2. NOME DO TESTE E SINONÍMIAS

1/9 1. INTRODUÇÃO / FINALIDADE DO MÉTODO O ácido trans, trans mucônico é utilizado como indicador biológico para a exposição ao benzeno. Indicador biológico de exposição pode ser a substância inalterada ou um metabólito (substância química, elemento químico, atividade enzimática ou constituinte do organismo) cuja concentração ou atividade em fluido biológico (sangue, urina), ar exalado ou em tecidos, possui relação com a exposição ambiental a determinado agente tóxico. A substância ou elemento químico determinado pode ser produto de uma biotransformação ou alteração bioquímica precoce decorrente da introdução deste agente tóxico no organismo. Para os agentes químicos preconizados na NR7, é definido o índice biológico máximo permitido (IBMP) como o valor máximo do indicador biológico para o qual se supõe que a maioria das pessoas ocupacionalmente expostas não corre risco de dano à saúde. Ultrapassar deste valor significa exposição excessiva. 2. NOME DO TESTE E SINONÍMIAS Determinação do ácido trans,trans mucônico urinário; determinação de TTMA em urina; determinação do ácido hexadienodioico em urina. 3. ABRANGÊNCIA Setor de Toxicologia. 4. PRINCÍPIO DO MÉTODO A dosagem do ácido trans, trans-mucônico é realizada pelo método da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), também conhecido por high performace liquid cromatography (HPLC), em amostra urinária. Este é um método usado frequentemente em toxicologia e química analítica para separar, identificar e quantificar diferentes compostos. Para tanto, utiliza-se colunas preenchidas com material específico, que funcionarão como fase estacionária e uma bomba que fará correr uma mistura de solventes (fase móvel) através desta coluna. Desta forma, a depender da polaridade das substâncias em análise e, de suas interações com as fases móveis e estacionárias, as mesmas se deslocarão mais rapidamente ou mais lentamente, tendo cada uma seu próprio tempo de retenção (RT), sendo detectadas por um detector UV-VIS (ultravioleta visível) num comprimento de onda específico. A absorbância do analito gerará um sinal elétrico que será registrado por um sistema de integração. Estes sinais serão transcritos em forma de picos cromatográficos, cuja área e altura serão diretamente proporcionais à sua absorbância e à sua concentração. O UHPLC (ultracromatógrafo a líquido) é um equipamento muito semelhante ao HPLC. Este equipamento possui bomba e colunas que suportam pressões bem maiores do que o HPLC e tubulações com diâmetros internos bem menores. Pelo fato deste equipamento trabalhar a altas pressões, há uma diminuição do tempo de retenção do analito. A extração do ácido trans, trans - mucônico ocorre em fase sólida com a utilização da resina dowex 1X4 400 (ou similar). Sendo assim, na primera etapa de eluição da amostra tamponada, o objetivo e fazer com que o ácido em análise, presente na urina, fique retida na resina. As duas etapas seguintes têm como objetivo a limpeza do extrato, eluindo outras substâncias que poderiam ser carreadas pelo eluente e tornar, assim, o

2/9 extrato mais poluído, com possíveis interferentes. As soluções empregadas para a limpeza não podem eluir o ácido trans, trans mucônico. Por fim, o eluente arrastará o TTMA da resina, formando o extrato a ser injetado nos cromatógrafos. 5. APLICAÇÃO CLÍNICA O monitoramento biológico da exposição ao benzeno pode ser realizado através de diferentes indicadores, que vão desde aqueles com meia vida biológica curta como o benzeno no ar exalado ou seus metabólitos urinários, até os adutores formados a partir de proteínas do sangue e/ou de moléculas de DNA que podem persistir por meses no organismo humano. O desenvolvimento de metodologias analíticas vem oferecendo a possibilidade de avaliar uma série de indicadores biológicos de exposição. Dentre os mais estudados, pode-se destacar os ácidos trans,transmucônico e fenil - mercaptúrico urinários, e o benzeno inalterado no ar exalado, na urina e no sangue. 6. AMOSTRA a) Tipo de amostra Urina: urina de início de jornada de trabalho, de final de jornada de trabalho ou amostra aleatória. b) Quantidade mínima 5 ml de urina. c) Restrições e critérios para rejeição de amostras Amostras com volume inferior a 5,00 ml ou com creatinina urinária inferior a 0,3 g/l. d) Condições de acondicionamento das amostras e seu período de guarda As amostras devem ser coletadas em frascos coletores ou em tubos coletores e acondicionadas de 2 o C a 8 o C por 7 dias ou a congeladas por 20 dias. e) Procedimentos de tratamento ou pré-tratamento da amostra A amostra deve ser alcalinizada com tampão TRIS antes da extração em fase sólida. f) Preparo do paciente Vide o PO Orientação de Preparo e Coleta de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-005). g) Transporte da amostra

