Formação de Biofilmes Microbianos Prof Dra Luciana Maria Ramires Esper Universidade Federal Fluminense V Simpósio Brasileiro de Microbiologia Aplicada 28/09/2011 SUMÁRIO INTRODUÇÃO CARACTERÍSTICA E ARQUITETURA DOS BIOFILMES FORMAÇÃO DE BIOFILME COMUNICAÇÃO INTERCELULAR (QUORUM SENSING) BIOFILME NA INDUSTRIA DE ALIMENTOS SANITIZANTES AVALIAÇÃO DE BIOFILME CONTROLE E PREVENÇÃO DE BIOFILMES CONSIDERAÇÕES FINAIS 1
Introdução Por muito tempo foi considerado que as bactérias viviam de forma isolada. No entanto, observou-se que ocorre associação, e nas últimas décadas também uma comunicação entre as bactérias. Esse tipo de comportamento comunitário permite a formação de uma estrutura multicelular complexa denominada BIOFILME (FUQUA et al., 1996). A definição exata do que seja biofilme ainda não é consensual nos meios acadêmicos e há várias definições descritas na literatura Definição : Biofilmes uma comunidade complexa e estruturada de microrganismos, envoltos por uma matriz extracelular de polissacarídeos, aderidos entre si a uma superfície ou interface (Costernon et al., 1995). 2
Biofilmes no setor da saúde Biofilmes formados sobre ou dentro de aparatos médicos constituem uma séria ameaça à saúde pública. Implante Fonte: Xavier,2005 Introdução Importância dos biofilmes Tem grande importância em inúmeras atividades humanas Estações de tratamento de águas ou de efluentes Numerosos bioprocessos também utilizam biofilmes: * biorreatores para a produção de fermentados * produção de vinagre * ácido cítrico *vinhos 3
Introdução A ocorrência de biofilmes ganha cada vez mais destaque nas discussões focadas em qualidade e segurança de alimentos. Estas estruturas, uma vez constituídas, agem como ponto de contaminação constante, liberando células de microrganismos patogênicos e deteriorantes, podendo comprometer, assim, a qualidade microbiológica de matérias-primas, insumos e alimentos processados. O crescimento não desejado de biofilmes, tem um impacto negativo em várias atividades Trocadores de calor: aumento da resistência do fluxo e da taxa de transferência de calor. Membranas de filtração: reduz o fluxo através da membrana, entupimento. Biocorrosão de materiais, como o aço inoxidável. Contaminação dos alimentos por microrganismos deteriorantes e patógenos 4
Características e arquitetura dos biofilmes As células aderidas são designadas por sésseis, enquanto aquelas livres e dispersas são denominadas por planctônicas. Um biofilme corresponde a uma comunidade de células sésseis aderidas a um substrato, embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares, na qual existem diferenciados fenótipos, metabolismo, fisiologia e transcrição genética. Células planctônicas sésseis Superfície 5
São complexas comunidades mono ou multiespécies (indústria de alimentos), ancoradas a uma superfície, sendo estas embebidas em uma matriz constituída, basicamente por exopolissacarídeo (EPS). Exopolissacarídeos Vital importância no processo de ancoragem dos microrganismos A matriz de polímeros extracelulares (EPS) de natureza polissacarídea ou proteica, expõe-se exteriormente à membrana externa das células Gram negativas e ao peptídeoglicano das Gram positivas, é sintetizado pôr polimerases, constituindo-se em uma estrutura complexa bem hidratada 6
Um dos grandes responsáveis por conferir proteção aos sanitizantes são os EPS, que agem como barreira física impedindo que sanitizantes cheguem a seus sítios de ação como, por exemplo, a membrana de gram-negativos. Em alguns casos o EPS é capaz de sequestrar cátions, metais e toxinas, conferindo também proteção contra radiações UV, alterações de ph, choques osmóticos e dessecação. SANITIZANTES ANTIBIÓTICOS As células em biofilme são de 500 até 1000 vezes mais resistentes quando comparadas às células planctônicas. São percebidas muitas alterações fenotípicas, principalmente nos aparatos de motilidade, no tamanho da célula e no metabolismo, decorrentes da restrição de nutrientes e de oxigênio em algumas fases, da variação na taxa de reprodução e em toda a regulação gênica. Biofilmes são as únicas estruturas microbianas que permitem a coexistência de organismos aeróbios e anaeróbios estritos a distâncias de poucas centenas de micrômetros um do outro. 7
São compostos por microcanais internos, úteis na distribuição de nutrientes e água, no escoamento de metabólitos, alguns potencialmente patogênicos ao homem, nas enzimas alginatoliases e as proteases, necessárias ao destacamento de células do biofilme e na distribuição de moléculas sinalizadoras de quorum sensing (Hall-Stoodley et al, 2004) Como etapas importantes para sua formação são descritas as bioadesões iniciais, passando os microrganismos de seu estilo de vida planctônico ao séssil, a formação de microcolônias, a maturação do biofilme e o destacamento de células, retornando ao seu estilo de vida planctônico. Etapas que uma nova espécie bacteriana realiza, durante sua incorporação em um biofilme (Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675 2679, 2000) Estudo microscópico da formação de um biofilme por V. cholerae (Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675 2679, 2000) 8
