Procedimento Operacional QUANTIFICAÇÃO DAS SUBPOPULAÇÕES LINFOCITÁRIAS CD4/CD8/CD3/CD45 PATRICIA VIANNA BONINI PALMA Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Centro de Terapia Celular, CRH-HCFMRP-USP
Objetivo
POP CD4 - Objetivo Identificação e enumeração de contagens absolutas e porcentagem de células CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ em amostras de sangue periférico humano de pacientes portadores do vírus HIV utilizando citometria de fluxo.
POP CD4 Aplicação Os linfócitos, junto com outras células e moléculas, são essenciais na resposta imune do organismo humano. Em condições fisiológicas, circulam no sangue periférico três populações distintas de linfócitos: os linfócitos T, os linfócitos B e as células Naturais Killer (NK). Os linfócitos T são responsáveis pela regulação da resposta imunológica e pela destruição de células infectadas por vírus. Os linfócitos B produzem anticorpos e os linfócitos NK atuam na destruição de células infectadas por vírus e algumas células tumorais. É possível classificar e quantificar os linfócitos, identificando seus marcadores de superfície, ou seja, moléculas específicas presentes na superfície dessas células. As investigações atuais demonstram que os linfócitos T CD4+ ( Céls T auxiliadoras) são as principais células alvo do HIV. O fenômeno mais característico da infecção pelo HIV é a redução da quantidade de linfócitos T CD4+. A diminuição da população de linfócitos é o que leva à imunodeficiência e ao conseqüente aparecimento das infecções oportunistas e dos neoplasmas característicos, por isso é necessário determinar a quantificação exata e confiável das subpopulações linfocitárias CD4/CD8, para que haja uma avaliação do sistema imune e no acompanhamento clínico do indivíduo infectado, alertando, inclusive, para a possibilidade do aparecimento de doenças oportunistas.
Princípios do Procedimento Utiliza-se um tubo TruCount por paciente para a marcação com o reagente Multitest (CD3/CD4/CD8/CD45). Quando a amostra de sangue é adicionada ao reagente, anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos ligam-se especificamente em antígenos de superfície das células. O botão (pellet) liofilizado do tubo trucount se dissolve soltando um número conhecido de microesferas fluorescentes. A solução de Facslysing é utilizada para a lise dos eritrócitos antes da amostra ser adquirida. Durante a análise o número absoluto de células CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ da amostra poderá ser determinado pela divisão do número de eventos celulares positivos pelo número de microesferas fluorescentes, então pela multiplicação da concentração das microesferas
Reagentes O Kit Multitest utilizado para quantificação das subpopulações linfocitárias CD4+/CD8+ contém o reagente CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ e tubos trucount suficientes para 50 testes. O reagente contém 0,5 ml de PBS com gelatina bovina e 0,1% de azída sódica. Os tubos Trucount contêm um botão liofilizado de microesferas de 4,2 µm fluorescentes O CD3 é o marcador exclusivo da linhagem T. O CD4 é o marcador da subpopulação de linfócitos T auxiliares, mas também está presente em baixa expressão nos monócitos e nos macrófagos e o CD8 é o marcador da subpopulação de linfócitos T citotóxicos, mas também está presente em baixa expressão nas células Natural Killer (NK).O CD45 é o marcador de pan de leucócitos.
Precauções Para uso in vitro. Não use para procedimentos terapêuticos. Adição de um volume preciso de sangue é crítico. As pipetas deverão estar calibradas para liberar a amostra exata de 50µl. Utilizar a técnica de pipetação reversa. A contagem das microesferas varia de acordo com o lote dos tubos Trucount. É necessário o uso do número de microesferas demonstrado no lote dos tubos Trucount para o calculo correto da contagem absoluta de CD3+/CD4+/CD8+ Não misture os lotes. Não congele os reagentes ou exponha-os à luz direta durante a estocagem ou incubação com as células. Guardar os tubos de reagentes a seco. Não use o reagente se observar mudanças na aparência. Precipitação, descoloração indica instabilidade ou deterioração. Os reagentes contêm azída sódica como preservativo, contudo, cuidados deverão ser tomados para evitar contaminações microbianas, as quais deverão causar resultados errôneos. Todo material biológico é considerado contaminado. Nunca pipetar com a boca. Usar luvas e vestimentas apropriadas (EPI). A solução de Facslysing é utilizada e contém dietileno glycol e formoldeído.
