FIBRA, METABOLISMO ÁCIDO-BÁSICO E BALANÇO DE MACROELEMENTOS EM GATOS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL FIBRA, METABOLISMO ÁCIDO-BÁSICO E BALANÇO DE MACROELEMENTOS EM GATOS Bruna Agy Loureiro Zootecnista 2016

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL FIBRA, METABOLISMO ÁCIDO-BÁSICO E BALANÇO DE MACROELEMENTOS EM GATOS Bruna Agy Loureiro Orientador: Prof. Dr. Aulus Cavalieri Carciofi Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Zootecnia 2016

3 L892f Loureiro, Bruna Agy Fibra, metabolismo ácido-básico e balanço de macroelementos em gatos / Bruna Agy Loureiro. Jaboticabal, 2016 iv, 66 p. ; il.; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Aulus Cavalieri Carciofi Banca examinadora: Telma Teresinha Berchielli, Márcia de Oliveira Sampaio Gomes, Cristiana Fonseca Ferreira Pontieri, Thaila Cristina Putarov Bibliografia 1. Agua. 2. Oxalato. 3. Polpa de beterraba. 4. Supersaturação relativa. 5. Urina. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU :636.8

4 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Bruna Agy Loureiro nascida em Ribeirão Preto em 18 de agosto de Em março de 2005 ingressou no curso de Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Campus de Jaboticabal. Durante a graduação foi bolsista da FAPESP de iniciação Científica durante dois anos, sob orientação do Professor Dr. Aulus Cavalieri Carciofi. Graduou-se em fevereiro de 2010 e em março do mesmo ano ingressou no curso de Mestrado em Zootecnia na mesma Instituição e sob orientação da Professora Dra. Nilva Kazue Sakomura e co-orientação do Professor Dr. Aulus Cavalieri Carciofi, sendo durante este período bolsista da FAPESP. Concluiu o mestrado em 2012 e iniciou no mesmo ano e instituição, o curso de doutorado em Zootecnia. Durante o curso, realizou estágio sanduíche no Waltham Centre for Pet Nutrition, na Inglaterra, com orientação do Dr. Richard Butterwick. Durante este período foi bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE) da Capes. As áreas de atuação durante a sua formação foram, efeitos funcionais e fisiológicos das fibras alimentares e prevenção de urolitíases em gatos..

5 Dedico A memória de meu avô Laerte Agy E avó Eunice Sales Loureiro.

6 Agradecimentos Primeiramente agradeço a Deus pela minha vida e pelas generosas oportunidades que já me concedeu. A Prof a. Marcia de Oliveira Sampaio Gomes, Prof a. Telma Teresinha Berchielli, Dr a. Cristiana Fonseca Ferreira Pontieri e Dr a. Thaila Cristina Putarov por aceitarem o convite para participar da banca de defesa desta tese. Ao Professor Aulus Cavalieri Carciofi, como não poderia ser diferente, por todas as oportunidade que me concedeu e pelo grande exemplo durante estes anos. Obrigada por ter compartilhado seu conhecimento, seu valioso tempo e sua amizade. Fica aqui minha estima e meu agradecimento especial. Aos meus pais Solange Aparecida Agy e Antônio Mauricio Loureiro pela dedicação na educação dos filhos e por ensinarem os verdadeiros valores. Isto foi possível, pois vocês foram os maiores exemplos. Espero poder retribuir um dia. Aos meus irmãos, que estão sempre presentes na minha vida mesmo estando distantes. Com o tempo nossas vidas tomaram rumos diferentes, mas agradeço pela certeza de poder contar com vocês sempre! A familia Agy, simplesmente por ser a família Agy! Agradeço todos os membros por cada um ocupar um espaço precioso no meu coração e em especial a Dona Neide, por hoje ser a alma desta família. Sou abençoada por fazer parte desta família especial! A Rose e ao Daniel por terem me concedido a benção de ser madrinha do Henrique. Obrigada pela confiança, a minha alegria e amor são imensos. Vocês foram e são pessoas que me apoiam muito e que tenho um carinho especial.

