UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: Fevereiro/2015 a Julho/2015 (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Hanseníase multirresistente a poliquimioterapia no Estado do Pará / CNPq Nome do Orientador: Prof. Dr. Moises da Silva Batista Faculdade: Biologia Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Dermato-imunologia Título do Plano de Trabalho: Diagnóstico molecular em casos de hanseníase atendidos na Unidade de Referência Especializada em Dermatologia Sanitária do Estado do Pará URE Dr. Marcelo Cândia Nome do Bolsista: Jhonny Pereira Feitoza Tipo de Bolsa: PIBIC/ FAPESPA

2 1. INTRODUÇÃO A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, porém tratável (GELUK, 2013), que atinge principalmente a pele e os nervos periféricos, ocasionada pelo Mycobacterium leprae. Conforme descrito por Ridley e Jopling, com base em critérios clínicos, histopatológicos e imunológicos a classificação da doença é definida dentro de dois pólos e os aspectos transicionais: tuberculóide-tuberculoides (TT), boderline-tuberculoides (BT), borderlineborderline (BB), borderline-lepromatoso (BL) e lepromatoso-lepromatoso (LL) (ZEA et al., 1998). Porém, a OMS introduziu uma classificação operacional mais simples, Classificando os pacientes em paucibacilares que apresentam raras lesão (até 5) ou pacientes multibacilares, com mais de cinco lesões de pele (RODRIGUES; LOCKWOOD, 2011). Em 1981, o tratamento da hanseníase apresentou um avanço com a introdução do Poliquimioterapia (PQT) pela OMS, com a utilização da Rifampicina (RFM), Dapsona (DDS) e Clofazimina (CFZ), e o objetivo de controle da doença se tornou mais consistente. 10 anos depois, em 1991, a OMS intensifica as atividades de eliminação da doença como problema de saúde pública e estabelece que a hanseníase seja dita eliminada quando a prevalência é inferior a um caso em 100 mil habitantes (WHO, 1991). Atualmente a doença ainda representa um problema de saúde pública em diversos países em desenvolvimento, onde a doença é endêmica, como a Índia e o Brasil, mesmo com as medidas de controle sendo aplicadas (BRASIL, 2005; Guia para o Controle da Hanseníase, [s.d.]; WHO, 2000, 2013). A prevalência mundial da hanseníase registrada até o final do primeiro trimestre de 2013 foi de casos, sendo que em 2012 foram registrados Por esses motivos a hanseníase ainda é um problema de saúde pública em diversos países no mundo, como: Brasil, Índia, Bangladesh, entre outros (WHO, 2014). Apesar do modo de transmissão não estar totalmente esclarecido, acredita-se que a principal fonte de infecção seja o contato íntimo e prolongado com pacientes não diagnosticados e por isso, ainda sem tratamento (RAO et al., 2005), tornando os seus contatos intradomiciliares o principal grupos de risco para o manutenção da alta incidência e detecção (MOET et al., 2004). No Brasil a distribuição da hanseníase não é uniforme entre os estados. A maior parte dos casos da doença se concentram nos estados do Norte, Nordeste e Centro-oeste. O estado do Pará, destaca-se por sua alta taxa de detecção. Em 2012 foram notificados no estado casos novos, resultando em um coeficiente anual de 50casos/ habitantes, mantendo o Estado do Pará com o status de hiperendêmico (VIGIL; SA; SVS, 2012). 2

