Amostragem e Análises laboratoriais de Legionella em sistemas de água-métodos disponíveis, vantagens e inconvenientes Workshop: Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água IPQ, Lisboa, 3 de abril de 2019 Filipa Costa Ferreira Filipa.costa@insa.min-saude.pt
AGENDA Amostragem Análise Laboratorial Método cultural PCR em Tempo Real Legiolert Legipid Algumas Considerações 2
Amostragem Escolha dos pontos com maior probabilidade de contaminação: Rede predial de água quente e fria (troços de rede pouco utilizados, juntas cegas, extremidade da rede e retorno da água quente, chuveiros, etc.) Depósitos de água Spas, jacuzzis e piscinas Humidificadores Sistemas de rega por aspersão 3
Amostragem Escolha dos pontos com maior probabilidade de contaminação (cont.): Torres de arrefecimento e condensadores evaporativos Fontes ornamentais Sistemas de água contra incêndio Equipamentos dos Estabelecimentos Termais Equipamentos de terapia respiratória Lavagem automática de carros 4
Colher logo após a abertura da torneira, sem desinfetar Colher 1 Litro (sempre que possível) para frasco esterilizado e com tiossulfato de sódio Evitar a produção de aerossóis Usar equipamento de proteção adequado (bata, luvas e máscara de proteção) Efetuar a medição da temperatura, do desinfetante residual e do ph Amostragem Transporte da amostra a 5 C ± 3 C ou à temperatura ambiente, protegida do calor e da luz solar direta FFP3 5
Amostragem Sempre que se efetue(m) no(s) laboratório(s) mais do que uma metodologia ex: PCR em tempo real, Método cultural, Legiolert, Legipid, Partir sempre de uma amostra composta. Colher o volume necessário para o mesmo frasco e homogeneizar. Dividir em alíquotas para processamento. 6
Amostragem Ensaio T (h) T ( C) Legionella spp. < 24 5 ± 3 ou temperatura ambiente >24 e <48 5 ± 3 Referência: ISO 19458:2006 7
Amostragem Amostras de água que sofreram tratamento por biocida só devem ser submetidas a este tipo de análise 72 horas após a realização do mesmo. 8
Amostragem Amostras de água que sofreram tratamento ATÉ por biocida ESTABILIZAÇÃO só devem ser submetidas DOS VALORES a este tipo de análise PARA 72 OS horas após NÍVEIS a realização DE do mesmo. REFERÊNCIA 9
Método Cultural Norma ISO 11731:2017 Water Quality - Enumeration of Legionella Sementeira direta da amostra Filtração com colocação da membrana diretamente no MC Filtração seguida de eluição Centrifugação 10
Método Cultural Sementeira direta em amostras suspeitas elevada concentração de Legionella (>10 4 ) e uma baixa concentração de microrganismos interferentes, e em Inquéritos Epidemiológicos Semear 0,1 ml a 0,5 ml da amostra (BCYE+BCYE+AB) 11
Método Cultural Filtração com colocação da membrana (0,45 µm diretamente no meio de cultura) Sem tratamento Tratamento da amostra BCYE Ácido BCYE+AB/GVPC/MWY Incubação 10 dias, a 36ºC ± 2 C Leitura Confirmação das colónias suspeitas BCYE Com Cisteína BCYE Sem Cisteína Enumeração de Legionella spp. 12
Filtração seguida de eluição Método Cultural Filtrar amostra Membrana 0,2 µm Eluição da membrana com 5 ml soluto Ringer ou a própria amostra Agitar no vortex Tratamento térmico e ácido Sementeira da amostra Incubação a 36 C ± 2 C em atmosfera húmida 13
Método Cultural Centrifugação Centrifugação da amostra Sementeira da amostra Incubação a 36 C ± 2 C em atmosfera húmida 14
Filtração seguida de eluição Centrifugação Método Cultural Sementeira da amostra Sem tratamento Tratamento da amostra Calor Ácido BCYE/ BCYE+AB/GVPC/MWY Incubação 10 dias, a 36ºC ± 2 C Leitura Confirmação das colónias suspeitas BCYE Com Cisteína BCYE Sem Cisteína Enumeração de Legionella spp. 15
Colónias características : Leitura das placas Colónias que crescem em meio específico (BCYE/ BCYE+AB/GVPC/MWY), nunca antes das 48 horas de incubação, podendo apresentar uma coloração branca, rosada a azulada ou esverdeada, com aspeto vidro moído. Sem tratamento Calor Ácido 16
Leitura das placas Leitura das placas após incubação, com o auxílio de uma lupa binocular com luz incidente num ângulo de 45º; 17
Método Cultural Identificação das colónias suspeitas de Legionella pneumophila Seroaglutinação com Kit comercial: o kit utilizado no laboratório inclui partículas de látex, sensibilizadas com anticorpos que aglutinam na presença de antigénios específicos da membrana celular da Legionella, formando agregados visíveis a olho nu; Permite distinguir entre: L. pneumophila (serogrupos 1, 2-15) e Legionella spp. não L. pneumophila. 18
Expressão dos resultados Não detetada (LD acordo com o método utilizado e/ou volume filtrado) Detetada Nº UFC/L (UFC Unidades Formadoras de Colónias) Legionella spp. Legionella pneumophila serogrupo 1 Legionella pneumophila serogrupo 2-15 19
Amostra proveniente de uma Torre de Arrefecimento Placa de GVPC - concentrado sem tratamento Placa de GVPC - concentrado com tratamento por calor Placa de GVPC - concentrado com tratamento por ácido 20