7 Ao Laboratório de Pesquisas em Nutrição e de doenças Nutricionais de Cães e Gatos Prof. Dr. Flávio Prada, por me ter permitido adquirir tanto conhecimento, e também a todos os colegas que ao longo destes quase 11 anos passaram por lá e cruzaram meu caminho. Cada um teve uma participação especial levando e compartilhando algo, deixo aqui meu completo agradecimento a todos! Quem já fez, sabe o que e fazer parte deste grupo! Serei com muito orgulho uma eterna embaixadora do Laboratório de Nutrição de Cães e Gatos. Aos novos e velhos colegas de pós-graduação, não apenas pela convivência e ajuda diária, mas também pelas diversas demonstrações de amizade e consideração, em especial: Carol, Mariana, Raquel, Francine, Fernanda M, Fernanda K, Mayara P, Mayara B, Peterson, Érico, Michele, Ricardo, Thaila, Katiani, Fabiano, Ana Paula, Danilo, Flavio, Chayanne, Íris, Juliana, Ludmilla, Lucas, Juan, Gustavo, Leandro, Marise, Isabela. As amizades, em especial de Mariana, Raquel, Carol, Thaila, Ana Paula, Peterson, Márcia, Fatima, Elisangela, Raissa, Claudinha e Elaine. Ao Alejandro, que em pouco tempo se tornou um companheiro especial. A aluna de iniciação cientifica Amanda Vitta, por todo seu esforço e empenho na realização dos experimentos e analises. Aos funcionários do Laboratório de Nutrição Claudia, Elaine e Diego, pela ajuda imprescindível e também pelo carinho e amizade. A Guabi PetCare por todo o apoio técnico e financeiro ao Laboratório de Pesquisas em Nutrição e Doenças Nutricionais de Cães e Gatos, sem o qual esta Tese de Doutorado não teria sido possível.

8 A WALTHAM por ter me recebido tão bem e pela ótima experiência. Agradeço em especial à Kerry Gray e ao Richard Butterwick por toda atenção e dedicação ao meu treinamento no centro de pesquisas. A Sarah e aos Wright s, a divertida família inglesa, por terem dividido seu lar e terem feito me sentir parte dela durante a minha estadia na Inglaterra. Aos meus verdadeiros amigos peludos, companheiros de todos os dias e que estiveram sempre prontos para dar carinho e mostrar o mais sincero significado de amor, Atila, Victoria, Carlitos, Rebeca, Pitoco, Tati e Rigo. Aos queridos cães e gatos do laboratório que dedicam parte, ou toda a sua vida à ciência e ao nosso aprendizado. A Universidade Estadual Paulista pela minha formação e ao CNPq pela bolsa de estudos.

9 i SUMÁRIO Página CEUA Comissão de ética no uso de animais... ii RESUMO... iii ABSTRACT... iv CAPÍTULO 1 Considerações gerais... 1 INTRODUÇÃO... 1 REVISÃO DE LITERATURA... 2 Polpa de beterraba em dietas para gatos... 2 Fibra alimentar e produção de ácidos graxos de cadeia curta... 3 Balanço hídrico em gatos... 5 Excesso de bases, produção de oxalato e supersaturação relativa da urina... 7 Balanço de macroelementos... 9 Equilíbrio ácido-basico REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 - BEET PULP EFFECTS ON WATER AND MACROELEMENTS BALANCE, ACID-BASE EQUILIBRIUM, AND URINE PARAMETERS OF CATS FED KIBBLE DIETS Introduction Material and Methods Results Discussion References CAPITULO 3 BEET PULP INTAKE AND HAIRBALL FECAL EXCRETION IN MIXED-BREED SHORTHAIRED CATS Introduction Material and Methods Results Discussion References... 66