3 Apesar do sucesso da PQT na eliminação da hanseníase, a OMS voltou os seus cuidados para o monitoramento de resistência. Cerca de 26 anos depois do inicio da utilização do PQT, a OMS iniciou o seu projeto de vigilância em hanseníase resistente a fármacos, muitos países então começaram a notificar os casos de recidiva com mais frequência. O M. leprae adquire a resistência aos fármacos através de mutações de pontos que ocorrem, respectivamente, no gene gyra e gyrb, para resistência a CFZ, rpob, para RFM e folp, para DSS (MAEDA et al., 2001). Uma das alternativas para o auxilio diagnóstico da hanseníase é a detecção de Imunoglobulinas M (IgM) anti PGL-I pela técnica de ELISA. PGL-I são antígenos altamente específicos do M. leprae, o PGL-I estimula uma resposta humoral com o aumento da titulação de IgM no organismo (DEPS et al., 2008). Detecção de IgM anti PGL-I pelo ELISA em pacientes multibacilares varia de 85% a 100%, e em pacientes PB de 5% a 34% (CELLONA et al., 1993). Estas diferenças entre as duas formas polares ocorrem porque a forma multibacilar apresenta deterioração da imunidade celular, uma alta carga antigênica e alta níveis de anticorpos, e a forma paucibacilar apresenta parâmetros de imunidade celular intactos, raros bacilos e pouca ou nenhuma elevação dos níveis de anticorpos. Este aspecto particular da hanseníase em duas formas polares faz com que a sorologia seja principalmente designada para o diagnóstico das formas multibacilar (TORELA et al., 1998). Dado isto, a biologia molecular, com o uso da Reação em cadeia da Polimerase (PCR), surge como um importante aliado para o diagnóstico da doença, visto que tem demonstrado maior sensibilidade que as outras técnicas, principalmente para a forma paucibacilar (CALEFFI et al., 2012). A detecção do M. leprae por PCR se dá através da amplificação de sequências alvo, que podem variar desde regiões codificantes do genoma a sequências repetitivas do genoma do bacilo. Essas técnicas têm sido utilizadas e apresentam uma maior sensibilidade na detecção do patógeno (CRUZ; FURINI; ROSELINO, 2011) O diagnóstico precoce e a introdução do tratamento específico são importantes para reduzir fontes de transmissão e para prevenir deficiências físicas e a incapacidade (STEFANI, 2008). Atualmente a hanseníase é diagnosticada através da observação dos sinais clínicos do indivíduo, aliado a ferramentas de diagnóstico laboratorial, baseado em contagem bacilar de raspados instradérmicos e histopatologia, mas estes métodos são pouco sensíveis, especialmente em distinguir infecção latente de doença ativa e para o diagnóstico de formas iniciais (MARTINEZ et al., 2014). Dado isto, a biologia molecular, com o uso da Reação em cadeia da Polimerase (PCR), surge como um importante aliado para o diagnóstico da doença, 3

4 visto que tem demonstrado maior sensibilidade que as outras técnicas, principalmente para a forma paucibacilar (CALEFFI et al., 2012). A detecção do M. leprae por PCR se dá através da amplificação de sequências alvo, que podem variar desde regiões codificantes do genoma a sequências repetitivas do genoma do bacilo. Essas técnicas têm sido utilizadas e apresentam uma maior sensibilidade na detecção do patógeno (CRUZ; FURINI; ROSELINO, 2011) Diversas áreas têm sido utilizadas para a detecção do M. leprae, entre elas podemos citar os genes que codificam as proteínas de 65, 36 e 18kDa, e sequências repetitivas, que têm sido as mais utilizadas para o diagnóstico etiológico da hanseníase e, muitas vezes, têm se mostrado mais sensíveis e específicas do que o exame baciloscópico rotineiramente utilizado (CRUZ; FURINI; ROSELINO, 2011). Entre as áreas que podem ser utilizadas para a amplificação, está a região polimórfica no gene RpoT, que contém três ou quatro cópias de uma repetição em tandem de seis bases que pode ser usada para detectar a presença de ácido desoxirribonucleico (DNA) do bacilo após sua amplificação (ZHANG; BUDIAWAN; MATSUOKA, 2005). 2. JUSTIFICATIVA Apesar dos esforços das autoridades de saúde do Estado do Pará, a hiperendêmicidade não regrediu nos últimos anos e de acordo com os novos projetos desenvolvidos pelo grupo do Laboratório de Dermato-Imunologia, baseados em ferramentas imunológicas teste de ELISA anti-pgl-i as taxas de detecção podem estar subestimadas (BARRETO et al., 2012), torna-se imprescindível que haja o estudo de formas alternativas de diagnóstico para a doença, visando aperfeiçoar a forma de detecção do seu agente etiológico precocemente, a fim de quebrar a cadeia de transmissão da doença. O esquema de poliquimioterapia (PQT) foi implantado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a partir de 1981, contribuindo drasticamente para redução da taxa de prevalência da hanseníase (WHO, 1982). A OMS preconiza o esquema PQT, com objetivo principal de atuar na prevenção da seleção de cepas resistentes. Embora seja considerado um evento raro, a recidiva é um indicador importante de eficiência terapêutica. Casos de recidiva associados à resistência as drogas da PQT representam um problema emergente, porém desde a década de 60 vários relatos de sua ocorrência tem sido descritos. A biologia molecular, através da PCR tem se mostrado de extrema importância para o diagnóstico precoce da doença, levando em consideração sua maior especificidade na 4