(Xavier, 2002) COMUNICAÇÃO INTERCELULAR Uma vez que o biofilme é constituído de agregados de células e a formação de sua estrutura tridimendisional é um processo dinâmico que envolve uma série de eventos moleculares coordenados, ele representa um ambiente propício para a comunicação célula-célula, ou quorum sensing (QS) Sistema de comunicação dependente de densidade populacional em bactérias. 9
Motilidade Esporulação Fatores de virulência Biofilmes Produção de antibióticos bactéria Molécula sinalizadora Proteína receptora Promotor DNA 10
BIOFILMES EM INDÚSTRIAS E UNIDADES PROCESSADORAS DE ALIMENTOS. Alguns micro-organismos patogênicos presentes em alimentos podem facilmente formar ou fazer parte da comunidade de microrganismos presentes em um biofilme. E. coli Salmonella sp Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Bacillus cereus Yersinia enterocolitica Microrganismos Deteriorantes Pseudomonas fragi, Micrococcus sp, Pseudomonas fluorescens, Enterococcus faecium Nas indústrias de alimentos devido à diversidade da produção, das matérias primas e dos produtos, pode ocorrer a formação de biofilmes com composição heterogênea e com comportamentos os mais variados. Em biofilme composto por multi-espécies, fato mais comum na natureza, os produtos metabólicos de um microrganismo podem servir para o crescimento da outra espécie e a adesão de uma espécie pode prover substâncias ligantes que permitem a adesão de outras. Todavia, a competição por nutrientes e o acúmulo de produtos tóxicos gerados podem limitar a diversidade microbiana em um biofilme. 11
Shi e Zhu, 2009 BIOFILMES EM INDÚSTRIAS E UNIDADES PROCESSADORAS DE ALIMENTOS. É possível ocorrer adesão bacteriana e formação de biofilme em praticamente todas as superfícies envolvidas no processamento de alimentos desde as rugosas, que apresentam fissuras e fendas até as consideradas mais lisas. Formação em qualquer tipo de superfície: aço-inoxidável, borracha, nylon, alumínio, teflon, etc. 12
Fonte: Andrade, 2009 Fonte: Andrade, 2009 13
Aço inoxidável AISI 304 Fonte: Carelli, 2005 A adesão bacteriana depende das propriedades físico-químicas do material do substrato e da superfície da célula. 14
Sanitizantes Um biofilme microbiano presente numa superfície com resíduos oriundos do alimento impede um efetiva penetração do sanitizante para eliminar microrganismos. O sanitizante reage inicialmente com: resíduos de proteínas, gordura, carboidratos e minerais. Ao final, pouca atividade do sanitizante resta para agir sobre os microrganismos no biofilme. Sabe-se que, quando o biofilme é tratado corretamente com detergente antes do uso dos sanitizantes, os microrganismos geralmente são eliminados. No entanto, procedimentos de higienização incorretos não removem nem inativam ao microrganismos aderidos EFICIÊNCIA DO SANITIZANTE Depende dos microrganismos envolvidos, das condições da aderência e desenvolvimento e características do biofilme. 15
AVALIAÇÃO DE BIOFILME NA INDUSTRIA DE ALIMENTOS Atualmente, vários métodos são usados na detecção e monitoramento da carga microbiana de superfícies envolvidas na produção de alimentos. As técnicas de microscopia eletrônica apresentam alto poder de resolução e comprimento de onda muito curto (0,5 A) de feixe de elétrons, permitindo observar as amostras em aumentos maiores quando comparado com a microscopia óptica comum 16
Fonte: Esper, 2010 Prevenção Controle/ Prevenção O melhor caminho para controlar os biofilmes baseia-se na prevenção de seu desenvolvimento A estratégia número um de controle é a prática de adequados procedimentos de higiene industrial, com finalidade de remover resíduos e células de micro-organismos de superfícies, impedindo o inicio de todo o processo. 17
Prevenção Desenho correto das superfícies dos equipamentos em contato com os alimentos. O tipo do material usado nos equipamentos deve ser de fácil limpeza e resistência a corrosão. É difícil erradicar um biofilme utilizando um único tipo de tratamento ou um único desinfetante ou detergente. Os equipamentos devem ser desmontáveis facilmente para a limpeza ou que possam ser limpos sem ter que desmonta-los Prevenção Boas Práticas e Sistema APPCC A implantação de sistemas de qualidade como: Boas Práticas de Fabricação (BPF) Sistema de Análises de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) São ferramentas eficazes para garantir a produção de alimentos seguros, simplificando as ações de segurança dos alimentos, indicando operações críticas e chaves do processo e oferecendo formas eficientes para controlá-las e monitorá-las. Possibilitando, portanto, também prevenir a formação de biofilmes. 18
Referências ANDRADE, N. J.; PINTO, C. L. O.; LIMA, J. C. Adesão e formação de biofilmes microbianos. In: ANDRADE, N. J. Higiene na Indústria de Alimentos - Avaliação e controle da adesão e formação de biofilmes bacterianos. São Paulo (SP): Varela. 410p, 2008. COSTERTON, J.W.; LEWANDOWSKI, Z.; CALDWELL, D.E.; KORBER, D.R.; LAPPIN-SOCOTT, H.M. Microbial Biofilms. Ann. Rev. Microbiol, v. 49.p.711-745, 1995. SHI,X.;ZHU. X. Biofilm formation and food safety in food industries. Trends in Food Science and Technology. doi:10.1016/j.tifs.2009.01.054,2009 WATNICK, P.; KOLTER, R. Minireview Biofilm, city of microbes. Journal of Bacteriology, v.182, p. 2675-2679, 2000. XAVIER,J.B., PICIOREANU,C., ALMEIDA,J.S., VAN LOOSDRECHT, M.C.M. Monitorização e modelação da estrutura de biofilme. Boletim de Biotecnologia, 2005. Muito Obrigada!!! lesper@id.uff.br 19