, um texto ilustrado, 1ª ed. Rio de Janeiro, Ed. Eventus, 1999. - Koneman, EW: Diagnóstico Microbiologico- Texto e Atlas Colorido, 5ª ed, MEDSI,2001. - Oplustil, CP: Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, Ed. Saraiva, São Paulo, 2000. 16. ANEXOS Anexo 1 Seleção de Meios de Cultura x Amostra Biológica e Incubação Anexo 2 Semeadura quantitativa em estrias Anexo 3 Semeadura por esgotamento
Versão: 01 Pg: 7/9 ANEXO 1 SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA X AMOSTRA BIOLÓGICA Material Cultura para piogênico Agar Chocolat e Agar Sangue MacConke y SS Selenit o Cled Caldo Tioglicoltat o Abcessos X X X X Secreção Orofaringe X X Fezes X X X Fragmento de biópsia X X X Fragmento de tecidos X X X Fragmento ósseo X X X Secreção de ferida X X X Secreção Nasal X X X Secreção ocular X X X Secreção Uretral X X X Urina X X Ponta de Cateter X Lavado Bronco X X X X Alveolar Secreção traqueal X X X X Líquidos orgânicos X X X X Líquor X X X INCUBAÇÃO Meio de cultura Forma de incubação Período Agar Sangue Aerobiose 24/48 horas MacConkey Aerobiose 24/48 horas Ágar Chocolate Microaerofilia 24/48 horas SS Aerobiose 24 horas Tetrationato Aerobiose 24/48 horas Caldo de cultura Aerobiose 24/48 horas OBS: A incubação em microaerofilia deve ser feita colocando a placa em uma jarra hermeticamente fechada com uma vela acesa dentro da estufa de 35º C ± 1ºC ou Capneibac
Versão: 01 Pg: 8/9 ANEXO 2 SEMEADURA QUANTITATIVA EM ESTRIAS ANEXO 3
Versão: 01 Pg: 9/9 SEMEADURA POR ESGOTAMENTO