5 detecção do bacilo, ao se utilizar de sequências específicas do genoma do bacilo para a detecção do mesmo. Essas técnicas se mostram como uma importante e inovadora forma de aperfeiçoamento no controle dessa doença que ainda é um problema de saúde pública no Brasil, especialmente no estado do Pará, por ser uma área hiperendêmica. 3. OBJETIVOS 3.1. Geral Avaliar a efetividade da reação em cadeia da polimerase da região rpot relacionada ao exame sorológico anti-pgl-1, no diagnóstico precoce da hanseníase e identificar possíveis cepas de resistentes a poliquimioterapia atendidos na Unidade de Referência Especializado Dr. Marcelo Candia Específicos Coletar raspado intradérmico de casos confirmados e suspeitos de hanseníase do município de Castanhal-Pa Extrair o DNA total do material coletado a partir dos lóbulos auriculares de pacientes suspeitos e posteriormente amplificá-los através de PCR Amplificar a região RpoT nas amostras coletadas Realizar quantificação de anticorpos anti-pgl-i por técnica de ELISA Descrever o perfil molecular das mutações de cepas de Mycobacterium leprae multirresistente a poliquimioterapia no Estado do Pará. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Amostragem Foram utilizadas 13 amostras de biopsias de pele de casos de hanseníase, coletadas no momento de caracterização de recidiva dos pacientes atendidos na Unidade de Referência Especializada em Dermatologia Sanitária Dr. Marcelo Candia, localizada no município de Marituba (PA). Durante uma viagem do projeto ao município de Castanhal, foram avaliados 79 casos índice presentes no sistema de agravo de notificação do município, diagnosticados nos 5

6 últimos 5 anos em Castanhal, além de 5 escolas públicas randomicamente selecionadas, nas escolas foram selecionadas duas turmas que participaram do estudo. As turmas foram previamente selecionadas e os pais ou responsáveis convidados a participar do projeto. Na primeira viagem os estudantes tiveram sangue coletado para teste sorológico anti- PGL-I e pssaram por avaliação médica com um hansenologista da equipe multiprofissional. Os casos índice, novos casos diagnosticados e comunicantes tiveram sangue coletado também passaram por coleta de raspado intradérmico dos pavilhões auriculares, que foram preservados em Etanol 70% sob refrigeração (-20 C). Após a realização do ensaio imuno-enzimático ELISA anti-pgl-i de todos os estudantes, selecionamos 5 estudantes com PGL-positivo que não apresentavam sintomas clínicos para que fossem revisitados e seus comunicantes fossem avaliados e fosse realizada coleta de raspado intradérmico dos pavilhões auriculares. Selecionamos porteriormente, de forma randômica, 5 casos Index (4 multibacilares e 1 paucibacilar), 15 comunicantes intradomiciliares de casos índices; 10 estudantes da rede pública de ensino que na primeira avaliação apresentaram sorologia positiva para o resultado do anti-pgl-i, mas não apresentavam sintomas clinicamente diagnosticáveis e dentre estes um grupo de 7 contatos de estudantes anti-pgi positivos Obtenção do DNA Para obtenção de DNA total utilizou-se o kit comercial da DNeasy para sangue e tecido (DNeasy Blood & Tissue Kit). De acordo com as instruções do fabricante Amplificação do DNA A amplificação das amostras se deu através de PCR convencional, onde as amostras foram colocadas em uma placa de 96 poços e seguiram as seguintes etapas: a reação se deu em 50 μl de solução contendo concentrações de 1,0 μm dos dntps, 1,5 μm de MgCl2, 50 μm de KCl, 10 μm de Tris/HCl (ph 8.3), 30 pmol de cada iniciador μl-1e uma U de Taq DNA Polymerase (QIAGEN), sendo utilizado 2 μl de DNA. A termociclagem seguiu uma etapa de desnaturação inicial de 5 minutos a 94 C, seguido de um procedimento de touchdown, de maneira que após a desnaturação por 45 segundos a 94 C, houve redução de 1 C nos 6 primeiros ciclos na etapa de anelamento dos primers que se deu em uma temperatura de 6