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11 iii FIBRA, METABOLISMO ÁCIDO-BÁSICO E BALANÇO DE MACROELEMENTOS EM GATOS RESUMO As fibras dietéticas são um grupo de carboidratos de interesse da nutrição de gatos. Estas são utilizadas em formulações específicas para gatos para reduzir a densidade energética de alimentos, previner e/ou auxilar o tratamento de doenças gastrintestinais e metabólicas e também para promover saúde intestinal devido ao estímulo de microorganismos produtores de ácidos graxos voláteis. Contudo, pouca informação existe a respeito das consequências metabólicas do consumo de fibras por gatos, seu efeito na excreção de água e eletrólitos, produção de urina ou mesmo o efeito da absorção de ácidos orgânicos derivados da fermentação microbiana intestinal. Este estudo verificou a influencia da fibra dietetica no balanço hidro-eletrolitico e de macroelementos, produção de oxalato e equilibrio ácido-basico de gatos. Foram utilizados 18 gatos adultos e três dietas: BP0, um dieta controle sem adição de fibra; PB8, com adição de 8% de polpa de beterrada e PB16, com adição de 16% de polpa de beterraba. Após 15 dias de adaptação, o consumo de alimento e água foram monitorados e as fezes e urina foram coletadas durante 8 dias. Neste período foram determinados o balanço hídrico dos animais, densidade, ph e volume de urina e coletadas amostras para determinação da concentração urinária de cálcio, fósforo, cloreto, sódio, potássio, magnésio, enxofre, ácido úrico, citrato e oxalato, para calculo da supersaturação relativa para oxalato de cálcio (SSR OxCa). Também foram determinados tempo de retenção da ingesta no trato digestório, produtos da fermentação nas fezes e excreção de bolas de pelo nas fezes. O equilíbrio ácido-básico dos animais em jejum e no pós-prandial foi acessado por hemogasometria do sangue venoso. Os resultados foram avaliados por meio de contrastes polinomiais (P<0,05). Em resposta a ingestão de fibra, os gatos apresentaram queda na digestibilidade dos nutrientes e aumento da excreção fecal de água (P<0,05), sem alterar a ingestão hídrica, com consequente redução da produção de urina (P<0,05). O ph urinário e a concentração de oxalato foram semelhantes entre tratamentos (P>0,05). O balanço de macroelementos foi influenciado pelo consumo de fibra, alterando a retenção de Ca, K, Mg e S (P<0,05). Estas alterações, no entanto, não se refletiram em aumento da SSR OxCa. Os gatos apresentaram aumento linear da excreção fecal de Na em resposta ao consumo de fibra e aumento na produção de ácidos graxos de cadeia curta e redução linear do ph das fezes (P<0,05). O tempo de retenção do alimento foi menor na dieta PB16 (P<0,05). A análise hemogasométrica dos gatos em jejum foi similar entre grupos, mas na avaliação pós-prandial foi verificada redução linear no ph sanguíneo, bicarbonato e excesso de bases sanguíneo após inclusão de fibra (P<0,05). Absorção de componentes fermentativos da degradação microbiana e a maior excreção fecal de Na e bicarbonato podem explicar as alterações no metabolismo intermediário dos gatos promovidas pela ingestão de fibra. A polpa de beterraba diminuiu o tempo de retenção da dieta no trato gastrointestinal, mas não alterou a excreção de bolas de pelo nas fezes. PALAVRAS-CHAVE: água; oxalato; polpa de beterraba; supersaturação relativa; urina.

12 iv FIBER, ACID-BASE METABOLISM AND MACROELEMENTS BALANCE IN CATS ABSTRACT - Dietary fibers are a group of carbohydrate of interest to the nutrition of cats. These are used in specific formulations for cats to reduce food energy density, avoid or assist the treatment of gastrointestinal and metabolic diseases and also to promote intestinal health due to stimulus of microorganisms to produce volatile fatty acids. However, there is little information about the metabolic consequences of fiber intake for cats, their effect on water and electrolytes excretion, urine production, or even the effect of absorption of organic acids derived from intestinal microbial fermentation. The present study verified the influence of dietary fiber in water and macroelements balance, oxalate production and acid-base balance of cats. It were used 18 adult cats and three diets: BP0, a control diet without adding fiber; BP8 with 8% beet pulp added and BP16, with 16% beet pulp added. After 15 days of adaptation, food and water consumption were monitored, and feces and urine were collected 8 consecutive days. During this period were determined water balance of the animals, urine density, ph and volume and samples were collected to determine the urinary concentration of calcium, phosphorus, chloride, sodium, potassium, magnesium, sulfur, uric acid, citrate and oxalate, for calculation of relative supersaturation for calcium oxalate (RSS CaOx). Also were determined food retention time in the digestive tract, fecal fermentation end-products, hairball excretion and acid-base status of fasted animals and in post-prandial by blood gas analysis. The results were evaluated by polynomial contrasts (P <0.05). In response to fiber intake, cats presented decreased nutrient digestibility and increased fecal excretion of water (P <0.05) without altering water intake, with consequent reduction in urine production (P <0.05). The mineral balance was influenced by fiber consumption, altering Ca, K, Mg and S retention (P<0.05). These alterations did not reflected in increased RSS CaOx. Cats showed a linear increase in fecal excretion of Na in response to fiber consumption and increase in production of volatile fatty acids and linear reduction of fecal ph (p <0.05). The food retention time was lower in PB16 diet (P <0.05). The hemogasometric analysis in fasted cats was similar between groups, but postprandial evaluation was checked linear decrease in blood ph, bicarbonate and base excess blood after inclusion of fiber (P <0.05). Absorption of fermentation components of microbial degradation and increased fecal excretion of Na and bicarbonate can explain the changes in intermediary metabolism of cats promoted by fiber intake. Beet pulp decreases the retention time of the diet in the gastrointestinal tract, but did not affect the excretion of fecal hairballs. KEYWORDS: beet pulp; water; oxalate; relative supersaturation; urine.

