UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM EDUCAÇÃO FÍSICA

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1 1 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM EDUCAÇÃO FÍSICA EFEITOS DO TREINAMENTO AERÓBIO, RESISTIDO OU COMBINADO AERÓBIO-RESISTIDO AGUDOS NOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS DOS ÁTRIOS DIREITO E ESQUERDO DE RATO WISTAR Aluno: Eduardo Victor Pianca Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza São Paulo, 01 Maio de 2016

2 2 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA EFEITOS DO TREINAMENTO AERÓBIO, RESISTIDO OU COMBINADO AERÓBIO-RESISTIDO AGUDOS NOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS DOS ÁTRIOS DIREITO E ESQUERDO DE RATO WISTAR Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do título de Doutor em Educação Física São Paulo, 01 de Maio de 2016

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4 4 FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome: Eduardo Victor Pianca EFEITOS DO TREINAMENTO AERÓBIO, RESISTIDO OU COMBINADO AERÓBIO-RESISTIDO AGUDOS NOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS DOS ÁTRIOS DIREITO E ESQUERDO DE RATO WISTAR Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do título de Doutor em Educação Física Área de concentração: Bases Biodinâmicas da Atividade Física Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza Data: / / Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição Assinatura Julgamento: Prof. Dr. Instituição Assinatura Julgamento: Prof. Dr. Instituição Assinatura Julgamento:

5 5 Lista de Figuras e Tabelas Figura 1 - Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, visto com grande aumento, mostrando grânulos de ANP (setas) e de BNP (cabeças de setas) no citoplasma do cardiomiócito. Figura 2 - Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, com pequeno aumento, mostrando numerosos grânulos de peptídeos natriurétricos (setas) no citoplasma. N-Núcleo do cardiomiocito; M-mitocondrias. Figura 3 - Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, com maior aumento do que o da Fig. 2, mostrando grânulos de ANP (seta) e de BNP (cabeça de seta) no citoplasma do cardiomiócito.são mostrados também o núcleo do cardiomiócito (N), mitocôndrias (M), o retículo endoplasmático (ER), o aparelho de Golgi (G) e miofibrilas (m). Figura 4 - Estrutura molecular do Ran, proteína responsável pelo transporte do RNAm para regular a produção de ANP no citoplasma. Figura 5 - A onda a (em azul) representa a contração atrial. Pode-se observar que a pressão atrial direita aumenta em cerca de 4 a 6 mmhg, durante a contração atrial, enquanto que a pressão atrial esquerda aumenta cerca de 7 a 8 mmhg. Figura 6 - Equipamento utilizado para o exercício de força. O equipamento é confeccionado em madeira com degraus de ferro. A altura do equipamento é de 110 cm com inclinação de 80º (Hornberger e Farrar, 2004). Figura 7 - Ilustração de um dos animais realizando o treinamento de força com pesos atrelados à cauda. Figura 8 - Micrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar, com pequeno aumento (A) utilizadas para contagem dos grânulos de NP (setas), e com grande aumento (B), utilizadas para medida do diâmetro dos grânulos de ANP (setas amarelas) e BNP (setas vermelhas). N- Núcleo, M-mitocôndrias. Figiura 9 - Fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio direito dos 4 grupos estudados, mostrando os grânulos de NPs (setas) dispersos no citoplasma, entre miofibrilas (m) e mitocôndrias (M) e próximos ao núcleo (N) do cardiomiócito. A- Grupo Controle; B-Grupo Aeróbio; C-Grupo Resitido; D-Grupo Aeróbio-Resistido. Em A pode ser visto um capilar (C) contendo uma hemácia.

6 6 Figura 10 - Fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio direito dos 4 grupos estudados, mostrando os grânulos de NPs (setas) no citoplasma do cardiomiócito. A-Grupo Controle; B-Grupo Aeróbio; C-Grupo Resitido; D-Grupo Aeróbio-Resistido. m-miofibrilas; M-mitocondrias. N-núcleo do cardiomiócito. Figura 11 - Fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio direito dos 4 grupos estudados, mostrando os grânulos de NPs (setas) no citoplasma do cardiomiócito. A-Grupo Controle; B-Grupo Aeróbio; C-Grupo Resitido; D-Grupo Aeróbio-Resistido. m-miofibrilas; M-mitocondrias. N-núcleo do cardiomiócito. Figura 12 - Gráficos representativos do número por área e diâmetro dos grânulos de ANP no átrio direito, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Figura 14 - Gráfico representativo do número de poros/10 µm de membrana no átrio direito, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Figura 15 - Histogramas de Distribuição de Frequências (%) do ANP e BNP no átrio direito. Figura 16 Gráficos representativos do número por área e diâmetro de grânulos de ANP no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Figura 17 - Gráfico representativo do número por área e diâmetro de grânulos de BNP no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Figura 18 - Gráfico representativo do número de poros/10 µm de membrana nuclear no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Figura 19 - Histogramas de Distribuição de Frequências (%) do ANP e BNP no átrio esquerdo. Figura 20 Comparação do número de grânulos de ANP e BNP por área entre átrio direito e átrio esquerdo. Figura 21 Comparação do diâmetro de grânulos de ANP e BNP por área entre átrio Direito e Átrio Esquerdo.

7 7 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PA...Pressão Arterial ANP...Peptideo Natriurético Atrial BNP...Peptideo Natriurético Cerebral HAS...Hipertensão Arterial Sistêmica PAS...Pressão Arterial Sistólica PAD...Pressão Arterial Diastólica N...Núcleo M...Mitocôndrias ER...Retículo Endoplasmático G...Aparelho de Golgi m...miofibrilas HPE...Hipotensão pós exercício ICB...Instituto de Ciências Biomédicas USP...Universidade de São Paulo GC...Grupo Controle GA...Grupo Treinamento Aeróbio Agudo GR...Grupo Treinamento Resistido Agudo GAR...Grupo Combinado (Aeróbio-Resistido) Agudo mm 3...Milimetros Cúbicos NP...Peptideos Natriuréticos SEM...Média erro padrão da média ANOVA...Teste de análise de variâncias múltiplas

8 8 RESUMO EFEITOS DO TREINAMENTO AERÓBIO, RESISTIDO OU COMBINADO AERÓBIO-RESISTIDO AGUDOS NOS PEPTÍDEOS NATRIURÉTICOS DOS ÁTRIOS DIREITO E ESQUERDO DE RATO WISTAR Autor: Eduardo Victor Pianca Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza Programa de doutorado strictu sensu em Educação Física Universidade São Judas Tadeu RESUMO O objetivo do presente trabalho foi comparar os efeitos dos treinamentos aeróbio, resistido e combinado agudos nos grânulos de ANP e BNP dos cardiomiócitos dos átrios direito e esquerdo em ratos Wistar. Foram utilizados 28 animais, com 3 meses de vida, distribuídos em quatro grupos, com 7 animais em cada grupo: grupo controle (GC), grupo treinamento aeróbio agudo (GA), grupo treinamento resistido agudo (GR) e grupo treinamento aeróbioresistido agudo (GAR). Os átrios foram retirados e reduzidos a fragmentos, que foram submetidos a técnicas apropriadas para observação à microscopia eletrônica de transmissão. Foram analisados os aspectos morfológicos e quantitativos em fotomicrografias com ampliação final de x15000, (número de grânulos de NPs por campo e os diâmetros dos grânulos de NPs e a densidade de poros da membrana nuclear. Os dados obtidos foram comparados estatisticamente (nível de significância de p <0,05). Resultados no átrio direito: 1 A análise quantitativa sugere uma diminuição do número de grânulos de ANP e BNP, nos grupos GA, GR e GAR em relação ao grupo GC; 2 - Houve uma diminuição significativa na densidade dos grânulos de ANP, de 28% no grupo GA (p<0,05), de 70%, no grupo GR (p<0,05) e de 52% no grupo GAR, quando comparados com o grupo GC; 3- Houve uma diminuição significante no número de grânulos de BNP, de 54% no GR em relação ao GC (p < 0.05); 4 - O grupo GR mostrou uma diferença significante de 7% no diâmetro dos grânulos de ANP em relação ao GC (p<0,05); Resultados no átrio esquerdo: 1 - Houve uma diminuição significante (p<0,05) na densidade dos grânulos de ANP, de 37% no grupo GA, de 43%, no grupo GR, e de 49% no grupo GAR, quando comparados com o grupo GC; 2 - O diâmetro dos grânulos de ANP, sofreu diminuição significante de 10% no