7 68-63 C por 45 segundos, os ciclos consecutivos se deram em 45 segundos a 94 C, 45 segundos a 62 C e 72 C por 90 segundos, a extensão final foi de 72 C por 10 minutos. E por fim as amostras foram analisadas por eletroforese utilizando Gel de agarose 2,5%, marcado com CyberSafe e visualizado por luz ultravioleta Análise molecular de resistência Foi realizada por PCR a detecção dos genes rpob, gyrb, gyra e folp para caracterizar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos da PQT. Os iniciadores estão listados na tabela 01. O PCR se deu segundo o protocolo de Rocha e colaboradores, de maneira que a reação se deu em 50 µl de solução contendo concentrações de 1,0 µm dos dntps, 1,5 µm de MgCl 2, 50 µm de KCl, 10 µm de Tris/HCl (ph 8.3), 30 pmol de cada iniciador µl -1 euma U de Taq DNA Polymerase (QIAGEN), sendo utilizado 2 µl de DNA. A termociclagem seguiu uma etapa de desnaturação inicial de 5 minutos a 94 C, seguido de um procedimento de touchdown, de maneira que após a desnaturação por 45 segundos a 94 C, houve redução de 1 C nos 6 primeiros ciclos na etapa de anelamento dos primers que se deu em uma temperatura de C por 45 segundos, os 35 ciclos consecutivos se deram em 45 segundos a 94 C, 45 segundos a 62 C e 72 C por 90 segundos, a extensão final foi foi de 72 C por 10 minutos(da SILVA ROCHA et al., 2011). Os produtos foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% e ao resultado positivo seguiram para etapa de purificação. Iniciador Sense Anti-sense Aplicon MrpoB GGTGGTCGCCGCTATCAAG TTTGCGGTACGGTGTTTCG 289 folp TACTTACTGTAATCCCCTGTGCTG TTGATCCTGACGATGCTGTC 173 gyrb ACTGATCCTCGAAGTTCTGAACTG TTGATCCTGACGATGCTGTC 187 gyra CATCGCTGCCGGTGGGTCATTA CCCGGACCGTAGCCACGCTAAGTC 178 Tabela 01: Genes relacionados a caracterização molecular do perfil de resistência e respectivos iniciadores utilizados na reação em cadeia da polimerase Purificação dos amplicons para o sequenciamento Para a purificação dos produtos do PCR de VNTR s, realizou-se PCR com o volume final de 50 µl, contendo 2-5 µl de DNA, 0,5 µm de cada primer e 25 µl de HotStarTaq Master Mix (QIAGEN), no qual continha tampão, 2,5 U de DNA polimerase HotStarTaq e 7

8 200 µm dos dntps. A termociclagem se deu em uma fase de desnaturação inicial de 95 C por 15 minutos, 35 ciclos de 94 C por 30 segundos, 60 C por 30 segundos, 72 C por 30 segundos, 72 C por 30 segundos e 72 C por 10 minutos de extensão final. As amostras positivas no PCR tiveram os amplicons purificados, utilizando o kit QIAquink PCR Purification (QIAGEN) segundo as orientações do fabricante. Então, a fim de estimar a quantidade de material a ser utilizado na reação de sequenciamento ELISA Anti igm Anti-PGL-I A detecção de anticorpos no plasma dos indivíduos contra o antígenos PGL-I do Mycobacterium leprae, seguiu protocolo estabelecido (SPENCER; BRENNAN, 2011) e que pode ser sintetizado da seguinte maneira: As placas foram sensibilizadas com o antígeno na concentração de 1µg/ml e incubadas overnight a 4ºC. Após consecutivas lavagens e bloqueio, amostra de plasma diluído em 1:300 e adicionados1 e incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Cada indivíduo tinha um branco que não era sensibilizado com os antígenos. Para então se adicionado o anticorpo secundário IgM e adicionados 100 μl do substrato OPD (Sigma Aldrich). O resultado foi considerado positivo quando a densidade óptica (D.O) foi maior que nm (cut-off), considerando-se a média de três vezes o desvio padrão do resultado dos testes de quatorze indivíduos saudáveis de uma mesma área hiperendêmica. O valor da DO final de cada amostra de plasma foi determinado por subtrair o background da D.O dos poços dos controles brancos da média das duplicatas de cada indivíduo. Foi utilizado como controle positivo, plasma de paciente reconhecidamente com elevado índice bacilar, para o controle negativo foi utilizado plasma de indivíduo residente em área não endêmica para hanseníase. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO A resistência aos fármacos são determinadas por mutações de ponto, a alteração no gene folp foi descrita em 1964, como mutação de ponto nos códons 53 e 55 (MAEDA et al., 2001), enquanto que as mutações afetando o códons 425 do gene rpob são responsáveis pela resistência a R (DUTHIE et al., 2007) FM e a resistência a CFZ se dá pela mutação nos códons 89 e 91 no gene gyra e na posição 502 para o gene gyrb (HONORE; COLE, 1993; YOKOYAMA et al., 2012a, 2012b). Este trabalho analisou parcialmente os genes de 8

