ANEMIA HEMOLÍTICA AUTO-IMUNE Aspectos moleculares Dra. Lilian Castilho
Os métodos moleculares mudarão a rotina dos laboratórios de Imunohematologia???
HEMAGLUTINAÇÃO Onde estamos falhando? Stainsby et al. Serious hazards of transfusion: a decade of hemovigilance in the UK. TMR 2006; 20:273-82 2623 casos (1996-2004) 10.2%- Reações transfusionais hemolíticas agudas (incompatibilidade ABO) 9.7%- Reações transfusionais hemolíticas tardias
HEMAGLUTINAÇÃO Onde estamos falhando? Reações transfusionais hemolíticas tardias 8 mortes 53% anti-jk a /Jk b 38% anti-rh 14% erros poderiam ter sido evitados melhorando a prática laboratorial (Como melhorar?)
LIMITAÇÕES DA HEMAGLUTINAÇÃO Dificuldade na fenotipagem de pacientes politransfundidos com transfusão recente Dificuldade na fenotipagem de hemácias cobertas com IgG Dificuldade na identificação de ags variantes Dificuldade na identificação de ags de baixa e alta frequência Limitação dos estoques de antígenosnegativos Impossibilidade de determinar zigozidade
LIMITAÇÕES DA HEMAGLUTINAÇÃO O que fazer!
Zoom no DNA Genotipagem!!! Resultados seguros nas situações (AHAI) em que a hemaglutinação é limitada
Análise por DNA em pacientes com TDA positivo Dificuldades na remoção do ac IgG Anticorpos monoclonais IgM ou monoclonais murinos não estão disponíveis Anti-soros são fracamente reativos Antígeno sensível ao tratamento de remoção da IgG
PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAÇÃO NA CLÍNICA AS-PCR, PCR-RFLP, Multiplex RHD D+/D-(DΨ), D parcial, D fraco, Del, zigozidade RHD RHCE C/c, E/e, VS, variantes Rh C, E/e KEL K/k, Js a /Js b FY Fy a /Fy b,gata, Fy x JK Jk a /Jk b GYPB S/s; S-silencioso Dombrock Do a /Do b, HY, JO Diego Di a /Di b, Memphis II
PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAÇÃO NA CLÍNICA Microarray- BeadChip TM, Bioarray Solutions Ltd RHCE C/c, E/e KEL K/k FY Fy a /Fy b,gata, Fy x LW Lw a /Lw b CO Co a /Co b SC Sc1/2 JK Jk a /Jk b GYPA M/N GYPB S/s, S silencing, U var DO Do a /Do b, Hy, Jo DI Di a /Di b LU Lu a /Lu b
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA AHAI 2003-2006 Total de pacientes: 28 Em 28 pacientes a genotipagem auxiliou na dedução do perfil antigênico (Rh, Kell, FY, JK, Ss) e consequentemente na seleção de sangue fenótipo compatível Em 8 pacientes foi possível diferenciar alo de auto Em 11 pacientes foi possível identificar aloanticorpos após adsorções alogênicas 8 pacientes foram genotipados como FYB-33 e puderam receber sangue Fy(b+)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 1-HISTÓRICO Paciente feminina descendente de Africanos, 52 anos Transfusões prévias? Diagnóstico: AHAI, Hb 6.8 Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG 1 ) PAI positiva 2+ em AGH Painel positivo 2+ em AGH com todas as células, Autocontrole positivo
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 1-GENOTIPAGEM ChipName Sample WarnMsg c C e E K k Fya Fyb Jka Jkb M N S s Lua Lub Doa Dob Jo(a) Hy LWa LWb Dia Dib Coa Cob Sc1 Sc2 HgbS Silencing FY Fyx[Fy(b+w) Cmmnt HEA04961_1 A1 + - + - + + - + - + + + - + - + + + + + + - - + + - + - - 1 No HEA04961_2 A2 + - + - - + + + + - + + - + - + + + + + + - - + + - + - - No No HEA04961_3 A3 + - + - - + + - + + + - - + - + - + + + + - - + + - + - - 1 No HEA04961_4 A4 + - + - - + - - + + + - - + - + - + + + + - + + + - + - + 2 1 HEA04961_5 A5 + - + - - + - - + + - + + + + + - + + + + - - + + - + - - 2 No HEA04961_6 A6 - + + - - + + - + + - + - + - + + + + + + - - + + - + - ++ 1 No HEA04961_7 A7 - + + - - + + - + + - + - + - + + + + + - - + + - + - - No No HEA04961_8 A8 - + + - - + - - + - + - - + - + + + + + + - - + + - + - + 2 No Fenótipo da paciente: O, Ro, K-k+, K Fy(a (a-b-), Jk(a+b (a+b-), M+N-S-s+, Do(a+b+), Hy+, Jo(a+), Di(a (a-b+), Co(a+b-), Sc1,-2 Lu(a (a-b+),
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 1-CONCLUSÃO Adsorção alogênica com hemácias R 0 r, K-, Fy(a-), Jk(b-), S- Paciente com anti-e, -K, -Jk b, -S Confirmação sorológica com adsorções seletivas Transfusão fenótipo compatível (E-, K-, Jk(b (b-), S-) e Fy(b+) Aumento níveis de Hb de 6.8 para 8.6 após transfusão
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 2-HISTÓRICO Paciente masculino caucasóide 64 anos Portador de AHAI, politransfundido Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG 3 ) PAI positiva/auto Auto-controle positivo Anticorpos identificados no soro: anti-d, auto-igg Fenotipagem: R 1 R 2, K-, Fy(a+b+), (a+b+),jk Jk(a+b+) Provas de compatibilidade: incompatíveis
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM Genótipo do paciente: RHD+, RH*Cc RH*Cc, Cc, RH*ee RH*ee, ee, s+ normal, S+ GATA JK B/JK B 100 pb FY A/FY A K2K2 100 pb RH ee 100 pb RHDCc 100pb KEL*2/KEL*2, FY*A/FY*A JK*B/JK*B, GYPB*S/s