9 9 GA em relação ao GC (p<0,05), de 13% no GR em relação ao GC (p<0,05) e de 15 % no GAR; 3 - Em relação a densidade de grânulos de BNP, verifica-se diminuição de 34% do GA em relação ao GC, diminuição de 43% do GR em relação ao GC e diminuição de 48% do GAR em relação ao GC; 4 - Quanto ao diâmetro dos grânulos de BNP, observa-se um aumento de 5% de GA em relação ao GC e uma diminuição de 12% de GR em relação ao GC e de 15% no GAR em relação ao GC. Observou-se também uma diferença significante de 7% no GR em comparação ao GA. Conclusão: Comparando os efeitos dos tipos de treinamento nos grânulos de ANP e BNP, observa-se que promoveram diminuição no número de grânulos nos cardiomiócitos atriais, tanto no direito quanto no esquerdo. A maior diminuição foi verificada nos grupos que realizaram treinamento resistido em relação aos treinamentos aeróbio e combinado. Os resultados podem servir de base para aplicações práticas destes tipos de treinamento, em medicina do esporte e em programas de reabilitação de pacientes. Palavras chave: ANP, BNP, Treinamento de Endurance, Treinamento de Força.

10 10 ABSTRACT EFFECTS OF AEROBIC TRAINING, RESISTANCE TRAINING OR COMBINED AEROBIC-RESISTANCE TRAINING ON THE CARDIOMIOCYTES FROM THE RIGHT AND LEFT ATRIA OF WISTAR RAT Autor: Eduardo Victor Pianca Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza Programa de doutorado strictu sensu em Educação Física Universidade São Judas Tadeu ABSTRACT The purpose of this study was to compare the effects of aerobic training, morphometric resisted and combined treble beads of ANP and BNP of cardiomiocytes of the right and left Atria in Wistar rats. 28 animals were used, with 3 months of life, distributed in four groups, with 7 animals in each group: control group (GC), acute aerobic training group (GA), group resisted sharp training (GR) and aerobic training group endured sharp (GAR). The right and left Atria were removed and reduced to approximately 3 mm ³ fragments. Were analyzed the electronic morphological and quantitative aspects with a final increase of x15000, were obtained the diameters of granules of NPs and the nuclear membrane pore desnsity. The data obtained were compared statistically with a significance level of Results in the right atrium: 1 quantitative analysis suggests a reduction in the number of granules of ANP and BNP, in GA, GR and GAR relative to the GC group; 2-there was a significant decrease in density of beads of ANP, 28% in Group GA (p < 0.05), from 70% in Group g (p < 0.05) and 52% in the GAR group when compared to the GC group; 3-there was a significant decrease in the number of granules of BNP, 54% in GR with respect to GC (p < 0.05); 4-the GR group showed a statistically significant difference of 7% in diameter of granules of ANP with respect to GC (p < 0.05). Results in the left atrium: 1-there was a significant decrease (p < 0.05) in the density of ANP, beads of 37% in Group GA, 43%, in Group G, and 49% in the GAR group when compared to the GC group; 2-the diameter of the beads of ANP, suffered significant decrease of 10% in the GA regarding the GC (p < 0.05), from 13% in GR with respect to GC (p < 0.05) and 15% in the GAR; 3-about the density of granules of BNP, 34% decrease of the GA regarding the GC, decreased 43% of GR in relation to GC and decrease of 48% of the OHR in relation to the GC; 4-as for the diameter of the beads of BNP, an increase of 5% of GA compared to GC and a decrease of 12% of GR in relation to GC and 15% in the GAR in relation to the GC. There was also a

11 11 significant difference of 7% in GR compared to GA. Conclusion: comparing the effects of the types of training in the granules of ANP and BNP, we observed that all types of training promoted decrease in number of granules in atrial cardiomiocytes, as much right as the left, and the largest decrease was checked in the groups who performed resistance training in relation to other types of training. The results can serve as a basis for practical applications in sports medicine and rehabilitation programs for patients. Keywords: ANP, BNP, Endurance Training, strength training, mus muris.

12 12 Sumário 1-INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Introdução Controle Agudo da PA Participação do ANP e BNP no controle da PA Efeitos do Treinamento Físico Efeitos do treinamento físico na PA Efeitos de diferentes tipos de treinamento físico na produção e secreção de ANP e BNP Efeitos do treinamento físico nos níveis de ANP dos átrios Efeitos do treinamento físico nos níveis de BNP dos átrios OBJETIVOS Geral Específicos Justificativa MATERIAL E MÉTODOS Amostra Treinamento Resistido Treinamento aeróbio Treinamento combinado Preparação do material e exame à Microscopia Eletrônica de Transmissão Morfometria Ultraestrutural Análise estatística RESULTADOS Densidade (número por área) e diâmetro dos Grânulos de ANP Densidade (número por Área) e diâmetro dos Grânulos de BNP... 42

13 Número de Poros/10 µm de membrana Histogramas de Distribuição de Frequências (%) do ANP e BNP no Átrio Direito Densidade (número por Área) e diâmetro de Grânulos de ANP Densidade (número por Área) e diâmetro de Grânulos de BNP Número de Poros/10 µm de membana Histogramas de Distribuição de Frequencias do ANP e BNP No Átrio Esquerdo Grânulos de ANP e BNP por área. Comparação Átrio Direito com Átrio Esquerdo Densidade (número por Área) e diâmetro de Grânulos de ANP e BNP. Comparação Átrio Direito com Átrio Esquerdo DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 57

14 14 1-INTRODUÇÃO A manutenção da Pressão Arterial (PA) em níveis próximos da normalidade é fundamental para a manutenção da saúde (VASAN et al, 2001; LUNA, 2002). Para tanto, é importante conhecer os mecanismos envolvidos no controle da PA e os diferentes fatores que os influenciam (POLITO & FARINATTI, 2003). São numerosos os mecanismos que regulam a PA. Dentre eles, podemos destacar aqueles relacionados à predisposição genética, aos sistemas cardiovascular (POLITO & FARINATTI, 2003; SILVERTHORN, 2003), nervoso, endócrino (CAMPAGNOLE-SANTOS & HAIBARA, 2001), renal e às glândulas supra renais (POLLOK & WILMORE1993). Além disso, é importante ressaltar um outro fator de controle da PA, que é o sistema dos peptídeos natriuréticos atrial (ANP) e cerebral (BNP). Estes peptídeos são produzidos principalmente nos cardiomiócitos atriais e, devido a sua ação vasodilatadora no sistema renal, sempre que houver aumento da PA, agem como fator hipotensor no intuito de manter a PA em níveis normais (OHBA et al., 2001; MCBRIDE et al., 2005). Dentre os fatores fisiológicos que promovem aumento da PA, destacamos o treinamento físico, seja aeróbio, resistido ou combinado aeróbio-resistido, nos quais ocorre aumento da PA sistólica e diminuição ou manutenção da PA diastólica (BRUM et al, 2004). Estudos mostram que, durante estes diferentes tipos de treinamento físico os níveis de ANP e BNP aumentam no plasma (BARLETTA et al., 1998; OHBA et al., 2001). Vários exemplos ilustram estas afirmações. Em corredores de elite e em atletas jovens, participantes de maratona, observou-se aumento significativo dos níveis de ANP no plasma (OHBA et al.,2001). Em outro estudo, os níveis de ANP aumentaram no plasma em cerca de 236% durante o treinamento em bicicleta e 77% com treinamentos de preensão palmar (BARLETTA, et al., 1998). Como se pode depreender das afirmações apresentadas, as respostas dos cardiomiócitos atriais ao treinamento físico parece depender do tipo de treinamento, visto que cada tipo influencia a PA de forma diferente, através de

15 15 estímulos diferentes, promovendo efeitos diversos nos cardiomiócitos atriais. Em corredores de longa distância (treinamento aeróbio), ocorre elevação do débito cardiaco e da freqüência cardíaca, com aumento relativamente discreto da PA. Por outro lado, em treinamentos resistidos, como em levantadores de peso, a elevação do débito cardíaco é pequena mas com acentuada elevação da PA (FORJAZ, 2003). Apesar destes conhecimentos, os efeitos das diferentes modalidades de treinamento físico agudo nos níveis de ANP e BNP nos cardiomiócitos dos átrios direito e esquerdo não foram ainda demonstrados. Assim sendo, neste trabalho, procuramos avaliar os efeitos de três diferentes modalidades de treinamento físico agudo nos níveis de ANP e BNP dos átrios direito e esquerdo, utilizando como modelo experimental o rato Wistar.

