Curso: Marcadores Moleculares aplicados a organismos de interesse epidemiológico SUCEN Superintendência de Controle de Endemias São Paulo 17 a 22 de agosto de 2009
Aula : PCR EM TEMPO REAL José Eduardo Levi Instituto de Medicina Tropical - USP
POR QUE USAMOS PCR PARA DIAGNÓSTICO? SENSIBILIDADE ANALÍTICA PODE DETECTAR ORGANISMOS QUE NÃO PODEM SER ISOLADOS RAPIDEZ VERSATILIDADE DE AMOSTRAS DESVANTAGENS DA PCR CONTAMINAÇÃO REPRODUTIBILIDADE EM ALGUNS CASOS POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA
POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA? PCR SEMI-QUANTITATIVO - DILUIÇÃO SERIADA
POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA?
O crescimento linear do número de cópias ocorre até um determinado número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ 10 12 moléculas por 100 l. As causas do platô são várias: - Perda da atividade da enzima - Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA - Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os primers. Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos. - Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase - Acúmulo de pirofosfato (PiPi) - Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas também foram se acumulando etc
COMO SE PROCUROU VENCER ESTA LIMITAÇÃO? DILUIÇÃO SERIADA ( END-POINT DILUTION) PADRÃO EXTERNO CONTROLE INTERNO CONTROLE INTERNO COMPETITIVO
OS AVANÇOS : NA QUÍMICA DE FLUORESCÊNCIA NAS TÉCNICAS T DE MARCAÇÃO DE OLIGOS NOS LEITORES DE FLUORESCÊNCIA NA TECNOLOGIA DE TERMOCICLADORES REAL-TIME PCR
1. INTERCALANTES 1. INTERCALANTES EX. BROMETO DE ETÍDIO, SYBR GREEN, ETC. VANTAGES: SIMPLES E BARATOS DESVANTAGENS: REQUER PADRONIZAÇÃO POIS PRIMER-DIMERS TAMBÉM FLUORESCEM
CURVA DE MELTING TEMPERATURE C/ SYBR GREEN
MÉTODOS DE DETECÇÃO 2. SONDAS DE HIDRÓLISE (TAQMAN)
O sistema TaqMan também é utilizado para fazer discriminação e quantificação alélica
MÉTODOS DE DETECÇÃO 3. SONDAS FRET FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) using adjacent hybridization probes FITC Red 640 Excitation FRET Emission P Phosphate P Amplicon
MÉTODOS DE DETECÇÃO 4. MOLECULAR BEACONS A Excitation FRET B C Reporter Non-fluorescent Quencher ANNEALING Amplicon
Aplicações Detecção de agentes infecciosos Caracterização do agente (tipagem) Determinação da carga viral (quantificação)
Threshold Cycle 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 CURVA DE CALIBRAÇÃO (STANDARD) Threshold Cycle = 35 Load = 10 3.8 copies/ml Concentration log 10 2.5 Test Sample F2/F1 1.5 Threshold Threshold Cycle 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 Cycles
Determinação da Carga 2.5 Threshold Cycle NEG 10 F2/F1 1.5 100 1000 10000 100000 1000000 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 Cycles
RELAÇÃO ENTRE CARGA VIRAL E DOENÇA HIV Mellors JW Quantitation of HIV-RNA in plasma predicts outcome after seroconversion. Ann Intern Med,, 122:573-579, 579, 1995. VIRAL COUNTS COUNT ON HIV INFECTION DAVID HO, SCIENCE DEMONSTRAÇÃO EMPÍRICA QUE A CARGA VIRAL DE HIV TEM CORRELAÇÃO COM O PROGNÓSTICO DO PACIENTE
CARGA VIRAL E HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA HIV 8 10 6 10 PROGRESSORES RÁPIDOS= R 20% 10 8 10 2 NÃO-PROGRESSORES = 5% 6 10 PROGRESSORES TARDIOS E INTERM. = 75% 10 2
Incidência cumulativa de cirrose após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal 40 35 30 25 20 HBV R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006 23,5% 36,2% 15 10 5 4,5% 5,9% 9,8% 0 <300 300-10.000 10.000-100.000 100.000-1.000.000 >1.000.000 HBV-DNA basal (cópias/ml)
Incidência cumulativa de HCC após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal 20 15 10 HBV R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006 12,2% 14,9% 5 1,3% 1,4% 3,4% 0 <300 300-10.000 10.000-100.000 100.000-1.000.000 HBV-DNA basal (cópias/ml) >1.000.000
Dengue Quais as diferenças que levam a apresentações clínicas tão distintas como a Febre da Dengue (DF) e a Febre Hemorrágica da Dengue (DHF) e a Síndrome do Choque da Dengue (DSS)? As hipóteses abordam características do hospedeiro (HLA, Nutrição estado imune) e fatores virais (sorotipo/genótipo, CARGA VIRAL)
Dengue
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Carga viral em Dengue
Carga viral em Dengue
Carga viral em Dengue
Carga viral em Dengue
Carga viral em Dengue
Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue DEN-1 DEN-2 DEN-3
HGV X HIV
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ADRIANA FUMIE TATENO ADRIANA FREIRE MACHADO CÉLIA RODRIGUES SYNARA DE ARAÚJO JOSÉ EDUARDO LEVI ( DUDI) E-MAIL : dudilevi@usp.br DR. CLÁUDIO SÉRGIO PANNUTI