13 1 CAPÍTULO 1 Considerações gerais INTRODUÇÃO A fibra alimentar é um grupo de carboidratos importante na nutrição de cães e gatos. Por definição, são consideradas os remanescentes de polissacarídeos da parede celular de plantas comestíveis, lignina e de substâncias associadas, resistentes à hidrólise por enzimas do trato gastrointestinal dos animais (TROWELL et al., 1976). Os polissacarídeos da parede celular, ou estruturais, incluem celulose, hemicelulose (que fazem parte da fração insolúvel da fibra) e algumas pectinas, enquanto os polissacarídeos não celulósicos incluem pectinas, gomas e mucilagens, constituindo fração solúvel da fibra (NRC, 2006). As características mais importantes da fibra, em relação à nutrição de cães e gatos, são sua solubilidade e fermentabilidade, que estão diretamente relacionadas com as concentrações e os componentes das frações solúveis e insolúveis que a compõem (MUSCO, 2013). A solubilidade da fibra está correlacionada ao aumento da viscosidade intestinal, diminuindo a velocidade de digestão e absorção, o que resulta em redução da digestibilidade. Parecem ainda, favorecer o controle de saciedade (BOSCH et al., 2009). A fermentação diz respeito à velocidade de degradação bacteriana da fibra e à correspondente produção de ácidos graxos de cadeia curta. Estes últimos são benéficos ao trato gastrintestinal, mas em altas concentrações promovem aumento do peristaltismo, aumento do teor de água das fezes, diminuição da digestibilidade da proteína e gordura e influenciar a absorção de ânions no cólon (CARCIOFI, 2005; SUNVOLD et al., 1995a). Fibra de baixa fermentação leva à diminuição da digestibilidade da matéria seca, mas não ocasiona muita interferência na digestibilidade dos demais nutrientes, no teor de água e na qualidade das fezes produzidas. Desta forma, o consumo de algumas fibras reduz a digestibilidade aparente dos nutrientes, aumenta a fermentação microbiana intestinal, provoca maior excreção de fezes e produção de fezes com maior umidade, resultando em maior excreção de água via fezes.

14 2 Gatos domésticos são animais descendentes de felino que habitava desertos (Felis silvestris lybica), adaptados ao baixo consumo de água. Quando alimentados com dietas secas fazem o balanço hídrico sem aumentar o consumo de água, resultando em produção de baixo volume de urina e urina concentrada (CARCIOFI et al., 2005). Estas condições da urina podem predispor os gatos à formação de urólitos, como os de oxalato de calcio, e outras formas de doença do trato urinário inferior de felinos. Devido à possível influência da fibra na excreção fecal e urinária de água, é possível que seu consumo altere a SSR da urina de gatos, especialmente em função da baixa sensibilidade à sede desta espécie. Este é aspecto metabólico referente à ingestão de fibra ainda não foi investigado para gatos. Este trabalho teve como objetivo compreender algumas das consequências fisiológicas e metabólicas da inclusão de polpa de beterraba, fonte de fibra de fermentação moderada, em alimentos secos para gatos. Foram estudados os efeitos desta fibra na digestibilidade aparente dos nutrientes, no balanço de macroelementos, excreção de tricobezoares e no tempo de retenção do alimento no trato gastrointestinal. Além disto, foram estudados aspectos inéditos do consumo de fibras sobre o equilíbrio ácido-básico e hidro-eletrolítico e sua relação com as características e supersaturação relativa de oxalato de cálcio da urina de gatos. REVISAO DE LITERATURA Polpa de beterraba em dietas para gatos Até meados da década de 70, as fibras eram consideradas componentes inertes nas rações de animais carnívoros. Atualmente são utilizadas em formulações específicas para gatos para reduzir a densidade energética de alimentos, previner e/ou auxilar o tratamento de doenças gastrintestinais e metabólicas, dentre elas a diabetes, colites, doença inflamatória intestinal, retenção de fezes, dislipidemias e obesidade. A polpa de beterraba é uma fonte de fibra alimentar tradicional utilizada em pet food. Esta contém componentes da fração insolúvel e solúvel da fibra em proporção interessante, capaz de promover moderada fermentação (FISCHER et al., 2012,

