Eficácia do desinfetante Herbalvet T.A. na inibição da evolução de ovos de Ancylostoma ssp. de cães naturalmente infectados INTRODUÇÃO A relação homem-animal mudou consideravelmente, sendo que nos dias atuais os cães e gatos passaram a serem membros da família brasileira. Os cães ainda são os preferidos entre os animais de estimação, mas a presença desses animais domésticos sem os devidos cuidados sanitários podem acarretar um grande risco a saúde humana, principalmente se estes animais forem abandonados nas ruas sem nenhum tipo de tratamento veterinário ou controle de enfermidades. (1) O Brasil é um país de dimensões continentais que possui um clima predominantemente tropical e subtropical úmido, essas características são altamente favoráveis à ocorrência de doenças parasitárias, refletindo em taxas de morbidade e mortalidade elevadas em todas as regiões do país, com destaque para as regiões litorâneas. (2) As parasitoses gastrintestinais estão entre as doenças mais frequentes e importantes dos cães neonatos e jovens, sendo o Ancylostoma caninum e o Ancylostoma braziliense as espécies mais prevalentes. (3,4) O Ancylostoma caninum é a principal espécie causadora da síndrome da larva migrans cutânea e eventualmente por enterites eosinofílicas em humanos evidenciando o caráter zoonótico do parasita. (5,6) Ancylostoma sp. pertence ao filo nematoda, família Ancylostomatidae, nutrindo-se de sangue principalmente do intestino delgado do hospedeiro definitivo. Os exemplares possuem coloração branco acinzentada e uma cápsula bucal grande, com três pares de dentes marginais, que são utilizados para a fixação na mucosa do intestinal hospedeiro, os machos podem medir de 9 a 13mm e as fêmeas de 14 a 20mm (7). As femêas do Ancylostoma caninum produzem individualmente em torno de dez mil a vinte e cinco mil ovos diariamente, que são eliminados com as fezes dos hospedeiros. Os ovos embrionam e se dispersam no ambiente, liberando larvas que após alguns dias evoluem para a forma infectante (8,9,10).
Gatos e cães domiciliados (10) que não recebem acompanhamento veterinário de rotina, ou tratamento com medicação antiparasitária, assim como os animais errantes, normalmente excluídos da maioria dos programas de sanidade animal, desempenham importante papel epidemiológico na manutenção e disseminação de enteroparasitas, eliminados através das fezes em áreas urbanas (8,9,10). Crianças e adultos que utilizam as vias públicas, praças e outros ambientes para trânsito e lazer, poderão infectar-se pela ingestão acidental de ovos e cistos, ou ainda pela migração cutânea de helmintos em fase larval. A contaminação humana com ovos embrionados ou estágios larvais de alguns desses parasitos podem acarretar na migração errática de suas larvas através dos tecidos. Pelo fato do homem não ser o hospedeiro habitual, as larvas podem não completar o seu ciclo evolutivo, e permanecerem vivas por períodos prolongados e provocar várias manifestações clínicas. Neste contexto, a Ancylostomose torna-se de importância também para profissionais que trabalham na área veterinária, como os auxiliares, enfermeiros e médicos veterinários que podem se infectar durante a rotina, caracterizando uma infecção ocupacional. Pelo fato do homem não ser o hospedeiro habitual, as larvas não conseguem completar o seu ciclo evolutivo, e desta forma permanecem vivas por períodos prolongados provocando várias manifestações clínicas. (12) O Herbalvet T.A. é um produto desenvolvido pela empresa Ouro Fino, e está indicado como desinfetante (bactericida, fungicida e viricida) e desodorizante, o produto apresenta propriedades tensoativas, biodegradável e não corrosiva. Há indicação de uso para clínicas e Hospitais veterinários, canis, gatis, para limpeza e desinfecção de piso, paredes, salas de banho e tosa, mesas de atendimento e de cirurgia, além dos instrumentais cirúrgicos. O poder tensoativo do Herbalvet T.A. rompe a camada invisível de mucopolissacarídeos, lipídios e proteínas (biofilme, que protege a colônia microbiana) o que promove a ação desinfetante. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar a atividade in vitro do desinfetante comercial Herbalvet T.A. em diferentes concentrações frente a ovos do parasito Ancylostoma sp.
MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção das amostras fecais As amostras de fezes foram obtidas mediante coletas de animais do Ambulatório Veterinário Ceval, do ambiente do canil Municipal de Pelotas e do Hospital de Clínicas Veterinária da FAvet., sendo estas armazenadas e encaminhadas para análise no Laboratório de Helmintologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia - IB (UFPel). Obtenção do produto O produto comercial Herbal Vet foi adquirido no comércio, em loja veterinária especializada de Pelotas, RS. Recuperação dos ovos do gênero Ancylostoma: As amostras de material fecal foram processadas pela técnica de flutuação de Willis Mollay para determinar a positividade das amostras fecais para ovos de Ancylostoma. (14) Para a recuperação dos ovos, as fezes positivas foram maceradas, diluídas em água destilada e passadas através de quatro tamises, dispostos em ordem decrescente de abertura de malha (1 mm, 105 µm, 55 µm, 25 µm), segundo Ueno e Gonçalves (1998). Os ovos foram recuperados do último tamis, diluídos em água destilada e quantificados três vezes a partir de uma alíquota de 50µl da suspensão. (14) Testes in vitro de Inibição da Eclodibilidade: O teste de eclodibilidade foi realizado em placas de microcultivo de 24 poços, onde o produto Herbal Vet foi distribuído em doze concentrações (15% a 0.0062%) juntamente com a suspensão contendo aproximadamente 150 ovos do parasito. O ensaio foi acompanhado de um controle negativo com água destilada e suspensão de ovos. Todas as concentrações foram testadas em quadruplicata, sendo as placas lacradas com filme plástico e incubadas em estufa B.O.D a 28 C com 80% de umidade relativa por 24 e 36h. A leitura das placas foi realizada com o auxílio de um microscópio de luz invertida. (15) A eficácia de cada tratamento no teste de eclosão de ovos foi determinada conforme a equação: RESULTADOS % de Inibição da Eclodibilidade = (nº de larvas _X100 (nº de larvas + nº de ovos)
Os testes foram desenvolvidos nas concentrações de 15% a 0.0062% do produto, confrontados com a suspensão contendo aproximadamente 150 ovos do parasito. Após o período de 24 h e de 36h foram realizadas as leituras das diferentes concentrações e controles distribuídas nas placas de microdiluição, observando-se que no controle positivo houve inibição de 100% da eclosão dos ovos, enquanto que o controle negativo demonstrou um percentual médio de eclodibilidade de 95% demonstrando uma boa viabilidade dos ovos. Quando se avaliou o teste com o produto Herbalvet T.A. foi possível verificar a inibição da eclosão do ovos do parasito em todas as concentrações testadas, assim como a inibição da formação da larva L1 no interior do ovo, demonstrando assim um poder ovicida (FIGURA 2) e larvicida (FIGURA 3). FIGURA 2: Avaliação microscópica das placas de microdiluição em 24h após o contato com o produto Herbalvet, demonstrando a presença de ovos de Ancylostoma sp. não eclodidos. FIGURA 3: Avaliação microscópica das placas de microdiluição em 36h após o contato com o produto Herbalvet, demonstrando a morte das larvas no interior dos ovos de Ancylostoma sp. DISCUSSÃO Quando se trata de preferência entre espécie animal entre os pets, os cães ainda são considerados os animais de maior importância, e este mercado cresce e movimenta milhões ao ano. Devido a intima relação dos cães com as pessoas o controle de enfermidades e saúde em geral, torna-se extremamente importante, destacando-se aquelas de caráter zoonótico como a ancilostomose. Esta parasitose apresenta distribuição universal em regiões tropicais e subtropicais, estando associado a áreas sem saneamento, áreas de recreação como praças e parques, onde após a contaminação ambiental por fezes de animais parasitados, ocorre o contato e infecção das populações pelo nematódeo.