16 16 2-REVISÃO DA LITERATURA 2.1-Introdução O controle da PA é um dos fatores importantes nos mecanismos de manutenção da saúde (PEDERSEN ET al., 2003). Um dos principais problemas de saúde pública no Brasil e no mundo é a Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS). Ela se constitui em um fator de risco que precede o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, cerebrovasculares e renais, sendo responsável por pelo menos 40% das mortes por acidente vascular encefálico e por 25% das mortes por doença arterial coronariana. A prevalência de HAS na população urbana adulta brasileira varia de 22,3% a 43,9%, quando se adota como critério atual de diagnóstico de hipertensão arterial o valor da PA de 140/90 mmhg. O conhecimento dos fatores envolvidos no controle da PA é de fundamental relevância para a redução das suas complicações e morbidades associadas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). É fundamental que os profissionais de saúde conheçam as estratégias de controle da hipertensão arterial e os numerosos fatores envolvidos no seu desenvolvimento quer para a definição do diagnóstico clínico, quer para a conduta terapêutica ou também para informar e educar o paciente hipertenso, a fim de persuadi-lo a seguir o tratamento proposto (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Neste contexto, a atividade física é uma ferramenta importante para atingir tal objetivo, sabendo que um grande contingente de pacientes hipertensos também apresenta outras comorbidades, como diabete, dislipidemia e obesidade, o que traz implicações importantes em termos de gerenciamento das ações terapêuticas necessárias para o controle de um aglomerado de condições crônicas, cujo tratamento exige perseverança, motivação e educação continuada (BRUM, 2004).

17 Controle Agudo da PA Como se sabe, a PA é conceituada como a força exercida pelo sangue na parede das artérias e pode sofrer modificações em seus valores, tanto para mais como para menos. Vários são os fatores que podem alterar a PA, produzindo hipertensão. Dentre estes, podemos citar alterações renais e das glândulas adrenais (POLLOK,1993). Porém, alimentação com altos teores de gordura, sal, cigarro e bebidas alcoólicas são fatores que também estão associados aos mecanismos promotores de hipertensão (POLLOK, 1993). Entretanto, é a predisposição genética, sem dúvida, o fator fundamental, na maioria dos casos, da presença de distúrbios na PA. Prova disso é que estudos mostraram que, em famílias de hipertensos, ocorre a tendência ao desenvolvimento da hipertensão, em até 75% (FOLLAND, 2008). Em relação à PA, considera-se a pressão arterial sistólica (PAS) e a pressão arterial diastólica (PAD). A PAS está associada à sístole ventricular, representando a maior pressão que se exerce na parede das artérias durante o ciclo cardíaco. A PAD representa o estado fisiológico das artérias e significa a menor pressão exercida pelo sangue sobre a parede destes vasos (POLITO & FARINATTI, 2003). Como é de conhecimento geral, a PA deve ser mantida dentro de níveis aceitáveis, para evitar problemas na manutenção da homeostase. A manutenção da PA, em valores normais, envolve ações integradas dos sistemas cardiovascular, renal, nervoso e endócrino. Estes sistemas interferem no controle da PA, tanto através de mecanismos de curto, como de longo prazo (controle agudo e controle crônico da PA) (GUYENET, 2006; MULLINS et al., 2006). O principal mecanismo de controle da PA de curto prazo, tal como ocorre no treinamento agudo, objeto do presente trabalho, é representado pela atividade dos barorreceptores arteriais aórtico e carotídeo os quais dão origem a impulsos aferentes determinados pelo estiramento dos seios carotídeos e aórticos (CAMPAGNOLE-SANTOS & HAIBARA, 2001). Estes impulsos são levados até o bulbo, de onde partem fibras eferentes simpáticas e

18 18 parassimpáticas, que atuam sobre a parede das artérias, dilatando-as e mantendo assim a PA dentro de parâmetros normais, sendo este, conhecido como um sistema de controle de alto ganho (CAMPAGNOLE-SANTOS & HAIBARA, 2001). Os barorreceptores são considerados como mecanorreceptores, pois são sensíveis às alterações de pressão por possuírem, em seu interior, canais iônicos dependentes de estiramento. O aumento da PA leva ao estiramento das membranas dos barorreceptores, elevando a quantidade de disparos de potenciais de ação para o centro de controle cardiovascular no bulbo, como explicado anteriormente (CAMPAGNOLE-SANTOS & HAIBARA, 2001). Inversamente, quando há uma diminuição da PA, os barorreceptores diminuem a taxa de disparo de potenciais de ação, devido à redução do estiramento de suas membranas (SILVERTHORN, 2012). 2.3-Participação do ANP e BNP no controle da PA Os grânulos de ANP contêm um material eletrondenso envolvido por uma membrana evidente separada do conteúdo por um halo vazio de 20 nm junto à face interna da membrana (MIFUNE et al, 1991). São armazenados principalmente nos átrios e em menor quantidade nos ventrículos e rins (MIFUNE et al., 1992). De acordo com estudos realizados, os grânulos atriais de ratos medem de 100 a 250 nanômetros de diâmetro (SKEPPER et al., 1988) (Fig. 1). O ANP é produzido a partir de um pró-hormônio (pró-anp), uma molécula constituída por 26 aminoácidos e sua secreção é realizada pelos cardiomiócitos atriais quando ocorre tensão aumentada na parede dos átrios (BOCCHI et al., 2002). Os grânulos de BNP são menores, não possuem membrana limitante e estão presentes nos cardiomiócitos atriais (Fig. 1), sendo encontrados também em outros órgãos (DE BOLD, 1985). De acordo com Dicstein et al., (2003), o BNP é largamente produzido nos ventrículos cardíacos.

19 19 Figura 1 Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, visto com grande aumento, mostrando grânulos de ANP (setas) e de BNP (cabeças de setas) no citoplasma do cardiomiócito. Os grânulos de ANP possuem um halo em torno de uma massa central ao passo que os de BNP não possuem limite nítido. N- Núcleo do cardiomiocito; M-mitocondrias. Os grânulos dos peptídeos natriurétricos estão localizados principalmente junto ao núcleo do cardiomiócito, próximo a mitocôndrias (Fig. 2) e aparelho de Golgi (Fig. 3) (SAITO et al., 1987). Figura 2 - Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, com pequeno aumento, mostrando numerosos grânulos de peptídeos natriurétricos (setas) no citoplasma. N-Núcleo do cardiomiócito; M-mitocôndrias.