15 3 SUNVOLD et al. 1995a, SUNVOLD et al. 1995b, SUNVOLD et al. 1995c, FAHEY et al., 1990a). A quantidade de fibra alimentar total da polpa de beterraba reportada na literatura varia de 57% a 82,6%, e as frações insolúveis e solúveis variam de 37,1% a 68,9% e 13,1% a 28,6%, respectivamente (CALABRÒ et al., 2013, KERR et al., 2013, MUSCO, 2013, FISCHER et al., 2012, SUNVOLD et al., 1995d, FAHEY et al., 1990a, FAHEY et al., 1990b, SUNVOLD et al. 1995a, SUNVOLD et al. 1995b, SUNVOLD et al. 1995c, BLUNDELL; BURLEY, 1986). Segundo Fahey (1990a), a polpa de beterraba é composta de aproximadamente 16% de polissacarídeos viscosos, 31% de hemicelulose e polissacarídeos não viscosos e 25% de celulose, mas esta composição pode variar bastante, em função da variedade, cultivo e método de produção. A inclusão de polpa de beterraba em dietas já foi bastante estudada para cães (DIEZ et al., 1998, MUIR et al., 1996, FAHEY et al. 1992, FAHEY et al. 1990a, FAHEY et al. 1990b), mas menos explorada em gatos (FISCHER et al. 2012, FEKETE et al., 2004; BUENO et al., 2000). De forma geral, sua adição reduz a digestibilidade da matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta e a energia metabolizável do alimento. O tempo de retenção de alimento no trato gastrointestinal em cães se reduziu com a inclusão de polpa de beterraba (FAHEY et al. 1995), e o teor de umidade nas fezes aumentou, tanto em cães (FAHEY et al., 1995a, FAHEY et al., 1995b, FAHEY et al. 1992) como em gatos (FISCHER et al. 2012, FEKETE et al., 2004). A inclusão de 15,5% de polpa de beterraba em dietas para gatos aumentou a fermentação microbiana intestinal, verificada pelo aumento da concentração de ácido acético, ácido propiônico e ácido lático nas fezes. Aumentou, ainda, em 2,8 vezes a produção de fezes e em 25% a umidade das fezes, sem piora no score fecal (FISCHER et al., 2012). Em outro estudo, foi capaz de elevar em quase 50% a umidade das fezes de gatos (FEKETE et al., 2004). Este aumento do teor de água retido no bolo fecal está relacionado com a produção de ácidos graxos de cadeia curta e elevação da osmolalidade no cólon. Fibra alimentar e produção de ácidos graxos de cadeira curta O consumo de fibras que propiciam fermentação microbiana no intestino aumenta a produção dos ácidos graxos de cadeia curta, como acetato, propionato e

16 4 butirato. Estes favorecem a manutenção de saúde intestinal. Estudos com cães e gatos (BUENO et al., 2000, CLEMENS et al., 1998) reportam que fibras moderadamente fermentáveis, como a polpa de beterraba, permitem estímulo tanto tátil (abrasivo) quanto químico (energéticos), alteram a histologia da mucosa, ativam o transporte de ácidos orgânicos e limitam alguns eventos patológicos. Além disto, os ácidos graxos de cadeia curta, por natureza de seu sistema de transporte, passivo ou ativo, influenciam a síntese de energia no cólon, fluxo eletrolítico e consistência das fezes (Bueno et al. 2000). Os diferentes ácidos graxos de cadeia curta exercem benefícios específicos para a saúde. Estudos realizados em outras espécies sugerem que o propionato e o butirato podem agir, de forma independente, estimulando a absorção de cálcio, magnésio e ânions no cólon. Esta ação talvez possa ser, ainda, intensificada pelo acetato. O propionato pode aumentar a capacidade absortiva do cólon, pelo estímulo à proliferação de seu epitélio (TOPPING, 1996). Acetato e propionato foram mencionados por terem efeitos reguladores no metabolismo lipídico e de colesterol, mas este foi rejeitado em estudos posteriores (TOPPING, 1996; DEMIGNE et al., 1986). O propionato foi mais detidamente estudado em felinos, este pode ser absorvido e utilizado no metabolismo energético pelo fígado, influenciando a gliconeogênese e reduzindo o catabolismo de aminoácidos no período pós-prandial (VERBRUGGHE et al., 2009). O butirato, enquanto contribui com apenas 15 a 20% do total de AGCC das fezes, parece ter a maior contribuição à integridade do cólon. Este é a fonte preferencial de energia dos colonócitos, contribuindo diretamente para a produção de energia com efeito trófico em seu epitélio, induzindo aumento da altura das criptas e tamanho do ceco (TOPPING, 1996). Reduzidas concentrações de butirato podem potencialmente causar diferenciação nas células nos mamíferos, assim como carcinoma no cólon (ROEDIGER, 1980). Desta forma, a inclusão de fibras de moderada fermentação pode ser interessante em algumas dietas para gatos. Contudo, pouca informação existe a respeito das consequências fisiológicas e efeitos metabólicos da absorção dos ácidos orgânicos derivados da fermentação microbiana intestinal destes compostos.