ESTOCAGEM E MANUSEIO Estocar o anticorpo verticalmente entre 2º e 8ºC. Não usar após o vencimento. Os tubos Trucount devem ser mantidos em sua embalagem original prateada de 2º à 25ºC. Para evitar uma condensação potencial, abrir a embalagem depois de ter alcançado a temperatura ambiente e cuidado para fechar a embalagem imediatamente após ter removido o tubo. Examinar a cor da sílica, se o dissecante mudar do azul para a cor lavanda, descartar os tubos. Usar os tubos dentro de uma hora após removê-los da embalagem. Uma vez a embalagem aberta, os tubos são estáveis por 2 meses. Não use após o vencimento indicado na embalagem.
EQUIPAMENTO O reagente MULTITEST é desenvolvido para uso em um citometro de fluxo equipado com computador e software apropriado. O citometro deverá estar equipado com um laser 488nm e 635nm e deverá ser capaz de detectar a dispersão da luz (frontal e lateral e ou ortogonal) e fluorescência de quatro cores dos seguintes comprimentos de ondas: 515-545nm (FL1), 562-607nm (FL2), maior que 650nm (FL3 )e 650nm (FL4) A BDIS recomenda o uso do citometro de fluxo Becton Dickinson tais como o Facscalibur, equipados com o software Multiset, para aquisição e análise dos dados automaticamente. Usar as microesferas calibrite 3 e APC beads e o software Facscomp versão 2.0 ou maior, para colocar voltagens nos tubos fotomultiplicadores (PMTS), compensação das fluorescências e para checar a sensitividade do instrumento. A escolha da opção Lyse/no wash.
CONDIÇÕES GERAIS Cada teste requer 50µl de amostra. Estocar o sangue com anticoagulante à temperatura ambiente (20º à 25ºC) até a marcação. Corar amostras até 48 horas após a coleta. Condições de Interferência Não usar amostras fixadas e estocadas. Amostra refrigerada antes da coloração poderá obter resultados aberrantes. Amostras hemolisadas ou coaguladas deverão ser rejeitadas
. PROCEDIMENTO MARCAÇÃO DAS CÉLULAS Para cada amostra de doador, marcar 1 tubo Trucount. Nota: Antes do uso, verificar se o botão de microesferas esta intacta e dentro da rede de metal. Se não estiver nas condições ideais, descartar o tubo e pegar outro. Pipetar 20ul do reagente de CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ dentro do tubo. Pipetar os reagentes na parede do tubo e não tocar no botão de microesferas Pipetar 50ul da amostra homogeneizada dentro de cada tubo usando uma pipeta calibrada. Utilizar a pipetação reversa. Pipetar na parede do tubo e usar para cada tubo uma ponteira nova. Agitar gentilmente o tubo e incubar por 15minutos no escuro à temperatura ambiente. Adicionar 450ul de solução Facslysing em cada tubo Homogeneizar gentilmente e incubar por 15 minutos à TA..
Gerar os seguintes gráficos: FL3/SSC FL1/FL2 FL1/SSC FL2/FL4. OTIM IZAÇÃO DA AMOSTRA Para começar a aquisição, utilizar o procedimento de calibração do citometro Lyse/NO wash. Homogeneizar o tubo contendo a amostra corada com CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ e colocá-la no citometro. O software Multiset fará os ajustes automaticamente..
. AQUISIÇÃO E ANÁLISE Coletar de 10.000 a 20000 eventos totais, sendo necessários pelo menos 2000 células CD45+ (células CD45+ de baixa granularidade SSC.). Leitura máxima de 100000 eventos, Se a amostra correr por mais que 5 minutos monitorar atentamente para o tubo não secar. Quando a aquisição da amostra já estiver completa, remova o tubo do citometro. OBS: A BD recomenda guardar todos os dados em arquivos. A analise é realizada automaticamente pelo software Multiset, permitindo apenas que o operador realize acertos nas janelas (Gates)..
