QO423 Espectrometria de Massas
Oqueéamassadeumátomo? um M = 5 1 H (1p, 1e) = 1.0079 2 H (1p, 1n, 1e) = 2.0141 4 He (2p, 2n, 2e) = 4.0026 4 He/ 2 H = 1.98!!
Como é um átomo? Como o núcleo não explode?!! Modelo de Bohr
Forças Fundamentais E = m. c 2
Qual é a massa de um átomo? Massa = Soma das massas das partículas Energia liberada na formação do átomo (núcleo)
Defeito de massa Nenhum átomo (c/ excessão do 12 C) tem massa inteira Diferença é chamada de Defeito de Massa
Defeito de Massa
Energia de Ligação do Núcleo e Defeito de Massa 0,02 0,00 De efeito de Massa -0,02-0,04-0,06 H He Li Be B C N O F Ne Na Mg Al Si P S Cl Elemento
Unidade de massa atômica (u) u = 1.6605 x 10-27 kg ( 1/12 12 C) Proton: 1.6726 10-27 kg (1.0073 u) Nêutron:1.6749 x 10-27 kg (1.0086 u) Elétron: 9.1093 10-31 kg (0.0005u)
Tipos de massas atômicas Nominal: Massa aredondada em 1 u: H = 1, C = 12, Cl = 35 Média: Massa média dos isótopos: H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532 Monoisotópica: i Massa do isótopo mais abundante: H = 1.0078, C = 12.0000, Cl = 34.9688
Massas Moleculares Exatas Consiste na soma das massas atômicas É única para cada fórmula N 2 = 28.0061 C 2 H 4 = 28.0313 CO = 27.9949 B 2 H 6 = 28.0656
Isótopos Naturais Substâncias Orgânicas: 1 H (99.98%), 98%) 2 H (0.01%) 01%) 12 C (98.93%), 13 C (1.07%) 14 N (99.63%), 15 N (0.37%) 16 O (99.80%), 18 O (0.20%) 32 S (94.93%), 34 S (4.29%) 35 Cl (75.78%), 37 Cl (24.22%) 79 Br (50.69%), 81 Br (49.31%)
MS e Padrão Isotópico MS mede isótopos individuais e não massas médias Substâncias apresentam várias massas dependendo da composição isotópica Composição isotópica varia de acordo com a composição química
Padrão Isotópico 100 16.0313 9.88e12 % CH 4 0 14 15 16 17 18 19 20 mass
100 78.0470 9.35e12 C 6 H 6 % 79.0470 0 76 77 78 79 80 81 82 mass [M+1] = 6%
[M 1] 22 5% [M+1] = 22.5% [M+2] = 2.3% Benzo[a]Pireno: C 20 H 12
100 368.1372 7.84e12 C 20 H 20 N 2 O 5 % 369.1372 0 370.1450 367 368 369 370 371 372 373 374 375 mass [M+1] = 23 4% [M+1] = 23.4% [M+2] = 3.6%
100 49.9923 7.49e12 % 51.9923 0 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 mass CH 3 Cl
100 83.9534 5.68e12 85.9534 CH 2 Cl 2 % 87.9455 0 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 mass [M+1] = 1% [M+2] = 64% [M+3] = 0% [M+4] = 10%
100 204.0473 5.13e12 206.0473 % C 10 H 14 Cl 2 205.0473 208.0394 207.0473 0 203 204 205 206 207 208 209 210 211 mass [M+1] = 11% [M+2] = 64% [M+3] = 7% [M+4] = 10% [M+5] = 1%
100 ( ) ( ); (, ) 228.0150 230.0150 4.52e12 % C 10 H 13 BrO 10 13 229.0150 231.0150 0 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 mass
Padrão Isotópico 1295 2095 2465 3655 3660 5730 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Regra do Nitrogênio Uma molécula orgânica neutra só terá massa impar se ela tiver número ímpar de nitrogênio C 2 H 4 O: 44 CH 3 CONH 2 : 59 C 6 H 4 (NH 2 ) 2 : 108 C 10H 22O: 158
Tabela de Isótopos Elemento Isótopo Massa (u) Abundância (%) H 1 H 1.00782 100 2 H 2.01410 0.02 C 12 C 12.00000 100 13 C 13.00335 1.07 N 14 N 14.00307 100 15 N 15.00010 0.37 O 16 O 15.99491 100 18 O 17.99916 020 0.20 S 32 S 31.97207 100 Cl Br 34 S 33.96786 4.52 35 Cl 34.96885 100 37 Cl 36.96590 31.96 79 Br 78.91833 100 81 Br 80.91628 97.27
Instrumentação Introdução de amostras Fonte de Ionização Analizador de m/z Detector Vácuo Direto GC HPLC CE EI CI APCI APPI ESI MALDI FAB DESI DART B Q Tof IT LIT ICR Orbitrap Multiplicador e - MCP
J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física em 1906 J. J. Thomson Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z)!!