3/9 Vide o PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (cód. PO-LB-CO-006). 7. BIOSSEGURANÇA Utilizar o EPI (Equipamento de Proteção Individual) comum a toda área técnica sendo eles: jaleco, luva, pro-pé e touca, conforme descrito no PO Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001) em vigor. 8. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS a) Equipamentos ADVIA 1800 Siemens Balança analítica Bomba para sucção a vácuo Ultrassom HPLC Serie 200 PerkinElmer e/ou UHPLC Flexar PerkinElmer 1 OBS: Se o HPLC ou UPLC possuir um degaseificador, não haverá a necessidade de um ultrassom. b) Materiais Coluna Lichrospher 100 RP- 8 de 5 micra 125 X 4 mm (ou similar) para o HPLC e para o UHPLC; Pré-coluna para as colunas citadas acima; Pipeta com volume variável de 10 a 100 ul e de 100 a 1000 ul; Ponteiras para as pipetas citadas acima; Proveta de 50 ou 100 ml; Béquer 500 ml; Pêra; Kit para extração em fase sólida; Tubo de plástico cônico de 15 ml; Manifold (aparelho adaptado para acelerar eluições à vácuo); Kit vítreo para filtração com Kitasato de 1000 ml; Membrana para filtração de solventes orgânicos e aquosos; Balão volumétrico de 10, 50, 100, 500 e 1000 ml; Vials de 2,00 ml com suas respectivas tampas (se for injeção automática); Seringa para HPLC de 100 ul (se for injeção manual). c) Reagentes: Ácido acético glacial; Resina de troca iônica Dowex 1X4 200 ou Dowex 1X4 400 (ou similar); Metanol grau HPLC; tris (hidroximetil) -aminometano; Cloreto de sódio P.A.;

4/9 Ácido clorídrico; Ácido fosfórico; Hidróxido de sódio; Padrão do ácido trans,trans -mucônico P.A. 9. CALIBRAÇÃO A calibração destes ensaios deve ocorrer sempre que o analista julgar necessário. Para tanto, padrões aquosos ou urinários (urinas batizadas) deverão ser utilizados para a confecção da curva de calibração. Os controles aquosos ou urinários (urina batizada) serão analisados no início da corrida analítica para validação da calibração. 10. CONTROLE DE QUALIDADE a) Interno Deve-se realizar o controle interno conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. b) Externo O controle externo será realizado conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 11. PROCEDIMENTO TÉCNICO 11.1 Preparação da amostra: a. Anotar o número da O.S. do paciente em dois tubos plásticos cônicos de 12 ml. b. Em um dos tubos, aliquotar 2 ml de urina e 1 ml de tampão TRIS; c. Transferir 2,8 ml desta mistura para as colunas do kit de filtração em fase sólida, já preenchidas com a resina Dowex. d. Estas colunas do kit devem estar acopladas à parte superior do Manifold que, por sua vez, deverá conter em seu interior o segundo tubo com a O.S. do paciente. e. Ativar a resina Dowex com 4 ml de água destilada. Descartar o eluído. f. Eluir 2,8 ml da mistura obtida no primeiro tubo na resina contida no kit. Descartar o eluído. g. Em seguida, eluir 2 ml de ácido fosfórico 0,2 M; 2mL de tampão acetato 0,2M ph~7,0 e 2 ml de solução aquosa de metanol 50%. Após cada uma destas eluições, deve-se descartar o eluído. h. Por último, eluir 2 ml da solução eluente (solução aquosa 1:1 NaCl 1,5 M / metanol). Não descartar o eluído. i. A este eluído, adicionar 100 ul de ácido acético glacial. Caso não for injetar no mesmo dia, conservar o extrato de 2 a 8 o C por 72h. j. Transferir o conteúdo para uma vial do autosampler do cromatógrafo. 2 OBS: Com exceção do eluído da última etapa, todos os demais devem ser desprezados.