Amostra proveniente de uma Torre de Arrefecimento Placa de GVPC - direto sem tratamento Placa de GVPC - direto com tratamento por calor Placa de GVPC - direto com tratamento por ácido 21
Método Cultural Permite isolar as diferentes espécies e estirpes de Legionella; Possibilidade de descobrir o agente etiológico nos IE; Possibilidade de comparação de estirpes clínicas com estirpes ambientais; Apenas são recuperadas as bactérias viáveis e cultiváveis. Método complexo e exigente em tempo, meios de cultura, reagentes e experiência técnica. 22
PCR em Tempo Real Norma ISO/TS 12869:2012 Water Quality - Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr) 23
PCR em Tempo Real Concentração da amostra através de filtração; Extração de DNA (kit comercial específico para matriz ambiental); Qualitativo: Detetada/Não Detetada; Quantitativo: Unidades de Genoma/L; 24
PCR em Tempo Real Apresentação de Resultados: 25
PCR em Tempo Real Vantagens: Capacidade de resposta em poucas horas; Extremamente sensível; Deteta as bactérias viáveis não cultiváveis. 26
Desvantagens: Elevado custo; PCR em Tempo Real Necessidade de pessoal técnico qualificado para a correta interpretação dos resultados obtidos; Em amostras colhidas após desinfeção pode haver dificuldade na amplificação do DNA; Não existência de correlação entre UG (Unidades Genómicas) e UFC (Unidades formadoras de colónias) Grande entrave em Termos Legislativos. 27
Legiolert O teste é baseado na deteção de uma enzima da Legionella pneumophila que ao metabolizar o substrato presente no reagente do Legiolert produz um composto acastanhado. 28
Legiolert 29
Legiolert Fácil execução; Resultados em 7 dias; Só deteta Legionella pneumophila; Expressão de resultados em NMP / 100 ml. 30
Legipid Filtração Análise Resultado (Pre-filtro em caso de águas sujas) Filtração por membrana Frasco de eluição Captura (antigénio anticorpo) Marcação anticorpo secundário Deteção Resultado Visual Resultado por Colorímetro / Espectofotometro UFCeq 31
Legipid Resultados no mesmo dia; Deteta Legionella spp., mas não permite identificar a L. pneumophila; Expressão de resultados em UFCeq/L. 32
Algumas Considerações Lei 52/2018 de 20 de agosto A colheita de amostras deve ser realizada por laboratórios que tenham a amostragem acreditada, por técnicos de saúde ambiental, engenheiros sanitaristas ou técnicos certificados para o efeito por entidade acreditada pelo IPAC. Análise deve ser realizada por laboratórios com o método acreditado pelo IPAC. A escolha do método a utilizar deve ter em conta o contexto da análise. 33
Investigação aplicada 34
Variabilidade genética entre estirpes (nº de difrenças em cada 10000 pb do core-genome) Confirmação da identificação de prováveis fontes ambientais de transmissão No surto de VFX, a WGS de LPNsg1ST1905 mostrou >99,8% homologia entre isolados clínicos e obtidos de uma fonte ambiental suspeita, confirmando o link estabelecido por SBT 100 100 100 100 100 100 Lp_isolado_ambiental_1 Lp_isolado_clínico_1 Lp_isolado_clínico_2 Lp_isolado_clínico_3 Lp_isolado_clínico_4 Lp_isolado_clínico_5 Lp_isolado_clínico_6 Lp_isolado_clínico_7 Lp_isolado_clínico_8 Lp_isolado_clínico_9 Lp_isolado_clínico_10 Lp_subsp_fraseri_ATCC33216 Lp_subsp_fraseri_ATCC33156 100 Lp_subsp_fraseri_ATCC35251 100 100 100 100 100 100 Lp_subsp_pascullei_ATCC33737 Lp_Lens Lp_ThunderBay Lp_ATCC43290 Lp_LPE509 Lp_Phyladelphia1 Lp_Corby Lp_2300/99_Alcoy Lp_Lorraine Lp_Paris Lp_HL06041035 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Core-genome (janelas de 10000 pb) 11 estirpes do surto e 14 estirpes de Legionella pneumophila já sequenciadas 11 estirpes do surto (10 isolados clínicos e 1 isolado ambiental) 0,01 Identificação da rara L. pneumophila subsp. fraseri (e não a mais comum subsp. pneumophila) Filogeneticamente divergente de outras 35 estirpes associadas a surtos de DL
Estudos de marcadores de virulência e patogenicidade No surto de VFX, LPNsg1ST1905 mostrou 8 regiões genómicas importadas, contendo genes envolvidos, por exemplo, na resistência a antimicrobianos ou virulência 36
Estudos de marcadores de virulência e patogenicidade No surto de VFX, LPNsg1ST1905 mostrou 2 regiões genómicas importadas, envolvendo cassetes de genes associados a virulência ou ilhas de patogenicidade Região de ~37.5 kb encontrada intacta e de forma semelhante apenas numa estirpe de L. oakridgensis (raramente provoca DL) Presença de ilha de patogenicidade ~65 kb apenas presente na L. pneumophila Philadelphia-1 37
Equipa técnica do Laboratório de Microbiologia do Lisboa da UAS do DSA Ana Paula Loio Cátia Gomes Cecília Silva Filipa Costa Ferreira Maria Leal Joana Albuquerque Konstantina Sarioglou Raquel Rodrigues Sandra Gonçalves Sandra Rebelo 38
Muito obrigada! 39