Ionização por Elétrons (EI)
EI Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70 ev. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um elétron formando íons M +. ou M -.. Íons positivos são predominantes. M -. se tornam importantes para moléculas l com alta EA. M+e - (70 ev) M +. (~ 5-10 ev) + 2e - (~60-65 ev)
Fonte de EI
EI: Características Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller ). Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam totalt ou parcialmente. EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 ev; estável; fácil de operar; alta sensibilidade. Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas. QuandoQ d o íon molecular l não é observado (devido a dissociaçãoi excessiva), existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M +. éumaespécieinstável. EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada 10 3-10 5 moléculas que entram na fonte de EI é ionizada.
Energia das Moléculas
Exemplos Acetofenona m = 120
Exemplos Progesterone m = 314
Exemplos C 7 H 16 m = 100
Energia dos Elétrons
Energia x Fragmentação
Dissociação de Íons Radicalares M+e - M +. +2e - F +. + mol 0 F+ + Rad. F +. +mol 0 F + +Rad. F + + mol 0 F +. + mol 0 F + + Rad. F + + mol 0 F + + mol 0
Regra do Elétron Par Íons positivos radicalares (camada aberta) podem: Perder radical e formar fragmentos positivos (camada fechada) Perder molécula neutra e ficar positivo/radicalar (camada aberta) Íons positivos (camada fechada) podem: Perder moléculas neutras e ficar positivo (camada fechada)
Definições Íon Molecular: íon correspondente à molécula ionizada: M +. Pico base: íon mais intenso no espectro
Fragmentações em EI Localizar Íon Molecular Observar característica do espectro Analisar as fragmentações
Íon Molecular Íon de mais alta massa (descontado 13 C) Se tem alta exatidão, calcular DBI Verificar fragmentações lógicas
Exemplo 152 195
Exemplo 166 180
Exemplos Progesterone m = 314
Exemplos C 7 H 16 m = 100
Mecanismos de Fragmentação 4 clivagens principais: Dissociação sigma Clivagem alfa Clivagem indutiva Fragmentação remota Rearranjos Mclafferty
Fragmentação de Hidrocabonetos Dissociação Sigma seguida de perda de alcenos Íons moleculares pouco intensos Ramificação dirige i a fragmentação Íons característicos: acte cos 15, 29, 43, 57, 71
Exemplos
Exemplos
Exemplos
Alcenos Dissociação Sigma Formação de íon alílico Forma série C 2 H 2n-1 (2 u menor que Alcano)
Exemplos
Álcoois
Exemplos
Aromáticos Formam gerlamente, m/z 77, 78 e/ou 79 m/z 91 / 92 para alquil-aromáticos aromáticos Íons característicos de m/z 39, 51 e 65 Íons moleculares mais intensos que HC
Aromáticos
Aromáticos
Álcoois
Álcoois
Álcoois
154 156
EI Gera M +. e fragmentos Pode não gerar íon molécular
Ionização Química (CI) Munson and Field - 1966 EI: Simples Produz extensa fragmentação Muitas vezes tem M +. Quando não tem M +.