5/9 11.2 Preparação de soluções: Ácido acético 4 %: Aliquotar 20 ml de ácido acético glacial e avolumar para 500 ml com água ultrapura. Solução estável por 5 dias à temperatura ambiente. Solução TRIS 0,5 molar: Dissolver 30,25 g do composto Tris(hidroximetil)-aminometano em 200 ml de água ultrapura, avolumar para 500 ml com mesmo solvente. Solução estável por 30 dias à temperatura ambiente. Solução - tampão TRIS 0,125 molar ph ~ 10: Misturar 50 ml da solução TRIS 5 molar com 5 ml de HCl 0,2 molar. Ajustar o ph para aproximadamente 10, se necessário, com solução de NaOH 0,5 molar; em seguida, avolumar para 200 ml com água ultrapura. Solução estável por 30 dias à temperatura ambiente. Solução de ácido clorídrico 0,2 molar: Aliquotar 1,70 ml de HCl concentrado em balão volumétrico de 100 ml, avolumar com água ultrapura e conservar à temperatura ambiente por 30 dias. Solução NaOH 5 molar: Pesar 20 gramas de NaOH e dissolver em 50 ml de água ultrapura. Avolumar para 100 ml com mesmo solvente e conservar à temperatura ambiente por 30 dias. Solução tampão acetato ph ~ 7: Diluir 2,31 ml de ácido acético glacial e avolumar para 200 ml com água ultrapura. Em seguida, dissolver 3,28 g de acetato de sódio anidro ou 5,44 g de acetato de sódio triidratado em água ultrapura, avolumando para 200 ml com mesmo solvente. Ambas as soluções serão 0,2 molar em íon acetato. Misturar 4,8 ml da solução do ácido acético com 45,2 ml da solução de acetato de sódio e ajustar o ph para aproximadamente 7 com solução de NaOH 5 molar, avolumar para 100 ml com água ultrapura. Todas as soluções envolvida além da solução-tampão são estáveis por 30 dias à temperatura ambiente. Solução de metanol 50%: Misturar igual volume de metanol HPLC e água ultrapura e conservar à temperatura ambiente por 30 dias. Solução eluente 1:1 (NaCl (aq) 1,5 molar / metanol HPLC): Pesar 13,68 g de NaCl e dissolver em água ultrapura. Em seguida, avolumar para 250 ml com mesmo solvente. Adicionar a essa solução igual volume de metanol HPLC. Solução estável por 30 dias à temperatura ambiente. Solução de ácido fosfórico 0,2 mmolar: Aliquotar 3,37 ml de ácido fosfórico concentrado e diluir com 100 ml de água ultrapura. Avolumar para 250 ml com mesmo solvente e conservar à temperatura ambiente 30 dias. 3 OBS: Na impossibilidade de se usar um phmetro, pode-se aferir os phs das soluções-tampão com fita de urina, uma vez que seus valores são aproximados. 11.3 Preparação de soluções-padrão: Solução estoque do ácido trans, trans - mucônico 1000 mg/l: Pesar 0,1 g de ácido t,t mucônico e transferilo para um béquer de 100 ml. Adicionar a este 3 escamas de hidróxido de sódio. Em seguida, dispensar 30 ml