. CALCULOS Cálculo para contagem absoluta Utilizar a seguinte equação para calcular a contagem absoluta de células CD4+/CD8+ células CD4+ X Microesferas testes* = Células CD4+ ou Células CD8+ nº microesferas volume do teste O número de células CD4+/CD8+ e microesferas são demonstrados na janela de estatísticas..
Validação dos lots de tubos trucount Para qualidade é necessário fazer a validação dos diferentes lots de tubos trucount. Escolhemos 10 amostras de sangue periferico de pacientes que chegam na rotina com CD4 entre 200-400, 401-600 e acima de 600 e analisamos simultaneamente com 9 tubos de trucount do novo lots e comparamos os valores. Analisamos o desvio padrão e aceitamos a variação de 5 a 10%, tanto para cima como para baixo.
Protocolo de Validação para os Exames de quantificação de células CD4/CD8/CD3/CD45 Para análise da Precisão foi descrito o seguinte: A Precisão de cada amostra será confirmada por medições repetidas de amostras conhecidas em momentos diferentes. As amostras de sangue periférico de pacientes portadores do virus HIV serão marcadas conforme o procedimento operacional descrito As amostras serão analisadas em tempos diferentes, sendo tempo Zero (momento que chegada ao lab),6h,24h,30h e 48hrs, isso para sangue total e para sangue marcado. Serão comparados os valores para CD4/CD8/CD3 e CD45 tanto para porcentagem como para número absoluto, em sangue marcado e sangue total
Protocolo de Validação para os Exames de quantificação de células CD4/CD8/CD3/CD45 1) Critérios de aceitação: foi descrito o seguinte: Serão aceitos valores iguais ou até 10% de variação abaixo ou acima em relação ao tempo zero.
Validação dos lots de tubos trucount LABORATÓRIO CITOMETRIA DE FLUXO - Validação / Setembro 2012 Lotes 11527-11529 LOTE CD4 CV CD4 % CD4 CV % CD4 CD8 CV CD8 %CD8 CV % CD8 CD3 CV CD3 %CD3 CV %CD3 CD45 CV CD45 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11527 11529 503 594-18,09 27,00 28,00-3,70 995 1154-15,98 53 54-1,89 1569 1817-15,81 84 85-1,19 1878 2130 11527 650 28,00 1175 51 1840 79 2317 11529 664-2,15 27,00 3,57 1252-6,55 52-1,96 1930-4,89 80-1,27 2422 11527 522 27,00 804 42 1369 71 1930 11529 570-9,20 27,00 0,00 857-6,59 41 2,38 1460-6,65 69 2,82 2116 11527 1043 36,00 1148 39 2294 78 2937 11529 1074-2,97 33,00 8,33 1282-11,67 40-2,56 2541-10,77 78 0,00 3241 11527 526 16,00 1897 59 2518 79 3202 11529 545-3,61 16,00 0,00 2066-8,91 61-3,39 2721-8,06 80-1,27 3392 11527 11529 701 872-24,39 26,00 24,00 7,69 1273 1785-40,22 46 48-4,35 2045 2799-36,87 75 75 0,00 2741 3726 11527 477 26,00 571 31 1079 58 1861 11529 483-1,26 25,00 3,85 614-7,53 32-3,23 1130-4,73 59-1,72 1911 11527 503 21,00 877 37 1425 60 2375 11529 464 7,75 21,00 0,00 832 5,13 38-2,70 1331 6,60 61-1,67 2187 11527 992 48,00 816 40 1808 88 2049 11529 990 0,20 47,00 2,08 860-5,39 41-2,50 1850-2,32 88 0,00 2101 11527 682 32,00 1053 50 1768 84 2104 11529 689-1,03 32,00 0,00 1062-0,85 50 0,00 1780-0,68 83 1,19 2140-13,42-4,53-9,64-10,35-5,93-35,94-2,69 7,92-2,54-1,71