17 5 Balanço hídrico em gatos Em animais saudáveis, adultos, em repouso e em ambiente termoneutro, existe equilíbrio entre a ingestão de água, nutrientes e minerais e a excreção diária destas substâncias ou seus produtos metabólicos. Portanto, em situação de homeostase, o animal não apresenta ganho ou perda de água, nutrientes ou minerais, e assim se considera seu balanço igual à zero. Desta forma, a entrada de água é igual à sua saída e o volume de água adicionado aos fluidos corporais pelo alimento, metabolismo e consumo da substância é igual ao volume de água perdido na urina e fezes (perdas de água sensível) mais a saliva, evaporação pelo epitélio cutâneo e respiratório (perdas de água insensível) (MAXWELL et al., 1987). A mais importante perda obrigatória diária de água em animais em condição normal ocorre via urina. Esta muitas vezes é monitorada de acordo com a necessidade durante a avaliação clínica. Sabe-se, também, que perdas evaporativas podem ser altas em estresse térmico, exercício ou animais ativos (DIBARTOLA, 2012). A necessidade de fluidos para manutenção também é influenciada pela composição da dieta. Em cães e gatos, parte do nitrogênio e minerais ingeridos, não necessários para promover crescimento ou formação de tecidos é excretada pela urina. O volume de urina necessário para excreção de soluto é, portanto, uma função da quantidade de soluto de origem dietética e da osmolalidade da urina. A maioria dos animais possui livre acesso à água e, portanto, ingerem quantidade de água suficiente para suportar a excreção urinária de solutos do alimento. O fator que determina o volume de urina é a quantidade total de água ingerida por dia, o que depende tanto da quantidade de alimento e sua umidade, quanto da água de bebida consumida voluntariamente (DIBARTOLA, 2012). A perda de água urinária diária pode, deste modo ser dividida em perda de água obrigatória (água necessária para excretar a carga de soluto renal diário) e a perda de água livre (água excretada não acompanhada por soluto, sob controle do hormônio antidiurético [ADH]). A excreção de água livre aumenta durante relativo excesso de água no organismo, protegendo o animal de super-hidratação e hipotonicidade, que seria resultado da retenção de água em excesso de solutos. A perda de água renal obrigatória precisa ocorrer mesmo em situações de relativo déficit de água, para que o

18 6 excedente de minerais e metabólitos sejam eliminados do corpo. Semelhantemente, menor quantidade de água é necessária para excreção fecal de compostos. A excreção urinária de água livre é controlada pelo estímulo ou inibição da secreção de ADH e pela sede. A água urinária livre aumenta quando quantidade de água suficiente é ingerida para diluição do soluto corporal e resulta em hipotonicidade. O aumento de 1 a 3% da osmolalidade sérica estimulou a sede em cães (O CONNOR, 1975; O CONNOR; POTTS, 1988). Por outro lado, a perda diária de água livre pela urina é muito baixa durante deficiência ou privação de água em cães e gatos saudáveis. As perdas de água insensíveis ocorrem por evaporação e podem ser de origem cutânea ou respiratória. As perdas de água evaporativas cutâneas são pequenas em cães e gatos. Perdas pela pele são mínimas nestes animais por conta da presença reduzida de glândulas sudoríparas, limitadas aos coxins e sem participação na termorregulação destas espécies (DIBARTOLA, 2012). Aumentos na temperatura ambiente, especificamente em associação com baixa umidade relativa, resultam em aumento da perda de água por evaporação pela respiração, sendo este efeito mais marcante em cães do que em gatos. Em temperatura ambiente de 40ºC, gatos aumentaram 4,5 vezes sua taxa respiratória, enquanto cães podem aumentar sua taxa respiratória de 12 a 20 vezes. Em ambientes quentes, foi relatado que gatos lambemse para promover resfriamento da pele por evaporação da saliva, aumentando a perda de água (CHEW, 1965). Contudo, gatos parecem ser animais com sensibilidade reduzida à desidratação e à sede (NRC, 2006). Gatos alimentados com dietas compostas de diferentes teores de matéria seca fizeram balanço hídrico sem aumentar a ingestão de água de bebida, resultando na produção de menor volume e maior concentração de urina (CARCIOFI et al. 2005). Em estudo de BUENO et al. (2000), a inclusão de polpa de beterraba em alimento para gatos, apesar de ter promovido aumento do consumo de matéria seca, não alterou o consumo de água diário. A perda de água via fezes normalmente é levada em consideração apenas em situações onde as estas apresentam baixo escore fecal ou quando são diarreicas, sendo na maioria das vezes desconsiderada em situações de funcionamento gastrointestinal adequado. No entanto, variações na excreção fecal de água em função do consumo de fibra podem ser importantes para