6/9 metanol grau HPLC e 50 ml de água ultrapura. Avolumar para 100 ml este último solvente. Solução estável por 60 dias de 2 o C a 8 o C e por 6 meses a congeladas; Solução intermediária do ácido trans, trans mucônico 100 mg/l: Aliquotar 1,0 ml da solução-estoque, avolumar para 10 ml com água ultrapura. Soluções estáveis por 60 dias de 2 o C a 8 o C e por 6 meses congeladas; Solução-trabalho do ácido trans, trans - mucônico 10,0 mg/l: Aliquotar 1,0 ml da solução intermediária e transferir para um balão volumétrico de 10 ml, avolumar com água ultrapura ou urina previamente testada. Soluções estáveis por 30 dias de 2 o C a 8 o C e por 3 meses congeladas. Soluções - padrão e controle do ácido trans, trans - mucônico 1,0; 2,0 e 4,0 mg/l: Após extração da solução trabalho, obter-se-á 2 ml do extrato 10 mg/l. Realizar diluições desse de modo a obter 2 ml das solução finais desejadas. Para tanto, aliquotar 200, 400 e 800 ul da solução trabalho e, em seguida, dispensar quantidade suficiente para 2,00 ml com a solução eluente. Soluções - controle do ácido trans, trans - mucônico 0,5 e 1,5 mg/l: Após extração da solução trabalho, obter-se-á 2 ml do extrato 10 mg/l. Realizar diluições desse de modo a obter 2 ml das solução finais desejadas. Para tanto, aliquotar 100, 300 ul da solução trabalho e, em seguida, dispensar quantidade suficiente para 2,00 ml com a solução eluente. 4 OBS: Será a solução trabalho que passará pelo processo de extração. As alíquotas 11.4 Condições cromatográficas: Fluxo: 1,3 ml/min; λ = 269 nm; A análise do ácido trans, trans mucônico em urina é realizada com gradiente de fase móvel. Ao canal A da bomba, acopla-se o metanol grau HPLC e ao canal B, a solução de ácido acético 4%. A análise ocorrerá de acordo com o seguinte gradiente: Passo Tempo (s) Fluxo (ml/min) A % B % 0 Equil. 1,5 1,5 10 90 1 Run 0,5 1,5 10 90 2 Run 4,0 1,5 80 20 3 Run 0,5 1,5 100 0 a) Limites de Detecção/ Sensibilidade: 0,13 mg/l. b) Linearidade é de 4,00 mg/l. c) Intervalo reportável (CRR): 4,00 mg/l. Diluir a amostra até obter resultado dentro da linearidade. d) Valor crítico: acima de 1,6 mg/g creatinina e) Especificidade: Não se aplica

7/9 f) Carryover : O teste do carryover para a análise do ácido trans, trans-mucônico urinário foi satisfatório, não havendo carreamento significativo para este analito. 12. CÁLCULOS Os resultados deverão ser expressos em mg/g de creatinina urinária. Portanto deve-se dividir o resultado do paciente, obtido do cromatógrafo (expresso em mg/l), pela sua respectiva creatinina urinária (expressa em g/l); Ex: Resultado do ácido trans, trans-mucônico no cromatógrafo = 0,5 mg/l; Resultado da creatinina urinária = 2,0 g/l; Resultado do ácido trans, trans-mucônico corrigido: 0,25 mg/g creatinina. O valor dos resultados do ácido trans, trans-mucônico que estiver abaixo do seu limite de detecção deve ser digitado da seguinte forma: < valor do limite de detecção do analito. Para os resultados de creatinina urinária abaixo de 0,3 g/l, deve-se repetir o ensaio; caso persistam os resultados, deve-se solicitar nova amostra. 13. REGISTROS DOS RESULTADOS Conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 14. PROCEDIMENTOS EM CASO DE RESULTADOS ANORMAIS Conforme descrito no Plano da Qualidade do Setor. 15. VALORES DE REFERÊNCIA Referência: até 0,5 mg/g creatinina; IBMP (Índice Biológico Máximo Permitido): Não definido pela NR-7 Correlação entre concentrações de ácido trans, trans mucônico e níveis de benzeno no ar (portaria 34, 2001): 1,3 mg/g creatinina para exposição ocupacional a 0,6 ppm de benzeno no ar ; 1,6 mg/g creatinina para exposição ocupacional a 1,0 ppm de benzeno no ar ; 2,5 mg/g creatinina para exposição ocupacional a 2,0 ppm de benzeno no ar ; 4,2 mg/g creatinina para exposição ocupacional a 4,0 ppm de benzeno no ar ; 5,8 mg/g creatinina para exposição ocupacional a 6,0 ppm de benzeno no ar. Fonte do valor de referência: NR-7, 1994, MT / BR Portaria nº 34, 20/12/2001 MT