20 20 Figura 3- Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, com maior aumento do que o da Fig. 2, mostrando grânulos de ANP (seta) e de BNP (cabeça de seta) no citoplasma do cardiomiócito. São mostrados também o núcleo do cardiómiocito (N), mitocôndrias (M), o reticulo endoplasmático (ER), o aparelho de Golgi (G) e miofibrilas (m). Segundo Gama et al., (2007), a quantidade de grânulos não é igual nos átrios direito e esquerdo, havendo presença maior de grânulos no átrio direito do que no esquerdo. Stewart et al., (1992) e Schiebinger e Greening (1992), comprovaram as ações do ANP, mostrando que, com a retirada bilateral dos átrios, ocorria a eliminação da liberação do ANP com bloqueio da excreção de água e sódio pelo rim e retenção de líquidos corporais, devido ao aumento do volume plasmático. Os primeiros trabalhos publicados sobre o ANP foram realizados em cobaias por Bruno Kisch (1956). Posteriormente, verificou-se que estes grânulos continham uma substância química que atuava como fator natriurético, passando-se então a denominá-lo de peptídeo natriurético atrial (PALADE, 1961). A partir da descoberta de DeBold (1985), o qual, ao injetar

21 21 extrato de átrios no peritônio de ratos, observou aumento na diurese, excreção renal de sódio, diminuição da pressão arterial e aumento do hematócrito, numerosos trabalhos têm sido realizados sobre os cardiomiócitos atriais e sobre os grânulos de ANP em várias situações. A produção do ANP e BNP depende da integridade e da estrutura da membrana nuclear do cardiomiócito, visto que, a membrana nuclear de células eucarióticas é fundamental no mecanismo de passagem de substâncias do núcleo para o citoplasma e vice-versa (SOUZA et al., 2014). A participação desta membrana na regulação das funções nucleares, incluindo a transcrição e replicação, para a produção de proteínas no citoplasma é fundamental para a produção de ANP e BNP em diferentes situações de estresse, às quais as células estão submetidas (JULIENNE et al., 2013). O processo de formação de proteínas, como o ANP e BNP, depende da membrana nuclear para a saída do RNAm do núcleo para o citoplasma (SOUZA et al., 2014). Normalmente, o transporte do RNAm ocorre através de uma proteína denominada Ran guanosina trifosfato (Ran GTPase), responsável pela regulação de processos como a síntese dos poros da membrana nuclear (BIRD et al., 2013) (Fig. 4). Figura 4 Estrutura molecular do Ran, proteína responsável pelo transporte do RNAm para regulação da produção de ANP no citoplasma.

22 22 Os peptídeos natriuréticos (ANP e BNP) tem um papel homeostático importante na hemodinâmica cardiocirculatória através de sua ação sobre a função renal e o metabolismo lipídico. Recentemente, mostrou-se que estes peptídeos possuem ainda outras funções além daquela relacionada ao mecanismo de controle da PA, como por exemplo, promover aumento da força de propulsão cardíaca e consequentemente do débito cardíaco (FENZL et al., 2013). A dilatação atrial, devida por exemplo, à sobrecarga de pressão, desencadeia a eliminação dos pepitídeos para a corrente sanguínea, promovendo os efeitos agudos dos peptídeos natriurétricos, entre os quais aumento do ritmo de filtração glomerular e da excreção renal de Na+ e água, através da inibição da bomba de Na+-K+-ATPase e dos canais de sódio epiteliais (ENaC), bem como supressão da secreção de renina e de aldosterona. Esse último efeito é um exemplo da participação dos hormônios peptídicos na interação coração-rim. Além disso, o ANP e o BNP produzem vasodilatação sistêmica e renal, aumento da permeabilidade vascular, efeitos antiinflamatórios, antiproliferativos e antifibróticos (CAO e GARDNER, 1995; OLIVER et al., 1997; TAMURA et al., 2000; KNOWLES et al, 2001; SILVER, 2006; WOODARD e ROSADO, 2007). A liberação do ANP ocorre por duas formas: 1- Através do encurtamento da musculatura dos átrios (CHO et al., 1991) e 2- Pelo aumento da volemia, a qual promove a dilatação das paredes das cavidades atriais (SKEPPER et al., 1989). Estes mecanismos sinalizam para os cardiomiócitos a necessidade de eliminação dos peptídeos para a circulação sanguínea. A liberação de ANP sofre também a influência de outros hormônios. Schiebinger e Greening (1992), mostraram que a norepinefrina, a endotelina e a vasopressina atuam como mediadores responsáveis pela liberação do ANP na corrente sanguínea. O ANP vem sendo utilizado também como medicamento em pacientes com intercorrências cardíacas (MCGRATH et al., 2005). MAISEL et al., (2001) observaram em pacientes internados com hipertensão arterial, que o uso de ANP intravenoso reduzia a pressão sanguínea sistólica, a pré-carga e a póscarga e melhorava o desempenho do ventrículo esquerdo. Outro estudo

23 23 mostrou a comparação do efeito do ANP associado à nitroglicerina na remodelação do miocárdio do ventrículo esquerdo em pacientes com infarto agudo do miocárdio (MAISEL et al., 2001). Os pacientes que receberam ANP apresentaram melhora na remodelação do miocárdio do ventrículo esquerdo. Pesquisadores testaram a ação do ANP em pacientes com Insuficiência Cardiaca Congestiva e Fibrilação Atrial. Após 48 horas do evento, a infusão intravenosa de ANP, melhorou: a fibrilação atrial, a resistência vascular periférica, a pressão arterial sistólica, além de promover decréscimo significativo na resistência vascular pulmonar; acréscimo na diurese e sódio e decréscimo significativo de creatinina no sangue com melhora da hemodinâmica circulatória (MAISEL et al., 2001; MCGRATH et al., 2005). Em outro estudo, foi demonstrado que a infusão intravenosa de ANP promoveu melhora significativa na hemodinâmica de pacientes renais crônicos, nas primeiras 48 horas após a infusão, aumento da filtração glomerular e do fluxo renal, diminuição da resistência vascular renal com aumento na fração de filtração. As variações de PA que ocorrem durante o dia são controladas pela liberação de ANP e BNP na circulação, mas com a manutenção dos níveis destes peptídeos nos átrios (SWARD et al., 2001). Estes mesmos autores, sugerem que, como o BNP apresenta vida curta de apenas 22 minutos, seja utilizado como mecanismo de emergência em resposta a situações que promovem sobrecarga ventricular, como por exemplo, o aumento da PA. 2.4-Efeitos do Treinamento Físico É sabido que o sedentarismo tem efeitos altamente negativos para a estrutura e função dos diferentes tecidos corporais. Vários estudos têm demonstrado que uma baixa atividade física relaciona-se com altas taxas de mortalidade e estima-se que mortes por ano nos Estados Unidos poderiam ser evitadas pela prática de treinamento físico regular (PATE et al., 1995 e RUSSEL et al., 1995, KELLEY et al., 2002). Ao contrário, o treinamento físico regular de moderada intensidade é atualmente reconhecido como um

24 24 importante fator promotor de saúde (RUSSEL et al.,1995 e KELLEY et al., 2002). As populações fisicamente ativas têm menor incidência de doenças crônicas, tais como a HAS, obesidade, diabetes tipo II, dislipidemia, osteoporose, sarcopenia, ansiedade e depressão, com diminuição da ocorrência de aterosclerose e suas conseqüências: doença coronariana, doença cérebro-vascular e doença vascular periférica (DE ANGELIS et al., 1997, DE ANGELIS et al.,1999 e PEDERSEN et al., 2003). O treinamento físico traz benefícios à saúde, mantendo independência funcional e melhorando a qualidade de vida dos praticantes (GRIMBY, 1995). Os benefícios do treinamento físico são detectados quando iniciada em qualquer fase da vida independentemente do grau de sedentarismo do indivíduo (KELLEY et al., 2002). Entretanto, para que os efeitos do treinamento físico permaneçam, sua prática deve tornar-se parte da rotina diária. Sendo assim, a adoção de prática de treinamento físico regular favorece um estilo de vida saudável e é uma estratégia fundamental para a prevenção e o tratamento de diferentes morbidades, especialmente da HAS, seja como alternativa não medicamentosa, seja concomitante à utilização de diferentes tipos de fármacos (FARINATTI, 2006). 2.5-Efeitos do treinamento físico na PA Além dos benefícios do treinamento físico para os tecidos em geral, vários estudos mostram sua atuação na redução da pressão arterial (PA) de repouso em longo prazo. Outros estudos evidenciam que mesmo uma sessão isolada de treinamento é capaz de reduzir a PA pós-esforço a valores abaixo dos obtidos no período pré-exercício, no fenômeno denominado hipotensão pós-exercício (HPE) (BRUM et al.,2004). De acordo com o tipo de metabolismo energético gasto na atividade física, classificamos os tipos de treinamento em aeróbio ou anaeróbio. Treinamento anaeróbico é qualquer treinamento físico que trabalhe diversos