19 7 felinos, devido ao baixo consumo de água de bebida pela espécie. Este é aspecto fisiológico pouco explorado do consumo de fibra pelos gatos. Excesso de bases, produção de oxalato e supersaturação relativa da urina Os macroelementos da dieta podem ser classificados como ânions ou cátions. Ânions apresentam carga negativa e cátions, carga positiva. Os mais importantes cátions da dieta são sódio, potássio, cálcio e magnésio e os ânions o cloro, enxofre e fósforo (BLOCK, 1984). O efeito de um alimento, ou mais especificamente, dos cátions e ânions do alimento, sobre o ph urinário pode ser predito pelo cálculo do excesso de bases. Este equilíbrio cátion-aniônico determina o ph urinário e as excreções de citrato e oxalato pelos rins, sendo determinante na formação de urólitos (JEREMIAS et al., 2013). O excesso de bases (EB) da dieta é definido como a diferença, em miliequivalentes (meq) entre os principais cátions e ânions (KIENZLE et al., 1991; KIENZLE; WILMS-EILERS,1994) e pode ser calculado a partir de fórmulas químicas propostas, sendo expresso em meq/kg de matéria seca: EB (meq/kg MS) = (49,9 x Ca*) + (82,3 x Mg) + (43,5 x Na) + (25,6 x K) (64,6 x P) (62,4 x S) (28,2 x Cl) * concentração dos elementos em g/kg de MS. Em mamíferos o oxalato é considerado produto final de descarte, sem função específica no organismo. A ativação do metabolismo de glioxalato é o principal responsável pela síntese endógena de oxalato, que ocorre predominantemente no fígado. Qualquer glioxalato que não for reduzido a glicolato ou transaminado para glicina vai ser oxidado a oxalato (DIJCKER et al., 2011). A associação do oxalato ao cálcio forma oxalato de cálcio, sal insolúvel que pode provocar danos renais quando os cristais se formam nos néfrons, ou obstruções uretrais quando localizados na bexiga (BEHNAM et al., 2006). Assim, quanto mais alta sua concentração na urina maior a possibilidade de ocorrer formação de cálculos de oxalato de cálcio, um dos urólitos mais comumente encontrados em gatos (FORRESTER; ROUDEBUSH, 2007). Este é assunto importante pois urolitíase é uma das causas mais importantes da doença do