É relevante salientar que a cidade de Pelotas, está localizada às margens do Canal São Gonçalo, que liga as lagoas dos Patos e Mirim no estado do Rio Grande do Sul, no extremo sul do Brasil. Caracterizando-se como uma cidade de balneários, sendo a região, considerada como um ambiente propício para o desenvolvimento e manutenção das parasitoses. Estudo realizado em Santa Vitória do Palmar, demonstraram uma contaminação de 95,14% de cães estudados parasitados com Ancylostoma sp. (17) ; (4) ao avaliar amostras de cães da área urbana de Pelotas, encontraram 29,9% de cães parasitados. Outro aspecto importante a considerar na epidemiologia da Ancilostomose, seria a contaminação do ambiente onde ficam alojados muitos animais, a manutenção de camas sujas ou canis com fezes, especialmente em locais úmidos, a exemplo de clínicas e domicílios, onde não há incidência direta de luz solar, pode resultar na contaminação maciça pelos parasitas, sendo importante o uso de produtos que interfiram no ciclo dos parasitas. O uso de princípios ativos indequados e em subdosagem, bem como a não rotação de anti-helminticos resulta na seleção de uma população de parasitos resistentes o que dificulta o controle da Ancilostomose, sendo assim se faz necessário o estudo de novas alternativas para a redução da contaminação ambiental diminuindo o risco de zoonoses para o homem. (16) Em nossa avaliação no ensaio in vitro, o desinfetante Herbalvet T.A demonstrou um grande potencial ovivida e larvicida, já que a diluição do produto indicada como desinfetante é bem superior aquela encontrada pelo estudo com ação ovicida, e nossos testes demonstraram que em concentração de 0,06% há inibição dos ovos, ou seja em concentrações dez vezes menores daquelas utilizadas em ambiente. Outro aspecto a ser explorado, seria o tempo de inibição da eclosão dos ovos, como este foi o primeiro trabalho desenvolvido, utilizamos períodos padrões de testes de antiparasitários, mas é possível que se observe a eficácia do produto em tempos bem inferiores, o que deverá ser avaliado futuramente. CONCLUSÃO O produto comercial Herbalvet T.A., mesmo não apresentando em sua bula indicação de uso como ovicida, apresentou nas condições controladas do teste esta ação, em todas as concentrações testadas, impedindo a
blastomeração do ovo com formação de L1, interrompendo, assim o ciclo de vida do parasito Ancylostoma. REFERÊNCIAS 1-SANTOS S.V; CASTRO, J.M. Ocorrência de Agentes Parasitários com Potencial Zoonótico de Transmissão em Fezes de Cães Domiciliados do Município de Guarulhos SP. 2006. 2- AHID, S.M.M; SUASSUNA, A.C.D; FILGUEIRA, K.D. Fauna Parasitológica em Animais Domésticos e Exóticos no município de Mossoró-RN. Biociências. Porto Alegre, v.17, n.1, p.44-47, dez., 2009. 3- SANTARÉM, V.A.; GIUFFRIDA, R.; ZANIN, G. A. Larva migrans cutânea: ocorrência de casos humanos e identificação de larvas de Ancylostoma spp em parque público do município de Taciba, São Paulo. Revista Brasileira de Medicina Tropical, Rio de Janeiro, v.37, n.2, p.179-181, 2004. 4- XAVIER, Graciela Augusto. PREVALÊNCIA DE ENDOPARASITOS EM CÃES DE COMPANHIA EM PELOTAS-RS E RISCO ZOONÓTICO. 2006. 73f. Monografia (Bacharel em Ciências Biológicas, área de concentração em Meio Ambiente do Curso de Ciências Biológicas do Instituto de Biologia)- Universidade Federal de Pelotas, Pelotas RS. 5-NUNES, C. M.; PENA, F.C; NEGRELLI, G. B.; ANJO, C. G. S.; NAKANO, M. M.; STOBBE, N. S. Ocorrência de larva migrans na areia de áreas de lazer das escolas municipais de ensino infantil, Araçatuba, SP, Brasil. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v.34, n.6, p.656-658, 2000. 