25 25 grupos musculares durante um determinado e constante período de tempo, de forma contínua e ritmada (PIMENTA et al., 2009). Segundo Negrão et al., (2006), o treinamento aeróbio promove um estresse fisiológico para o organismo, em função do grande aumento da demanda energética em relação ao repouso, o que provoca grande liberação de calor e intensa modificação do ambiente químico muscular e sistêmico, inclusive com aumento da PA. No treinamento resistido, o coração adquire uma forma concêntrica de hipertrofia não patológica, na qual ocorre aumento da espessura da parede ventricular, sem alterações no tamanho da cavidade ventricular, tanto em humanos como em animais (VITARTAITE et al., 2004; PIMENTA et al., 2009). O treinamento aeróbio, por sua vez, induz o miocárdio ventricular a uma forma de hipertrofia não patológica, caracterizada por aumento da cavidade e da massa ventricular, seja em humanos ou em animais (VITARTAITE et al., 2004). Alguns exemplos de atividades que caracterizam treinamento anaeróbico incluem: salto, musculação, provas de velocidade (sejam elas a pé, em piscinas ou de bicicleta), flexões abdominais, agachamentos, levantamento de peso, ginástica olímpica, ou seja, qualquer atividade que seja feita com movimentos rápidos e de alta intensidade. São exemplos de treinamento aeróbio: caminhar, correr, andar, pedalar, nadar, dançar. Ambos os tipos de treinamento utilizam vários grupos musculares ao mesmo tempo e a duração dos movimentos influencia mais do que a velocidade para caracterizar se a atividade é suave, moderada ou exaustiva (ARAÚJO et al., 2013). Como já exposto, o treinamento físico de intensidade moderada protege o sistema cardiovascular, inclusive prevenindo a HAS (GUS et al., 2002). O treinamento predominantemente aeróbio envolve atividade de baixa intensidade e longa duração e o treinamento predominantemente anaeróbio envolve atividade de alta intensidade e curta duração (Sociedade Brasileira de Cardiologia, III Diretriz, 2014). Durante o treinamento aeróbio, a PAS tende à elevação e a PAD tende à manutenção ou até redução de seus valores. Este comportamento da PA pode

26 26 ser explicado pela ação das contrações musculares e consequentes movimentações articulares, que obstruem o fluxo sanguíneo nos vasos, com aumento da resistência vascular periférica, levando ao aumento da força de contração cardíaca. Observa-se também, neste tipo de treinamento, aumento da atividade nervosa simpática, ativada pelos mecanorreceptores musculares (BRUM, 2004). Assim, observamos um aumento da PAS devido a necessidade de oxigênio e outros nutrientes para a musculatura e a manutenção ou redução da PAD, devido à queda da resistência vascular periférica (MONTEIRO & SOBRAL FILHO, 2004). 2.6-Efeitos de diferentes tipos de treinamento físico na produção e secreção de ANP e BNP Trabalhos realizados mostram que as concentrações sanguíneas dos hormônios ANP e BNP aumentam durante o treinamento físico (SOUZA et al., 2015), sendo que, ao atingir a intensidade máxima do treinamento, os níveis sanguíneos desses hormônios alcançam valores duas a três vezes maiores do que no repouso (SOUZA et al., 2015). Não há trabalhos, porém, mostrando os efeitos agudos de diferentes tipos de treinamento físico na produção e secreção de ANP e BNP dos cardiomiócitos atriais. Os modelos experimentais têm sido utilizados por numerosos investigadores para avaliar os efeitos de diferentes tipos de treinamento na produção e secreção de ANP e BNP dos átrios direito e esquerdo e muitas informações valiosas tem surgido destes estudos (TANAKA et al., 1986; GUEZENNEC et al., 1989; BARLETTA et al., 1998; OHBA et al., 2001; EDWARDS 2002; CHIEN et al., 2008). O objetivo do presente estudo foi ampliar os achados prévios em vários aspectos importantes. Primeiro, o ANP e o BNP são dois tipos de hormônios produzidos pelos cardiomiócitos dos átrios direito e esquerdo, que ficam armazenados sob a forma de grânulos no citoplasma dos cardiomiócitos. Os grânulos foram denominados pelos autores de acordo com seu conteúdo e eletrodensidade em grânulos dos tipos A (os de ANP) e B (os de BNP).

27 27 Durante o treinamento agudo aeróbio ou no resistido, ocorre aumento diferenciado da PA (BRUM, 2004) e ambos os peptídeos tem uma relação direta com os níveis da PA (SILVER et al., 2006). Não há, porém, informações sobre comparação quantitativa de ANP e BNP liberados dos átrios, quando os ratos são submetidos a cada um desses tipos de treinamento (aeróbio, resistido ou combinado). No presente estudo, os efeitos do treinamento aeróbio, resistido e combinado nos níveis de ANP e BNP do átrio direito foram obtidos através da comparação de três grupos de animais: os que realizaram treinamento aeróbio por uma hora, animais que realizaram treinamento resistido por uma hora e animais que realizaram treinamento combinado também por uma hora, com um grupo controle. Segundo, as possíveis diferenças de efeitos do treinamento aeróbio, resistido e combinado nos níveis de ANP e BNP do átrio esquerdo foram obtidas através de procedimentos idênticos aos utilizados para o átrio direito. As pressões desenvolvidas nos átrios direito e esquerdo durante a realização de diferentes tipos de treinamento aumentam em relação às pressões do repouso (cerca de 4 a 13 mmhg) (GROSSMAN, 2006). Assim, por exemplo, segundo Caromano et al., (2003), a pressão no átrio direito durante imersão na água aumenta de 14,0 mmhg para 18,0 mmhg. Entretanto, estudos comparando a quantidade de ANP e BNP liberados pelos átrios, em cada um destes tipos de treinamentos agudos, não foram ainda realizados (Fig.5).

28 28 Figura 5 - A onda em azul representa a contração atrial. Pode-se observar que a pressão atrial direita (c) aumenta em cerca de 4 a 6 mmhg durante a contração atrial, enquanto que a pressão atrial esquerda (v) aumenta cerca de 7 a 8 mmhg. Normalmente, o sangue é bombeado de forma contínua das veias cavas e pulmonares para os átrios e cerca de 75% do sangue flui dos átrios para os ventrículos, antes mesmo da contração atrial. Assim sendo, a contração atrial contribui apenas com 25% para enchimento dos ventrículos (SOUZA et al. 2006). 2.7-Efeitos do treinamento físico nos níveis de ANP dos átrios Para que ocorra a diminuição da PA, ao cessar o treinamento aeróbio, ocorre uma queda na resistência vascular periférica e total e/ou parcial diminuição do débito cardíaco (BRUM et al,2004). A diminuição do débito cardíaco está associada à redução do seu volume sistólico (FORJAZ et al, 2006). Outros fatores, como a diminuição da atividade da renina plasmática em consequência do aumento da excreção de sódio na urina, também são

29 29 explicações para a diminuição da PA após exercício físico aeróbio (FORJAZ et al., 2006). Para manter a homeostase durante o treinamento físico, vários mecanismos morfofisiológicos são colocados em ação, inclusive a participação do ANP e BNP. Assim, por exemplo, em maratonistas, foi observado aumento significativo dos níveis de ANP plasmático (OHBA et al., 2001). Em ciclistas, observou-se um aumento do ANP no plasma de 236% durante o exercício e um aumento de 77% em pessoas que realizaram exercícios de hand-grip (BARLETTA et al., 1998). O tipo de treinamento, aeróbio ou resistido, determina o modo pelo qual o músculo cardíaco responde. Assim, maratonistas realizam extensos períodos de treinamento moderado, com pouca elevação do débito cardíaco e da frequência cardíaca, com aumento discreto na PA. Os halterofilistas, por sua vez, realizam períodos curtos de treinamento extremamente intenso, com discreta elevação do débito cardíaco, porém com acentuada elevação da PA (NEGRÃO et AL, 2006). É conhecido que o átrio direito é a fonte mais importante na produção de ANP (SOUZA et al., 2005). Entretanto, não se conhece a influência dos treinamentos aeróbio, anaeróbio e combinado aeróbio-anaeróbio na liberação de ANP e BNP do átrio direito, comparado com o átrio esquerdo. Geralmente, as pessoas realizam treinamentos moderados durante 30 minutos, na maior parte dos dias da semana (NEGRÃO et al., 2006). Este tipo de treinamento, quando realizado regularmente, é eficaz na diminuição da pressão arterial em hipertensos, devido à diminuição da atividade simpática e do tônus simpático cardíaco (ZANESCO, 2007). Não se conhece, porém, a participação dos peptídeos natriurétricos neste mecanismo. De qualquer forma, o treinamento promove diminuição da freqüência cardíaca e conseqüente queda do débito cardíaco (SULLIVAN, 2000). Além disso, estudos experimentais têm mostrado a capacidade do treinamento em melhorar a sensibilidade dos presso-receptores em animais normotensos e espontaneamente hipertensos, favorecendo assim, o controle