9 resistência utilizando primes amplamente utilizados por vários autores (DA SILVA ROCHA et al., 2012; MAEDA et al., 2001) Em relação ao perfil de suscetibilidade, nenhum dos isolados apresentou qualquer uma das mutações pesquisadas, de maneira que 85,7 % apresentaram resultado positivo na PCR para pelo menos um dos alvos, mas que ao sequênciamento, observou-se perfil suscetível aos fármacos (tabela 01). Amostra gyrb gyra folp rpob 1 S S S S 2 S S S S 3 S S S S 4 S S S S 5 NEG NEG NEG NEG 6 S S S S 7 NEG NEG NEG NEG 8 S NEG NEG NEG 9 S S S S 10 S S S S 11 S S S S 12 S S NEG S 13 S S S S Tabela 01: Perfil de suscetibilidade de isolados de Mycobacterium leprae de pacientes de recidiva atendidos na Unidade de Referência Especializada URE Dr. Marcelo Candia. Em relação ao perfil de suscetibilidade, nenhum dos isolados apresentou qualquer uma das mutações pesquisadas, de maneira que 85,7 % apresentaram resultado positivo na PCR para múltiplos alvos, e 70% positivos para todos os alvos analisados; mas que ao sequenciamento dos fragmentos, observou-se perfil suscetível sem mutações reconhecidas - aos fármacos em todas as amostras avaliadas. Como todas as cepas analisadas apresentaram perfil de sensibilidade as medicações utilizadas no tratamento da hanseníase, o que nos sugere que a reexposição ou reinfecção é o motivo da recidiva nos casos estudados. Não apresentando relação com a seleção de cepas resistentes. Os pacientes passaram ao esquema alternativo de tratamento e estão em acompanhamento A re-exposição a nova cepa poderia ser comprovada se tivéssemos acesso ao material genético da cepa coletada no primeiro diagnóstico, material que está armazenado no acervo de lâminas de baciloscopia sob guarda da secretaria de saúde do Estado do Pará, através de contato com a Unidade de Referência Especializada Dr. Marcelo Candia iremos verificar a possibilidade de disponibilização desse material para posterior extração e DNA e 9

