Técnicas moleculares
PCR Reação em Cadeia da Polimerase Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Kary Mullis ganhou o prêmio Nobel em 1993 pela invenção da PCR. http://www.karymullis.com
PCR Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas Estudos populacionais
PCR Reação de PCR: DNA dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão
PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos
Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.
Hibridação A temperatura é reduzida a 50-65 ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde
Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores
PCR desenho dos iniciadores Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Especificidade: pode ser testada no blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?link_loc=blasthomead Evitar a formação de dímeros de iniciadores: pode ser testado em diversos programas (por ex.: FastPCR)
PCR-RFLP Enzima de restrição: mutação cria sítio de restrição mutação elimina sítio de restrição Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese
Enzimas de restrição Exemplo de enzima de restrição:
PCR-RFLP Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG...3' BsoFI 85 pb ' 21 pb
PCR-RFLP 85pb UU UK KK 106pb
PCR-SSCA (ou SSCP) Análise de Conformação de Fita Simples Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).
PCR-SSCA
PCR-SSCA
Seqüenciamento didesoxi Método de Sanger Síntese de DNA na presença de nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3 -hidroxila. Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese
PCR em tempo real É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.
PCR em tempo real
PCR em tempo real SYBR Green é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador. Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação
PCR em tempo real SYBR Green
PCR em tempo real Taqman
PCR em tempo real
PCR em tempo real Quantificação Aplicações Detecção de carga viral Determinação do número de cópias de um gene Análise da expressão gênica
PCR em tempo real Exemplo de aplicação: Investigação de amplificação ou deleção dos genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.
PCR em tempo real Quantificação relativa TumorCHE / Tumor18S Q = SangueCHE / Sangue18S
PCR em tempo real Gene BCHE Sem Informação 20,93% Amplificado 18,60% Inalterado 9,30% Deletado 51,16%
Genotipagem
Genotipagem
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381 Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica População 1 Grupo n 2 TT TC CC HW T C Guarani (GRC) Ameríndio 58 0,431 0,414 0,155 >0,250 0,6379 0,3621 Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,793 0,190 0,017 >0,500 0,8898 0,1102 Japão (JPT) Asiático 85 0,294 0,494 0,212 >0,950 0,5410 0,4590 China (HCB) Asiático 81 0,272 0,506 0,222 >0,750 0,5250 0,4750 Europa (CEU) Euro-americano 111 0,441 0,477 0,081 >0,250 0,6800 0,3200 Nigéria (YRI) Africano 112 0,955 0,045 0,000 >0,750 0,9780 0,0220 Fonte: Alves, 2009
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495 Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica População 1 Grupo n 2 GG GA AA HW G A Guarani (GRC) Ameríndio 57 0,000 0,035 0,965 >0,750 0,0175 0,9825 Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,000 0,069 0,931 >0,750 0,0345 0,9655 Europa (EUR) Euro-americano 24 0,042 0,375 0,583 1,000 0,2290 0,7710 China (CHN) Asio-americano 24 0,000 0,458 0,542 0,150 0,2290 0,7710 Afro-brasileiros (AFBII) Afro-brasileiro 218 0,170 0,427 0,404 >0,100 0,3830 0,6170 África (AFR) Afro-americano 22 0,364 0,591 0,045 0,150 0,6590 0,3410 Fonte: Alves, 2009