30 30 da pressão arterial (BRUM et al., 2004). A renina e a adrenalina também tem participação nestes mecanismos. Trabalhos mostram que pacientes com aumento da renina circulante tendem a ter menor resposta hipotensora ao treinamento, enquanto aqueles com maiores níveis de noradrenalina apresentaram melhora significativa nesse proceso (SULLIVAN et al., 2000). 2.8-Efeitos do treinamento físico nos níveis de BNP dos átrios O peptídeo natriurético cerebral (BNP), descoberto mais recentemente no cérebro de macacos, é liberado em humanos, principalmente pelos átrios e ventrículos cardíacos (OHBA et al., 2001; De Souza et al., 2014). Esta liberação, tal como para o ANP, está relacionada a uma sobrecarga de pressão ou volume sanguíneo no sistema cardiovascular. O BNP, tal como o ANP, também promove vasodilatação e aumento da diurese renal (SILVERTHORN, 2012). Estudos recentes sugerem que este hormônio seja utilizado em emergência cardíaca, em resposta a uma sobrecarga ventricular. Assim, na vigência de aumento agudo da PA, haverá liberação do BNP na corrente sanguínea e conseqüente ação nos túbulos renais, com aumento da diurese (SILVERTHORN, 2012).

31 31 3-OBJETIVOS 3.1-Geral Comparar os efeitos morfométricos dos treinamentos aeróbio, resistido e combinado agudos nos grânulos de ANP e BNP dos cardiomiócitos dos átrios direito e esquerdo em ratos Wistar. 3.2-Específicos Os objetivos específicos deste trabalho são conhecer: 1 - Qual átrio libera mais ANP durante cada tipo de treinamento agudo, resistido, aeróbio ou combinado; 2 - Qual átrio libera mais BNP nesses tipos de treinamento; 3 - Quais grânulos de ANP (pequenos, médios e grandes) são mais liberados do átrio direito nesses tipos de treinamentos; 4 - Quais grânulos de ANP (pequenos (P), médios (M) e grandes(g)) são mais liberados do átrio esquerdo nesses tipos de treinamentos; 5- Que grânulos de BNP (P, M ou G) são mais liberados do átrio direito nesses tipos de treinamentos; 6- Quais grânulos de BNP (P, M ou G)) são mais liberados do átrio esquerdo nesses tipos de treinamentos. 3.3-Justificativa Embora muito se conheça sobre os efeitos de diferentes modalidades de treinamento físico em parâmetros quantitativos de ANP e BNP dos cardiomiócitos, ainda não são conhecidos os efeitos agudos dos treinamentos aeróbio, resistido ou combinado nos átrios direito e esquerdo em animal de experimentação.

32 32 4-MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostra Para a realização deste trabalho foram utilizados 28 ratos Wistar machos adultos com 3 meses de idade, pesando aproximadamente 230 g. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas (quatro em cada gaiola), em ambiente com temperatura de 23ºC e ciclo claro-escuro invertido, controlado de 12 em 12 horas no biotério do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da Universidade de São Paulo (USP). Os ratos tiveram livre acesso a uma dieta contendo 52% de carboidratos, 21% de proteínas e 4% de lípides (NUVILAB CR1, NUVTAL Nutrientes LTDA, Curitiba, PR) e receberam água ad libitum. O protocolo do projeto de eutanásia dos animais foi submetido e aprovado pela Comissão de Bioética da Universidade de São Paulo (protocolo 2476/2011). Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos quatro diferentes grupos seguintes, com 7 animais em cada grupo: -Grupo Controle (GC); -Grupo Treinamento aeróbio agudo (GA); -Grupo Treinamento resistido agudo (GR); -Grupo Treinamento combinado agudo (aeróbio + resistido) (GAR). Para a análise morfoquantitativa dos dados obtidos, foram coletados os átrios direito e esquerdo de cada grupo, totalizando oito subgrupos, assim determinados: - Controle, átrio direito, - Treinamento aeróbio agudo, átrio direito, - Treinamento resistido agudo, átrio direito, - Treinamento aeróbio + resistido agudo, átrio direito, - Controle, átrio esquerdo,

33 33 - Treinamento aeróbio agudo, átrio esquerdo, -Treinamento resistido, átrio esquerdo, -Treinamento aeróbio + resistido agudo, átrio esquerdo. Figura 6 - Equipamento utilizado para o treinamento resistido. O equipamento é confeccionado em madeira com degraus de ferro. A altura do equipamento é de 110 cm com inclinação de 80º (Hornberger e Farrar, 2004) Treinamento Resistido Inicialmente, foi realizada a distribuição aleatória dos animais nos grupos controle e a serem treinados. A seguir, os ratos dos grupos GA, GR e GAR foram submetidos a um período de adaptação com os equipamentos, durante cinco dias. Os animais dos grupos GR e do GAR foram ensinados a escalar o equipamento, colocando-os no degrau inferior e incitando-os para que subissem a escada. Isso foi feito até que eles aprendessem e, ao serem colocados no primeiro degrau, já subissem sem estímulo. O equipamento utilizado para a execução do treinamento resistido foi construído conforme descrito por Hornberger e Farrar (2004). Tal equipamento consiste numa escada de madeira medindo 110 cm de altura, com degraus de ferro e

34 34 inclinação de 80 graus (Fig. 6). Os animais escalaram o equipamento com a finalidade de alcançar uma área de descanso no topo. O treinamento dos animais foi realizado durante em uma única seção. Os animais realizaram o treinamento com cargas representadas por pesos de chumbo atrelados à base da cauda por uma fita adesiva, segundo uma adaptação do protocolo de treinamento resistido proposto por Hornberger e Farrar (2004). Cada rato realizou seis escaladas consecutivas, portando uma carga equivalente a 60% do peso corpóreo, o que representa o mesmo índice de carga relativa de treinamento para cada animal (Fig. 7). Figura 7 - Ilustração de um dos animais realizando o treinamento resistido com pesos de chumbo atrelados à cauda.

35 35 Ao final do período de treinamento, todos os animais foram eutanasiados por decapitação. O coração foi imediatamente retirado da cavidade torácica e lavado com solução fisiológica. 4.3-Treinamento aeróbio O treinamento agudo aeróbio consistiu de corrida em esteira por uma hora sem interrupção. Os animais correram na esteira uma única vez com velocidade de 12m/min., durante 60 minutos (MEEUSEN et al., 2006). Os animais foram ensinados a correr na esteira durante 5 dias consecutivos, antes do início do protocolo. Foram colocados na esteira e correram durante 15 minutos nesta fase de aprendizagem. Ao final do período de treinamento, todos os animais foram eutanasiados por decapitação. O coração foi imediatamente retirado da cavidade torácica e lavado com solução fisiológica. 4.4-Treinamento combinado O treinamento combinado agudo consistiu de três escaladas consecutivas com uma carga equivalente a 60% do peso corpóreo. Assim como nos treinamentos aeróbio e resistido, este grupo também realizou adaptação por 5 dias consecutivos. A seguir, os animais correram na esteira uma única vez com velocidade de 12m/min., durante 30 minutos. Ao final do período de treinamento, todos os animais foram eutanasiados por decapitação. O coração foi imediatamente retirado da cavidade torácica e lavado com solução fisiológica. 4.5-Preparação do material e exame à Microscopia Eletrônica de Transmissão Após a eutanásia, os átrios direito e esquerdo foram retirados e reduzidos a fragmentos de aproximadamente 3 mm³. Os fragmentos foram

