Licenciatura em Ciências da Saúde Gené4ca Humana 3º Ano 1º Semestre 2013-2014
ORGANIZAÇÃO E SEGURANÇA Grupos de dois alunos Bata, luvas, caderno de laboratório Caneta, lápis, marcador de acetato
PLANO DAS AULAS LABORATORIAIS Dois blocos: Sensibilidade gusta<va à fenil<ocarbamida - determinação do fenó<po e do genó<po Citogené<ca/Bioinformá<ca (HSM)
AVALIAÇÃO LABORATORIAL Caderno de laboratório 60% Relatório 30% Assiduidade 10%
CADERNO DE LABORATÓRIO O caderno tem que estar iden<ficado e deve englobar: Uma breve introdução teórica do trabalho Os protocolos Os cálculos Os resultados A discussão dos resultados Conclusões Escrito a <nta com esquemas a lápis, índice, páginas numeradas.
Trabalho Laboratorial CARACTERIZAÇÃO DA SENSIBILIDADE AO PTC (fenil4ocarbamida) DETERMINAÇÃO DO FENÓTIPO E DO GENÓTIPO 1. Registo da sensibilidade ao PTC 2. Extração de DNA genómico a par<r de epitélio bucal e sua caracterização 3. Deteção do polimorfismo TAS2R38 por PCR- RFLP a. Amplificação por PCR da região genómica de interesse b. Hidrólise do produto de PCR com enzima de restrição c. Avaliação dos resultados por eletroforese em gel de agarose 4. Rastreio de polimorfismos por SSCP 5. Interpretação e integração dos resultados
PLANO DAS AULAS LABORATORIAIS 14.OUT Extração de DNA genómico de epitélio bucal, sua quan4ficação e controlo de qualidade 21.OUT NÃO HÁ AULA 28.OUT Amplificação por PCR de região polimórfica do gene TAS2R38 4.NOV Controlo da reação de PCR, hidrólise enzimá4ca com HaeIII para deteção de polimorfismo e eletroforese para visualização dos produtos de RFLP 11.NOV Purificação dos produtos de PCR para sequenciação Registo da sensibilidade gusta4va ao PTC 18.NOV Rastreio de polimorfismos no gene TAS2R38 por SSCP 25.NOV Avaliação global de resultados 2-9- 16.DEZ Citogené4ca / Bioinformá4ca - Hospital Santa Maria
O paladar é um dos 5 sen<dos dos animais, e que nos permite: avaliar o conteúdo nutricional dos alimentos prevenir a ingestão de substâncias tóxicas Os mamíferos conseguem dis<nguir apenas 5 sabores básicos: Amargo (detetam compostos potencialmente nocivos ou venenosos) Ácido Salgado (assegura balanço eletrolí<co adequado) Doce (nutrientes ricos em energia) Umami (L- glutamato e 5 - ribonucleó<dos)
O reconhecimento do sabor é mediado por células epiteliais especializadas localizadas na língua Amargo Salgado Doce Umami Ácido NATURE Vol 444 16 November 2006 doi:10.1038/nature05401
O PTC, ou fenil<ocarbamida ou fenil<oureia, é um composto com gosto amargo O gosto amargo é mediado por uma família de 30 GPCR (recetores acoplados a proteína G) os T2Rs O gene que codifica para o recetor de gosto do PTC, TAS2R38, apresenta um modo de transmissão Mendeliano
A sequenciação do gene revelou a existência de 3 aminoácidos que variam na população humana, causados por SNPs (single nucleo<de polymorphisms) A combinação específica destes 3 SNPs denomina- se Haplo4po e correlaciona- se fortemente com a capacidade de sen<r o gosto amargo Exemplo ilustra<vo do conceito moderno de Farmacogené4ca, em que a geno<pagem de SNPs é usada para prever a resposta a um fármaco
SNPs no gene TAS2R38 Nucleó4do Taster Non- Taster Codão Aminoácido Codão Aminoácido c.145 CCA Pro GCA Ala c.785 GCT Ala GTT Val c.886 GTC Val ATC Ile
Haplo4pos no locus PTC Variable nucleo<de posi<ons in PTC haplotypes. Each haplotype is summarized in two rows. The top row summarizes nucleo<de varia<on in the haplotype, and the bomom row summarizes amino acid varia<on in the haplotype. Each column represents a codon containing a variable nucleo<de posi<on, indicated at the top of the column. The number of occurrences of each haplotype is indicated to the right for the African (Af), Asian (As), European (Eu), and North American (NA) samples. Shaded columns indicate the three variable amino acid posi<ons used for haplotype designa<on by Kim et al. (2003). Wooding et al. Am J Hum Genet. 2004 April; 74(4): 637 646.
SNPs no gene TAS2R38 O polimorfismo na posição 145 do mensageiro do gene TAS2R38 é detetado pela enzima de restrição HaeIII que reconhece a sequência 5 -GG CC-3! 3 -CC GG-5! Corte pela enzima T Ausência de corte pela enzima t Capacidade de sen<r o gosto amargo - pelo menos um alelo T (TT ou Tt) Incapacidade de sen<r gosto amargo - dois alelos t (m)
Um polimorfismo corresponde à coexistência numa população de 2 ou mais fenó<pos de uma caracterís<ca A maioria das populações são dimórficas em relação à capacidade de sen<r o gosto da fenil<ocarbamida amargo ou sem sabor. O alelo responsável pela sensação de amargo é dominante, enquanto o outro é recessivo
Deteção do polimorfismo rs713598 (c.145c>g ) do gene TAS2R38
U não digerido com HaeIII D digerido com HaeIII