Validação dos Pop- Sangue total - Hemocentro 1 2 3 4 5 6 7 8 Tempo CD4 CVCD4 % CD4 CV % CD4 CD8 CV CD8 %CD8 CV % CD8 CD3 CV CD3 %CD3 CV %CD3 CD45 CV CD45 0 704 34 894 44 1679 82 2051 6 horas 651-8,14 36 5,56 821-8,89 45 2,22 1539-9,10 84 2,38 1828-12,20 24 horas 659-6,83 33-3,03 828-7,97 45 2,22 1509-11,27 81-1,23 1859-10,33 30 horas 680-3,53 32-6,25 958 6,68 45 2,22 1742 3,62 83 1,20 2109 2,75 48 horas 618-13,92 33-3,03 1089 17,91 46 4,35 1869 10,17 82 0,00 1951-5,13 0 257 17 859 56 1123 73 1547 6 horas 261 1,53 17 0,00 819-4,88 58 3,45 1052-6,75 75 2,67 1403-10,26 24 horas 236-8,90 15-13,33 912 5,81 58 3,45 1162 3,36 74 1,35 1575 1,78 30 horas 235-9,36 17 0,00 860 0,12 57 1,75 1153 2,60 75 2,67 1539-0,52 48 horas 231-11,26 15-13,33 977 12,08 57 1,75 1326 15,31 74 1,35 1628 4,98 0 724 19 2144 55 2995 77 3885 6 horas 754 3,98 19 0,00 2009-6,72 58 5,17 2742-9,23 79 2,53 3483 24 horas 733 1,23 18-5,56 2299 6,74 57 3,51 3142 4,68 78 1,28 4022 3,41 30 horas 796 9,05 19 0,00 2415 11,22 57 3,51 3352 10,65 79 2,53 4237 8,31 48 horas 741 2,29 18-5,56 2333 8,10 58 5,17 3192 6,17 80 3,75 4011 3,14 0 125 12 902 59 783 77 1018 6 horas 133 6,02 13 7,69 879-2,62 62 4,84 801 2,25 79 2,53 1018 0,00 24 horas 145 13,79 13 7,69 889-1,46 59 0,00 796 1,63 79 2,53 1006-1,19 30 horas 131 4,58 13 7,69 852-5,87 63 6,35 849 7,77 83 7,23 1029 1,07 48 horas 144 13,19 14 14,29 650-38,77 63 6,35 836 6,34 81 4,94 1028 0,97 0 915 28 1453 44 2495 76 3304 6 horas 992 7,76 29 3,45 1559 6,80 43-2,33 2693 7,35 75-1,33 3588 7,92 24 horas 912-0,33 29 3,45 1403-3,56 44 0,00 2479-0,65 78 2,56 3194-3,44 30 horas 995 8,04 31 9,68 1435-1,25 42-4,76 2608 4,33 77 1,30 3379 2,22 48 horas 831-10,11 28 0,00 1324-9,74 45 2,22 2266-10,11 76 0,00 2964-11,47 0 1054 35 934 31 2123 71 2990 6 horas 979-7,66 36 2,78 891-4,83 33 6,06 1922-10,46 71 0,00 2693-11,03 24 horas 1046-0,76 36 2,78 947 1,37 33 6,06 2119-0,19 73 2,74 2903-3,00 30 horas 1114 5,39 37 5,41 890-4,94 30-3,33 2146 1,07 72 1,39 2974-0,54 48 horas 1118 5,72 35 0,00 1067 12,46 34 8,82 2329 8,84 73 2,74 3171 5,71 0 1703 38 1539 35 3338 75 4441 6 horas 1588-7,24 37-2,70 1581 2,66 37 5,41 3231-3,31 76 1,32 4249-4,52 24 horas 1568-8,61 39 2,56 1402-9,77 34-2,94 3041-9,77 75 0,00 4064-9,28 30 horas 1602-6,30 38 0,00 1468-4,84 35 0,00 3162-5,57 75 0,00 4204-5,64 48 horas 1586-7,38 39 2,56 1393-10,48 34-2,94 3074-8,59 75 0,00 4074-9,01 0 731 39 455 24 1229 66 1869 6 horas 781 6,40 39 0,00 528 13,83 25 4,00 1380 10,94 66 0,00 2078 10,06 24 horas 778 6,04 41 4,88 491 7,33 25 4,00 1346 8,69 68 2,94 1968 5,03 30 horas 775 5,68 41 4,88 438-3,88 23-4,35 1276 3,68 68 2,94 1888 1,01 48 horas 853 14,30 42 7,14 400-13,75 25 4,00 1090-12,75 68 2,94 1575-18,67
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