36 36 colocados em solução fixadora de glutaraldeído a 2,5% em solução tampão fosfato (0,2M, ph 7,3) durante três horas. A seguir, foram lavados três vezes com a mesma solução tampão por 5 minutos cada vez, e colocados subsequentemente em uma solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato durante 2 horas. Os fragmentos permaneceram durante a noite no acetato de uranila a 0,5% e, após serem lavados com o tampão, foram desidratados em série crescente de álcoois e óxido de propileno, durante 8 horas, sob rotação. A seguir, os fragmentos foram incluídos em resina pura durante 5 horas e finalmente deixados na mesma resina a 60ºC durante 5 dias. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, em ultramicrótomo (Sorvall MT-2) e, após serem contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo, foram analisados ao microscópio eletrônico de transmissão (Jeol, ICB, USP). 4.6-Morfometria Ultraestrutural Em fotomicrografias eletrônicas com x de aumento, foi contado o número de grânulos tanto de ANP como de BNP, presentes em um campo previamente delimitado, sem incluir parte do núcleo, em dez micrografias eletrônicas por animal. O campo foi delimitado por 4 linhas constituindo um paralelograma com lados de 5,0 µm por 3,0 µm, totalizando uma área de 15,0 µm² (Fig. 8). Nestas mesmas micrografias, foi medido o diâmetro maior de cada grânulo (Fig. 9). As contagens e medidas foram obtidas usando o programa de análise de imagem computadorizado (Axio Vision, Zeiss). Um total de 280 campos (micrografias) foi analisado, nos quatro grupos de animais. Os valores obtidos foram tabulados e posteriormente utilizados para obtenção das médias e desvios padrões. A seguir, foram calculadas as porcentagens de grânulos pequenos, médios e grandes presentes em cada um dos átrios. O cálculo para obtenção da porcentagem dos grânulos de ANP e de BNP, de acordo com seu tamanho, foi feito como explicado a seguir. Os valores obtidos das medidas dos

37 37 diâmetros dos grânulos foram colocados em planilha do Excel e dispostos em uma coluna do menor para o maior valor. A seguir, subtraiu-se o menor valor do maior e o resultado foi dividido em 3 grupos, de acordo com o valor do diâmetro. Assim, para o grupo controle, para o ANP, o menor valor foi de 16 µm e o maior, 114µm. Subtraindo-se 16 de 114, obtivemos o valor de 98. Dividindo-se 98 por 3 (classes de pequenos, médios e grandes) obtivemos o valor de 32. Assim, os grânulos de tamanho até 32 foram classificados em pequenos; os grânulos de 33 até 65 foram classificados em médios e os acima de 65 foram classificados em grandes. A seguir foram calculadas as porcentagens desses três tipos de grânulos quanto ao tamanho. O total de grânulos neste exemplo (419) corresponde a 100% e o número de grânulos pequenos (ou seja até 32), foi de 41. Assim, a porcentagem de grânulos pequenos correspondeu a 10%. Este procedimento foi utilizado para os demais cálculos semelhantes.

38 38 Figura 8 Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito do átrio direito de ratos Wistar, utilizada para contagem e medida do diâmetro dos grânulos de ANP (setas amarelas) e BNP (setas vermelhas). N- Núcleo, M-mitocôndrias. A densidade numérica de poros por 10 µm de membrana nuclear nos núcleos dos cardiomiócitos foi determinada em 10 micrografias eletrônicas por animal, por grupo (Fig.9). Figura 9- Micrografia eletrônica de corte de cardiomiócito de átrio direito de rato Wistar, mostrando grânulos de ANP e seu diâmetro (setas), de BNP e seu diâmetro (cabeças de seta), mitocôndrias (M), o retículo endoplasmático (ER), o aparelho de Golgi (G), miofibrilas (m) no citoplasma do cardiomiócito e dois poros da membrana nuclear (setas espessas). N-núcleo. 4.7-Análise estatística Todos os resultados quantitativos foram expressos como média erro padrão da média (SEM). Após as contagens e medidas dos grânulos, foram construídas as tabelas e gráficos correspondentes. A análise estatística foi

39 39 realizada através de comparações entre o grupo controle e os grupos que receberam os diferentes tipos de treinamentos. Dado que nossos resultados são paramétricos, para comparações foi aplicado o teste de análise de variâncias múltiplas (ANOVA) e, a seguir, o teste de Tukey. As médias e errospadrões dos grupos foram calculados e comparados estatisticamente. Valores de p<0.05 foram considerados significantes. 5-RESULTADOS Análise morfológica dos cardiomiócitos A análise ultraestrutural dos cardiomiócitos do átrio direito dos grupos estudados sugere uma diminuição do número de grânulos de ANP e BNP em conjunto, nos grupos GA, GR e GAR em relação ao grupo GC (Fig. 10).

40 40 Fig 10 - Fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio direito dos 4 grupos estudados, mostrando os grânulos de NPs (setas) dispersos no citoplasma, entre miofibrilas (m) e mitocôndrias (M) e próximos ao núcleo (N) do cardiomiócito. A-Grupo Controle; B-Grupo Aeróbio; C-Grupo Resitido; D- Grupo Aeróbio-Resistido. Em A pode ser visto um capilar (C) contendo uma hemácia. Micrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio esquerdo com maior aumento, mostram grânulos de variados tamanhos, de ANP e BNP nos 4 grupos estudados (Fig. 11). Fig 11 - Fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos do átrio esquerdo dos 4 grupos estudados, mostrando os grânulos de NPs (setas) no citoplasma do

41 41 cardiomiócito. A-Grupo Controle; B-Grupo Aeróbio; C-Grupo Resitido; D-Grupo Aeróbio-Resistido. m-miofibrilas; M-mitocondrias. N-núcleo do cardiomiócito. Análise quantitativa Os resultados obtidos para os parâmetros estudados serão apresentados primeiramente para o átrio direito e em seguida para o átrio esquerdo. Átrio Direito 5.1-Densidade (número por área) e diâmetro dos Grânulos de ANP Os resultados mostram que o número de grânulos de ANP por área no GC, foi de 16,83±1,5; no GA, de 12±1,2, no GR, de 5±0,5 e no GAR de 8,3 ± 1,3. O diâmetro de grânulos de ANP no GC, foi de 61,9±1,4 nm; no GA, de 64,7±0,8 nm, no GR, de 55,8±1,5 nm e no GAR de 60,3 ± 1,6 nm (Fig.12). Figura 12 - Gráficos representativos do número por área e diâmetro dos grânulos de ANP no átrio direito, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Os resultados mostram uma diminuição significante na densidade dos grânulos de ANP por área, de 28% no grupo GA (p<0,05), de 70%, no grupo GR (p<0,05) e de 52% no grupo GAR (p<0,05), quando comparados com o grupo GC (Fig. 12). Observando o diâmetro dos grânulos de ANP do átrio direito, não verificamos diferença significante entre os grupos (P>0,05).

42 Densidade (número por Área) e diâmetro dos Grânulos de BNP Os resultados mostram que o número de grânulos de BNP por área no GC, foi de 17,41 ± 1,2, no GA, de 13,95 ± 1,4, no GR, de 8,05 ± 0,85 e no GAR de 10 ± 1,8. O diâmetro dos grânulos de BNP no GC, foi de 52,04±0,64 nm, no GA, de 54,68±0,75nm, no GR, de 48,49±0,41nm e no GAR de 53,9 ± 0,6 nm (Fig.13). Figura 13 - Gráficos representativos do número por área e diâmetro de grânulos de BNP no átrio direito, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Observamos que não houve diferença significante no número de grânulos de BNP entre GA e GC (p>0,05). Em contrapartida, houve uma diminuição significante de 54% no GR em relação ao GC (p < 0.05). Não foi

43 43 observada diferença significante entre os grupos GA e GC. O grupo GR mostrou uma diferença significante de 7% em relação ao GA (p<0,05). 5.3-Número de Poros/10 µm de membrana O número de Poros/10 µm de membrana no GC foi de 3,8±0,6, no GA, de 4,5±0,6 no GR, de 5,0±0,41 e no GAR de 3,2±0,39 (Fig. 16). Figura 14 - Gráfico representativo do número de Poros/10 µm de membrana no átrio direito, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Não houve diferença significante no número de Poros/10 µm de membrana nuclear, entre os grupos estudados (p > 0.05) Histogramas de Distribuição de Frequências (%) do ANP e BNP no Átrio Direito

44 44 A Figura 15 representa os histogramas de distribuição de frequências dos grânulos de ANP e BNP do átrio direito, divididos em pequenos, médios e grandes, dos 4 grupos estudados. Figura 15 Histogramas de distribuição de freqüências dos grânulos de ANP e BNP no átrio direito quanto ao seu diâmetro [pequenos (P) médios (M) e grandes (G)] nos Grupos estudados. A figura 15 mostra a distribuição de frequências dos grânulos de ANP e BNP quanto ao seu diâmetro nos 4 grupos estudados. No GC, verificamos que cerca de 10% de grânulos de ANP são pequenos, 70% são médios e 20%, grandes. Em relação ao BNP, observamos neste grupo, 7% de grânulos pequenos, 70% de médios e 23% de grandes (Fig.17). No GA, cerca de 10% dos grânulos de ANP são pequenos, 25% são médios e 65%, grandes. Em relação ao BNP, observamos 9% de grânulos pequenos, 65% de médios e 24% de grandes.