10 Ig M A n ti-p g l-i tite rs amplificação das regiões repetitivas em tandem (VNTR) que são utilizadas para a caracterização das cepas de M. leprae (MONOT et al., 2008). Para avaliar a viabilidade da reação em cadeia da polimerase no diagnóstico de pacientes em estágios iniciais da hanseníase, utilizamos como alvo a sequencia polimórfica do gene RpoT, o material genético do bacilo foi detectado no raspado intradermico realizado em casos índice e seus comunicantes. Selecionamos aleatoriamente 5 casos índice, 15 contatos de casos e 10 estudantes da rede pública de ensino (tabela 01). Os 5 caso índex selecionados, apesar de apresentarem sorologia positiva (DO. 1,378) em 60% dos casos, todos apresentaram reação negativa para amplificação de rpot. Os contatos intradomiciliares apresentaram 20% positividade na PCR e sorologia positiva (OD. 0,631) em 66,7% dos casos. Todos os estudantes apresentavam reação sorológica positiva anti-pgl-1 (0,596), mas apenas 30% deles foram positivos na PCR. Dentre os contatos de estudantes clinicamente saudáveis, mas com elevado PGL, apresentaram sorologia positiva (DO. 0,646) 71,4% e 66% de positividade na amplificação da região rpot. 1.5 * C u t-o ff 0.0 C a s o s C o n t a t o s E s t u d a n t e s C E - P G L + Figura 01) Relação entre as medianas das densidades ópticas entre os grupos avaliados e a relação de positividade no PCR para a região rpot. Observou-se a diferença estatisticamente significante entre as DO da titulação do anticorpo IgM Anti-PGL-I obtidas para os casos índexes (anteriormente tratados e com alta por cura há mais de uma nos) para estudantes da rede pública de ensino e seus comunicantes, enquanto que essa diferença estatística não é observada em seus próprios comunicantes. Apesar destes ex-pacientes ainda apresentarem uma titulação alta para o anticorpo, não foi possível detectar por amplificação da região rpot nas amostras coletadas, indicando a ausência do bacilo nestes ex-pacientes. Essa diferença nos sugere que a utilização do teste de ELISA Anti IgM 10

11 anti-pgl-i no soro dos pacientes não é indicada como um critério de cura, enquanto que o amplificação de regiões específicas do genoma do agente nos parece mais promissora. Casos Index Contatos Estudantes Contatos de estudantes PGL-I rpot PCR PGL-I rpot PCR PGL-I rpot PCR PGL-I rpot PCR Casos Index Contatos Estudantes Contatos de estudantes N % N % N % N % N % N % N % N % Positivo , ,4 Negativo , ,6 Total Tabela 01) relação entre titulação de anticorpos IgM Anti-PGL-I e amplificação da região ropt de Mycobacterium leprae nas amostras do município de Castanhal. Entre os contatos de casos índexes, 15 indivíduos total, tivemos 3 indivíduos que não apresentaram sintomas clínicos, mas apresentaram positividade sorológica e amplificação da região rpot de M. leprae, todos contatos de casos multibacilares (BT e L). Entre os estudantes clinicamente saudáveis tivemos 30% de amplificação positiva no PCR e estes indivíduos também apresentaram titulação positiva de IgM anti-pgl-i (0,878; 0,647 e 0,348). Ao analisarmos isoladamente a titulação dos 5 estudantes (figura 02) que foram aleatoriamente selecionados e que tinham sorologia positiva no ELISA anti IgM Anti-PGl-I e compararmos a positividade para o PCR de rpot observaremos que apesar de não haver diferença estatística na titulação do anticorpo entre os grupo, os comunicantes 5 entre 7 apresentaram positividade ao PCR. Esse achado nos indicava que eles poderiam ser pacientes não diagnosticados. Durante um retorno a cidade estes comunicantes foram avaliados, 4 deles apesar de apresentarem PGL e PCR positivos não apresentavam sintomas clínicos detectáveis da doença, apenas um deles (20%) foi diagnosticado como caso novo de hanseníase durante a avaliação clínica realizada in loco. Este novo caso, fio detectado em uma criança de 10 anos, que era comunicante de um paciente multibacilar. A criança tinha a cicatriz vacinal da BCG, apresentou grau de incapacidade 0, apenas uma lesão macular e infiltrativa, sendo classificada na forma Boderline-tuberculóide (BT). O que nos sugere que a associação de resultados sorológicos e de amplificação e DNA a partir do raspado intra-dermico dos lóbulos auriculares podem ser úteis no diagnóstico precoce da hanseníase. 11

12 Ig M A nti-pg l-i titers C u t-o ff 0.0 E s t u d a n t e s C E - P G L + Figura 02) Gráfico de titulação dos 5 estudantes com alta titulação de IgM anti-pgl-i circulante saudáveis e seus comunicantes. Em vermelho os indivíduos PGL positivos e PCR rpot negativo, em azul o paciente PGL positivo e PCR positivo. Como a hanseníase é uma patologia de desenvolvimento lento, e tivemos outros quatro contatos positivos tanto no PCR quanto na titulação sorológica de IgM anti-pgl-i, estes comunicantes serão revisitados pelo grupo do laboratório para acompanhamento e confirmação ou não do desenvolvimento da doença. 6. CONCLUSÕES 6.1. Apesar do hiperendemicidade e do relato de casos de recidiva hansênica no Estado do Pará, dentre as amostras coletadas não houve relação entre pacientes com recidiva hansênica e perfil de resistência das cepas avaliadas, sugerindo a reinfecção dos pacientes, restando ainda genotipar as cepas Devem ser analisados outros antígenos e outras regiões de amplificação específicas de Mycobacterium leprae para que possamos avaliar associações mais efetivas para o diagnóstico precoce da hanseníase, bem como o acompanhamento por períodos mais longos dos pacientes PGL/rpoT positivos A associação de resultados positivos em ELISA Anti-PGL-I e PCR ropt a partir do raspado intra-dermico podem ser úteis no diagnóstico precoce da hanseníase. 12