8/9 16. INTERFERÊNCIAS O ácido trans, trans mucônico urinário é um indicador sensível, mas de especificidade média. A sua concentração é influenciada pelo hábito de fumar e quando ocorre exposição simultânea ao tolueno ou pela ingestão de ácido sórbico e seus sais presentes na alimentação. Nesta situação, sugere-se a coleta de urina muitas horas após a última refeição o que permitiria ignorar um possível efeito aditivo decorrente da ingestão do ácido sórbico. Há suspeitas que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) também interfiram nesta avaliação. 17. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA a) Bibliografia ANDREWS, Larry S.; SNYDER, Robert. Toxic Effects of Solvents and Vapors. In: ANDUR, Mary O. et al (org.) Casarett and Doull s Toxicology: The Basic Science of Poisons. 4. Ed. São Paulo, SP: Pergamon 1991. p. 681-713 BRASIL. Norma Regulamentadora. Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional. Disponível em: http://www.mte.gov.br/legislacao/normas_regulamentadoras/nr at.pdf.in: www.mte.gov.br/legislacao/normas_regulamentadoras/default.asp. Acesso em 23 set. 2010. BRASIL, Portaria nº 34, 20 de dezembro de 2001 da Secretaria de Inspeção do Trabalho. MARTINS, I., de Siqueira M. E. P. B. Determinação do ácido trans, trans-mucônico em urina: validação em um método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência. b) Documentos Complementares Manual do equipamento automatizado Plano da qualidade do setor de Toxicologia (Cód. PQ-LB-TX-001) PO Orientações de Preparo e Coleta de Amostras Biológicas (Cód. PO-LB-CO-005). PO Manuseio de Transporte de Amostras Biológicas (Cód. PO-LB-CO-006). PO de Orientações de Biossegurança (Cód. PO-LB-CQ-001) 18. HISTÓRICO DAS REVISÕES Pg. Natureza da Revisão Data da Revisão Versão Responsáveis 4 Controle de Qualidade 25//2011 01 Luiz Artur 4 Controle de Qualidade 28/02/2012 02 Luiz Artur 2 Preparação da Amostra 19/02/2013 03 Luiz Artur 3 Preparação das Soluções 19/02/2013 03 Luiz Artur 4 Cálculo e Liberação dos Resultados 19/02/2013 03 Luiz Artur

9/9 2 Materiais Requeridos 11/08/2013 04 Luiz Artur 2 Preparo das Amostras 11/08/2013 04 Luiz Artur 3 Preparo das Soluções 11/08/2013 04 Luiz Artur 3 Condições Cromatográficas 11/08/2013 04 Luiz Artur 4 Controle de Qualidade 11/08/2013 04 Luiz Artur 1-7 Pop recodificado, codificação anterior PT-LB-TX-4 11/08/2013 04 Ana Regina e 1-10 1-9 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Procedimento adequado para atender ao item 5.3 da Norma PALC, versão 2013 Após Pré auditoria. 01/08/2014 05 Luiz Artur 28/01/2015 06 6 Preparação de solução-padrão 19. REGISTRO DE TREINAMENTO DATA NOME COMPLETO ASSINATURA

10/9