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM Genotipagem complementar RHD Fraco, RHD parcial RHD Fraco: negativo DVI 100 pb RHD Parcial: positivo (D parcial categoria VI)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 2- CONCLUSÃO Adsorção alogênica com hemácias R 1 r, K-, Fy(b-), Jk(a-) Acs identificados no soro do paciente: anti-d, - Jk a Sangue selecionado para a transfusão: rr, K-, Jk(a (a-), Fy(b (b-) Avaliação do significado clínico do auto-ac ac antes da transfusão
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 3- HISTÓRICO Paciente transfundido a cada 3 semanas com 2 unidades de concentrado de hemácias História de anti-c, -E, -K Serviço de Hemoterapia do Hospital relata reatividade adicional Suspeita:anti-Jk a
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 3- INVESTIGAÇÃO SOROLÓGICA Laboratório de referência confirma anti-c, -E, -K Autoanticorpo IgG também é detectado Fenotipagem demonstra campo misto Por segurança o hospital seleciona unidades de hemácias c, E, K, Jk(a )
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 3- GENOTIPAGEM/CONCLUSÃO Genotipagem: RHD+, RH*C/C, RH*e/e, KEL*2/2, FY*A/B, JK*A/B Fenótipo deduzido: R 1 R 1, K-k+, Fy(a+b+), Jk(a+b+) Paciente não desenvolverá aloanti-jk a 1 em 6 unidades são c, E, K 1 em 25 unidades são c, E, K, Jk(a )
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 4- HISTÓRICO/GENOTIPAGEM Paciente com sinais e sintomas de hemólise Transfundido com 2 unidades de concentrado de hemácias Identificado: anti-jk a ; Jk(a+ CM ) Interpretação: reação transfusional [recebeu hemácias Jk(a+) em outro hospital] Genotipagem: JK*A/JK*A Interpretação: Jk(a+), autoanti-jk a ( IgG 3 hemolítico)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 5-HISTÓRICO/GENOTIPAGEM Paciente com AHAI, O RhD+, TDA+ História transfusional:? Ac identificado no eluato e soro: anti-d Auto ou alo? Genotipagem: D fraco tipo 1 Interpretação: auto-anti-d ( IgG 1 não hemolítico) Sangue selecionado para transfusão: O RhD+
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 6-HISTÓRICO Paciente (O RhD-negativo) admitido no hospital com Hb de 4.5 g/l, 6 dias após cirurgia e transfusão TDA positivo com C3; eluato negativo PAI: ac com fraca reatividade em PEG e LISS- Coombs e reativo em papaína Transfundido com hemácias O, Jk(b ), Le(a ) Hemólise após transfusão
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLÍNICA CASO CLINICO 6-HISTÓRICO/GENOTIPAGEM Nenhum anticorpo contra drogas detectado Teste de Donath Landsteiner negativo Interpretação hemólise foi um resultado da transfusão! Fenótipo deduzido do genótipo:s+s+, K, Fy(a b+), Jk(a+b ) Campo misto na fenotipagem Fy a demonstrou sobrevida de hemácias do doador na circulação do paciente
Importância da genotipagem em pacientes com AHAI Identificação de aloanticorpos Diferenciação entre alo e auto Selecionar hemácias fenotipicamente compatíveis Prevenção da aloimunização Aumento da sobrevida das hemácias transfundidas
GENOTIPAGEM NA CLÍNICA Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer: Conhecimento em grupos sanguíneos Experiência na interpretação das reações de PCR utilizadas Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do paciente antes de interpretar os resultados da genotipagem Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS e suas formas variantes (fenótipos e genótipos podem não correlacionar) na população estudada
HEMOCENTRO UNICAMP Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos 19991999-Lab pesquisa protocolos moleculares na Imunohematologia clínica uso rotineiro quando resultados sorológicos são questionáveis ou duvidosos, duvidosos, fenotipagens não disponíveis, disponíveis, genotipagem pode auxiliar na recomendação da conduta transfusional (auto/alo (auto/alo) alo) integra o Consortium for Blood Group Genes (CBGG) participa de testes de proficiência (ISBT e NYBC)
Transfusão em pacientes com AHAI O que fazer? Como fazer? Significado clínico do autoac Investigação de aloanticorpos Fenotipagem Genotipagem
Fenotipagem eritrocitária Vantagens Técnica simples e rápida Não requer equipamento sofisticado Sensibilidade e especificidade Desvantagens Valor limitado em pacientes recentemente transfundidos ou que apresentam teste direto da antiglobulina positivo 4+ (Auto IgG + C)
Vantagens Genotipagem eritrocitária Resultados seguros nas situações (AHAI) em que a hemaglutinação é limitada Desvantagens Requer mais tempo na execução Maior custo Fácil contaminação
Gen Genótipo tipo Fen Fenótipo tipo aglutinação DNA + Técnicas Técnicas Técnicas Técnicas Técnicas Técnicas Técnicas Técnicas moleculares moleculares moleculares moleculares moleculares moleculares moleculares moleculares: potencial potencial potencial potencial potencial potencial potencial potencial para para para para para para para para mudar mudar mudar mudar mudar mudar mudar mudar a prática prática prática prática prática prática prática prática na na na na na na na na medicina medicina medicina medicina medicina medicina medicina medicina transfusional transfusional transfusional transfusional transfusional transfusional transfusional transfusional Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia Imunohematologia