45 45 No GR, quanto ao ANP, verificamos que 25% dos grânulos são pequenos, 59% são médios e 16%, grandes. Em relação ao tamanho dos grânulos de BNP, observamos 20% de grânulos pequenos, 65% de médios e 15% de grandes. No GAR, com relação ao ANP, observamos 16% de grânulos pequenos, 43% de médios e 41% de grandes. Com relação aos tamanhos dos grânulos de BNP, observamos 14% de pequenos, 69% de médios e 17% de grandes. Átrio Esquerdo 5.5-Densidade (número por Área) e diâmetro de Grânulos de ANP Os resultados mostram que o número de grânulos de ANP/área foi de 148,8±1,2, no GC, de 9,43±1,0 no GA, de 8,5±0,9 no GR e de 7.4 ± 0.8 no GAR. O diâmetro dos grânulos de ANP no átrio esquerdo do GC, foi de 72,2±0,75 nm, no GA, de 64,5±0,9 nm, no GR, de 62,6±1,4 nm e no GAR de 60,4 ± 0,80 nm (Fig. 16). Figura 16 - Gráficos representativos do número por área e diâmetro de grânulos de ANP no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR.

46 46 Houve uma diminuição significante (p<0,05) na densidade dos grânulos de ANP de 37% no grupo GA, de 43%, no grupo GR e de 49% no grupo GAR, quando comparados com o grupo GC (Fig. 16). O diâmetro dos grânulos de ANP do átrio esquerdo sofreu diminuição de 10% no GA em relação ao GC (p<0,05), de 13% no GR em relação ao GC (p<0,05) e de 15 % no GAR (Fig.16). 5.6-Densidade (número por Área) e diâmetro de Grânulos de BNP Os resultados mostram que o número de grânulos de BNP/área no átrio esquerdo do GC, foi de 18,32±1,4, no GA, de 11,93±0,8, no GR, de 10,55±1,2 e no GAR de 8,8 ± 0.9. O diâmetro de grânulos de BNP no átrio esquerdo do GC, foi de 52,2±0,54 nm no GA, de 53,75±0,75 nm, no GR, de 49,99±0,54 nm e no GAR e de 47,8±0,53 nm no GAR (Fig.17). Figura 17 - Gráfico representativo do número por área e diâmetro de grânulos de BNP no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR.

47 47 Em relação à densidade de grânulos de BNP, verificamos diminuição de 34% do GA em relação ao GC, diminuição de 43% do GR em relação ao GC e diminuição de 48% do GAR em relação ao GC (Fig.17). Quanto ao diâmetro dos grânulos de BNP, observamos um aumento de 5% de GA em relação ao GC uma diminuição de 12% de GR em relação ao GC e de 15% no GAR em relação ao GC. Observamos também uma diferença significante de 7% no GR, em comparação ao GA (Fig. 17). Ao compararmos os grânulos ANP com BNP, observamos que o exercício promoveu diminuição no número de grânulos, independentemente do tipo de exercício. Observamos uma maior diminuição nos grupos que realizaram exercícios resistidos. 5.7-Número de Poros/10 µm de membana O número de Poros/10 µm de membrana nuclear no GC, foi de 3,0±0,4; no GA, de 3,9 ± 0,7, no GR, de 4,1±1,2 e no GAR de 3,7±1,1 (Fig. 18). Figura 18 - Gráfico representativo do número de Poros/10 µm de membrana nuclear no átrio esquerdo, nos grupos GC, GA, GR e no GAR. Não houve diferença significante no número de poros/10 µm de membrana nuclear, entre os grupos estudados (Fig. 18).

48 Histogramas de Distribuição de Frequências do ANP e BNP No Átrio Esquerdo A figura 19 representa os histogramas de distribuição de freqüências dos grânulos de ANP e BNP do átrio esquerdo, divididos em pequenos, médios e grandes, dos 4 grupos estudados. Figura 19 Histograma de distribuição de freqüências dos grânulos de ANP e BNP quanto ao seu diâmetro [pequenos (P) médios (M) e grandes(g)] no átrio esquerdo do Grupo Controle. No GC verificamos que cerca de 1% de grânulos de ANP são pequenos, 19% são médios e 80% grandes. Em relação ao BNP, observamos 1% de grânulos pequenos, 17% de médios e 78% de grandes. No GA, cerca de 1% dos grânulos de ANP são pequenos, 25% são médios e 74%, grandes. Em relação ao BNP, observamos 1% de grânulos pequenos, 65% de médios e 24% de grandes.

49 49 No GR, quanto ao ANP, verificamos que 8% dos grânulos são pequenos, 81% são médios e 11%, grandes. Em relação ao tamanho dos grânulos de BNP, observamos 11% de grânulos pequenos, 71% de médios e 18% de grandes. No GAR, com relação ao ANP, observamos 22% de grânulos pequenos, 56% de médios e 22% de grandes. Com relação aos tamanhos dos grânulos de BNP, observamos 12% de pequenos, 75% de médios e 13% de grandes Comparação Átrio Direito com Átrio Esquerdo. Grânulos de ANP e BNP por área.

50 50 Figura 20 Comparação do número de grânulos de ANP (acima) e BNP (abaixo) por área entre átrio direito e átrio esquerdo. Comparando os dados do número de grânulos de ANP em ambos os átrios, observa-se que o número de grânulos de ANP por área no GC foi de 16,83±1,5 no átrio direito e de 14,8±1,2 no átrio esquerdo. No GA do Átrio direito foi de 12±1,2 e no átrio esquerdo foi de 9,43±1,0. No GR, foi de 5±0,5 no átrio direito e de 8,5±0,9 no átrio esquerdo. No GAR, foi de 8,3 ± 1,3 no átrio direito e de 7.4 ± 0.8 no átrio esquerdo. Em relação ao número de grânulos de BNP por área, verifica-se que no GC, foi de 17,41 ± 1,2 no átrio direito e de 18,32±1,4 no átrio esquerdo. No GA, foi de 13,95 ± 1,4 no átrio direito e de 18,32±1,4 no átrio esquerdo. No GR, foi de 8,05 ± 0,85 no átrio direito e de 10,55±1,2 no átrio esquerdo. No GAR, foi de 10 ± 1,8 no átrio direito e de 8,8 ± 0.9 no átrio esquerdo Comparação Átrio Direito com Átrio Esquerdo.Diâmetro de Grânulos de ANP e BNP.

51 51 Figura 21 Comparação do diâmetro de grânulos de ANP (acima) e BNP (abaixo) por área entre átrio Direito e Átrio Esquerdo. Verifica-se após análise dos dados do diâmetro de ANP nos dois átrios, que no GC do átrio direito foi de 61,9±1,4 nm e no átrio esquerdo de 72,2±0,75 nm. No GA, foi de 64,7±0,8 nm no átrio direito e de 64,5±0,9 nm no átrio esquerdo. No GR, foi de 55,8±1,5 nm no átrio direito e de 62,6±1,4 nm no átrio esquerdo. No GAR, foi de 60,3 ± 1,6 nm no átrio direito e de 60,4 ± 0,80 nm no átrio esquerdo. Em relação ao diâmetro dos grânulos de BNP, observa-se que, no GC do átrio direito foi de 52,04±0,64 nm e no átrio esquerdo de 52,2±0,54 nm. No