Controle da Exotermicidade da Reação: Extensão de Fragmentação
CH 4 Exemplos Iso-C 4 H 10 NH 3
Exemplos
Exemplos
GC/MS
GC/MS Mass Analyzer
GC/MS
Estrutura dos dados
GC/MS
GC/MS Mass Analyzer
GC/MS
Estrutura dos dados
Modos de aquisição Varredura Análises qualitativas Análises quantitativas (menor sensibilidade) SIM (Selected Ion Monitoring) i Análises quantitativas (maior sensibilidade)
Eletrospray John Fenn 1989 Prêmio Nobel em Química 2002! Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451. Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675. Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64. "Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,
ESI: Princípio Geral
ESI: Princípio Geral Uma solução da amostra em ph ácido ou básico (ou neutra de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray (aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico de +4000V (ou 4000V). O contra-íon é oxidado (ou reduzido) e formam-se gôtas com excesso de carga positiva (ou negativa). O solvente evapora, e o volume das gôtas é reduzido, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons evaporam (são ejetados ) das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).
Mecanismo de Dessorção
Sonda de ESI
ESI e NanoESI
ESI: Moléculas Orgânicas
ESI: Moléculas Orgânicas
Complexos Organometálicos N O O O Ru O O O O Ru N N 100 913.0 912.0 911.0 910.0 914.0 O O Ru O O O % 909.0 908.0 915.0 916.0 N O 907.0 906.0 905.0 917.0 918.0 904.0 0 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 m/z 919.1 100 913.0 % 0 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 m/z
Polímeros C 9 H 19 O(CH 2 CH 2 O) n H
ESI Glu-Fibrinopeptídeo (1568.9) 100 ( ) 785.46 234 100 785.46 204 785.97 % % 786.47 0 786.95 785 786 787 788 m/z 0 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 (1568 9 + 2 ) / 2 = 785 46 (1568.9 + 2 ) / 2 = 785.46 (1569.9 + 2 ) / 2 = 785.96
Íons Multicarregados: Padrão Isotópico +1 = 1/1 = 1.00 +2 = 1/2 = 0.50 +3 = 1/3 = 0.33 +4 = 1/4 = 0.25
Íons Multicarregados B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) 100 1: TOF MS Survey ES+ 302 671.41 B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) 100 567.38 1: TOF MS Survey ES+ 228 567.38 671.90 567.12 567.63 567.63 % 567.85 617.44 626.92 575.82 576.81 587.29 604.17 627.90 653.41 668.70 672.42 672.91 % 567.85 568.11 568.39 0 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680 m/z 0 567 568 m/z B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) 100 668.37 668.70 1: TOF MS Survey ES+ 103 B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) 100 671.41 1: TOF MS Survey ES+ 302 669.04 671.90 % % 669.37 672.42 0 669.68 668.18 672.91 667.36 670.10 670.38 673.40 m/z 0 m/z 668 669 670 671 672 673 674
ESI de Proteínas Mioglobina: (16881 Da) : (16881 + 20) / 20 = 845.1 (16881 + 21) / 21 = 804.9 TOF MS ES+ 804.9 1.48e3 (16881 + 22) / 22 = 768.3 teste Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907) 100 % (M + x) / x = m/z1 (M + x +1) / (x +1) = m/z2 0 804 805 806 m/z 100 704.4 735.0 768.3 804.9 845.1 889.5 1.48e3 % 676.3 938.99 994.1 1056.1 650.3 1126.5 1206.9 0 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 m/z
ESI: Complexos Urease da Helicobacter pylori
1.05 MDa!
ESI de Vírus Intacto
LC-MS ESI: Introdução de amostra em solução Possibilidade de acoplamento c/ HPLC
LC-MS Urina: Metabólitos
Total: ~1500 peptídeos!
MALDI Ionização e Dessorção a LASER Auxiliada por Matriz Koichi Tanaka Michael Karas Franz Hillenkamp
MALDI: Princípio ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and Richard Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 337 366
MALDI: Princípio
Nuvem de plasma (Plume)
MALDI
MALDI: Íons Monocarregados 100 ( ) ( ) ( ) ( ) 12417.97 3.60e3 % 17016.75 12630.54 17224.64 24042.51 0 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 m/z
MALDI: Sensibilidade 42 Zeptomols (25000 Moléculas) de substância P!!! J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12, 1055 1063
Matrizes
Fulerenos
Polímeros PEG 10KDa
Proteínas?
MALDI: Características Forma íons monocarregados Sensível Rápido para amostras individuais Mais Tolerante a contaminantes Problemas com massa baixa
MS: Métodos de Ionização ssa Mas MALDI EI ESI Polaridade