6-NEVES, David Pereira; MELO, Alan Lane de; LINARDI, Pedro Marcos; VITOR, Ricardo W. Almeida Parasitologia Humana. 12 ed. São Paulo: Atheneu, 2011. 548p. 7-FORTES, E. Parasitologia Veterinária. 4.ed. São Paulo: Ícone, 2004. 8-SANTARÉM, V. A.; GIUFFRIDA, R.; ZANIN,G. A. Larva migrans cutânea: ocorrência de casos humanos e identificação de larvas de Ancylostoma spp. em parque público o município de Taciba, São Paulo. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Uberaba, v.37, n.2, p.179-181, 2004. 9- GUIMARÃES, A. M.; ALVES, E. G. L.; REZENDE, G. F.; RODRIGUES, M. C. Ovos de Toxocara sp. e larvas de Ancylostoma sp. em praça pública de Lavras, MG. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v.39, n. 2, p. 293-295, 2005. 10- BRAVO, T. C. Larva migrans cutánea: revisión del tema y descripción de cuatro casos. Medicina Interna de México, México, v.22, n.2, p 143-148, 2006. 11- PRATES, L.; PACHECO, L. S.; KUHL, J. B.; DIAS, M. L. G. G.; ARAÚJO, S. M.; PUPULIN, A. R. T. Frequência de parasitos intestinais em cães domiciliados da cidade de Maringá, PR. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte,v.61, n.6, p. 1468-1470, 2009. 12- AIRES, W. O.; FRIAS, R. B.; PASCHOAL, G. R. Toxocaríase e Larva Migrans Visceral. Revista Ciêntífica Eletrônica de Medicina Veterinária. São Paulo, ano VI, n.11. 2008. 13- AHID, S.M.M; SUASSUNA, A.C.D; FILGUEIRA, K.D. Fauna Parasitológica em Animais Domésticos e Exóticos no município de Mossoró-RN. Biociências. Porto Alegre, v.17, n.1, p.44-47, dez., 2009. 14- UENO, H. & GONÇALVES, P.C. Manual para Diagnóstico das Helmintoses de Ruminantes,4ºed Tokyo,Japâo 15-COLES, G.C.; BAUER, C.; BORGSTEEDE, F.H.M.; KLEI, T.R.; TAYLOR, M.A.;WALLER, P.J. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology, v. 44, p. 35-44, 1992. 16- SANTOS, I. de A. et al. Avaliação da atividade ovicida e larvicida de dez extratos vegetais ante Ancylostoma ssp. Revista de Patologia Tropical, v. 42, n. 2, 2013. 17- FREITAS, D.F. et al. Prevalência de endoparasitas em cães errantes do extremo sul do RS. Disponível em: http//www.ufpel..edu.br/cic/2005/arquivos CB 01259.
ANEXOS PROTOCOLO LABORATÓRIO SANIDADE ANIMAL N 3/2009) Protocolo de recuperação de ovos de nematóides gastrintestinais Coletar fezes do reto de animais infectados que apresentem OPG acima de 2000; ovos Pegar uma porção das fezes, macerar e acrescentar água morna (± 40 C); Filtrar o material fecal em quatro peneiras com as seguintes reticulações: 1mm, 105μm, 55μm e 25μm; Lavar a peneira de 25μm com água destilada, com auxílio de pisseta, para retirar os ovos que ficaram retidos; Colocar este conteúdo em um Béquer e posteriormente transferi-lo para tubos Falcon; Colocar os tubos Falcon em centrífuga por 5 min a 3000 rpm (1.100 xg); Após a centrifugação, descartar o sobrenadante, completar com solução salina saturada para a suspensão dos ovos; Centrifugar por 5 min a 3000 rpm; Após a centrifugação, despejar o sobrenadante na peneira de 25 μm e lavar com água destilada (Caso a suspensão fique suja, repetir a centrifugação com solução salina saturada); Despejar o conteúdo da peneira em um cálice de decantação (1h); deixar a temperatura ambiente, desde que a mesma não seja inferior a 22 C, nesse caso colocar em B.O.D OBS: A quantidade de fezes a ser macerada dependerá do OPG, quanto menor o resultado do OPG maior quantidade de fezes será necessária para uma recuperação de ovos satisfatória. O tempo de decantação também varia conforme o OPG, quanto maior o resultado do OPG, menor será o tempo de decantação.
Placa de microcultivo com diluições do Herbalvet
Placa de microcultivo controle negativo.