13 8. REFERÊNCIAS BARRETO, J. G. et al. High rates of undiagnosed leprosy and subclinical infection amongst school children in the Amazon Region. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 107, p , dez BRASIL, M. DA S. Guia de Vigilância Epidemiológica. 6. ed. Brasília: Editora do Ministério da Saúde., p. 816 CALEFFI, K. R. et al. Use of the polymerase chain reaction to detect Mycobacterium leprae in urine. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 45, n. 2, p , CRUZ, A. F. DA; FURINI, R. B.; ROSELINO, A. M. F. Comparison between microsatellites and Ml MntH gene as targets to identify Mycobacterium leprae by PCR in leprosy. Anais brasileiros de dermatologia, v. 86, n. 4, p , DA SILVA ROCHA, A. et al. Genotyping of Mycobacterium leprae from Brazilian leprosy patients suggests the occurrence of reinfection or of bacterial population shift during disease relapse. Journal of medical microbiology, v. 60, n. Pt 10, p , out GELUK, A. Biomarkers for leprosy: would you prefer T (cells)? Leprosy review, v. 84, n. 1, p. 3 12, Guia para o Controle da Hanseníase. Disponível em: < Acesso em: 21 abr MAEDA, S. et al. Multidrug resistant Mycobacterium leprae from patients with leprosy. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 45, n. 12, p , dez MARTINEZ, A. N. et al. PCR-Based Techniques for Leprosy Diagnosis: From the Laboratory to the Clinic. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 8, n. 4, p. 1 8, MOET, F. J. et al. Risk factors for the development of clinical leprosy among contacts, and their relevance for targeted interventions. Leprosy review, v. 75, n. 4, p , MONOT, M. et al. Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae? Journal of Clinical Microbiology, v. 46, n. 7, p , RAO, P. N. et al. Comparison of two systems of classification of leprosy based on number of skin lesions and number of body areas involved--a clinicopathological concordance study. Indian journal of dermatology, venereology and leprology, v. 71, n. 1, p , RODRIGUES, L. C.; LOCKWOOD, D. N. J. Leprosy now: Epidemiology, progress, challenges, and research gaps. The Lancet Infectious Diseases, v. 11, n. 6, p ,

14 SPENCER, J. S.; BRENNAN, P. J. The role of Mycobacterium leprae phenolic glycolipid I (PGL-I) in serodiagnosis and in the pathogenesis of leprosy. Leprosy review, v. 82, n. 4, p , dez STEFANI, M. M. D. A. Challenges in the post genomic era for the development of tests for leprosy diagnosis. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 41 Suppl 2, n. Suplemento II, p , VIGIL, S. D. E.; SA, N. E. M.; SVS, D.-. Situação Epidemiológica Hanseníase Brasil WHO. Leprosy elimination a public health success story! World Health Organization, p. 2 4, WHO. Guia para eliminação da lepra como problema de saúde pública. World Health Organization, p. 21, WHO. Weekly epidemiological record: Global leprosy - update on the 2012 situation. World Health Organization Geneva, v. 88, n. 35, p , WHO. Global leprosy update Weekly epidemiological record, v. 89, n. 36, p , ZEA, A. H. et al. Changes in expression of signal transduction proteins in T lymphocytes of patients with leprosy. Infection and Immunity, v. 66, n. 2, p , ZHANG, L.; BUDIAWAN, T.; MATSUOKA, M. Diversity of potential short tandem repeats in Mycobacterium leprae and application for molecular typing. Journal of clinical, v. 43, n. 10, p ,