20 8 trato urinário inferior de felinos, representando de 15% a 20 % dos casos da doença (BARTGES; KIRK, 2012). O citrato tem dois efeitos importantes na prevenção da urolitíase, conhecidos como efeitos solubilizante e inibidor da cristalização dos sais de cálcio. Dessa forma, a hipocitratúria, isolada ou combinada com outras alterações metabólicas, é promotora de urolitíase. O mecanismo pelo qual o citrato atua como fator inibidor está associado à formação de complexo solúvel com o cálcio na urina, o que pode resultar em menos cálcio disponível para se ligar ao oxalato urinário, o que ajuda a prevenir a formação de cálculos de oxalato de cálcio ou de fosfato de cálcio (SAKUNO, 2002). O conhecimento isolado do ph urinário não permite se avaliar completamente o risco de formação de cristais no trato urinário de cães e gatos (ROBERTSON et al., 2002). Mais recentemente, as estratégias dietéticas e de manejo para prevenção e dissolução de urólitos são baseadas nos princípios de saturação da urina, com intuito de colocá-la na zona de subsaturação. O estado de saturação da urina é o produto da concentração de solutos presentes, seu ph, força iônica, temperatura e presença de complexos químicos pré-formados (ALLEN; KRUGER, 2000). A supersaturação relativa da urina (SSR) é determinada medindo-se a concentração de sódio, potássio, cloro, cálcio, fósforo, magnésio, enxofre, oxalato e citrato, bem como o ph da urina. As concentrações destes componentes são digitadas em um programa de computador que calcula a saturação dos elementos do urólito em relação a uma amostra de urina humana padrão (ALLEN; KRUGGER, 2000). Formam-se cristais pela precipitação química de íons e moléculas que estão dissolvidos na urina, quando esta se torna supersaturada com esses elementos. O tipo de cálculo formado é dependente de vários fatores, incluindo a excreção renal de minerais, ph da urina, presença de promotores, ausência de inibidores, infecções bacterianas concomitantes e possível inflamação subjacente (HOSTUTLER et al., 2005). Existem três zonas definidas para a SSR. A zona de subsaturação, na qual os urólitos não podem ser formados, independentemente de seu tipo. O valor de SSR que classifica urina subsaturada é uma SSR<1. A zona supersaturada metaestável é a zona na qual geralmente encontra-se a urina de cães e gatos saudáveis. Nesta zona não são formados novos urólitos, porém não ocorre dissolução e pode ocorrer crescimento de urólitos pré-existentes. O valor de SSR para oxalato de cálcio desta

21 9 zona fica entre 1 e 12 e para estruvita entre 1 e 4. Já na zona supersaturada ocorre formação, agregação e crescimento de urólitos. Os valores de SSR para oxalato de cálcio que correspondem a esta zona é SSR>12 e para estruvita SSR>4 (HURLEY et al., 2003). Desta forma, durante a formulação de alimento para felinos é importante que este seja balanceado de forma a reduzir a supersaturação da urina, e assim as chances de formação de cristais e urólitos. Este objetivo pode ser alcançado por meio da modificação do ph urinário, redução da ingestão e excreção de substâncias calculogênicas e aumento do volume de urina produzido (CARCIOFI et al., 2005). Devido à possível influência da fibra na excreção fecal e urinária de água, é possível que seu consumo altere a SSR da urina de gatos, especialmente em função da baixa sensibilidade à sede desta espécie. Este é aspecto metabólico referente à ingestão de fibra ainda não foi investigado para gatos. Balanço de macroelementos A absorção, excreção urinária e excreção fecal dos macroelementos ingeridos na dieta irão determinar a composição, o ph e a supersaturação relativa da urina. O estudo do balanço desses minerais se faz necessário para verificar a interação destes com os macronutrientes da dieta, e também para o entendimento do grau de importância de cada um deles no processo de formação dos urólitos. Além dos macroelementos, absorção e excreção de oxalato e citrato, bem como a relação destes compostos com a composição da dieta, também são importantes fatores para o entendimento das litíases do trato urinário. Assim como no balanço hídrico, em situação de homeostase o animal não apresenta ganho ou perda de minerais, assim considera-se normal o balanço zero. A carga renal de solutos é derivada da dieta, advindo principalmente de proteína e minerais presentes e compreende ureia, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, NH4 + e cátions menores, bem como PO 3-- 4, Cl - 2-, SO 4 e ânions menores. A quantidade de solutos da dieta é determinada pela composição e quantidade de matéria seca ingeridos, principalmente proteínas e minerais. Dietas com alta matéria mineral, quando absorvida no intestino,

22 10 proporciona mais soluto para excreção. Em animais saudáveis, a excreção fecal diária de Na +, K + e Cl - é substancialmente menor que a excreção urinária. Acredita-se que o consumo de fibra possa interferir no balanço de macroelementos, alterando sua absorção aparente e excreção urinária (BUENO et al. 2000; PROLA, et al. 2009). A inclusão de fibra, se alterar a homeostasia dos macroelementos poderá interferir no equilíbro ácido-básico e na SSR da urina dos gatos. Assim, verificar o efeito da inclusão de fibra no balanço e rota de excreção, renal ou fecal de minerais é necessário, e insuficientemente explorado para gatos. Na sequência, apresenta-se breve revisão do metabolismo de macroelementos em gatos. Cálcio Intestino e rins são os principais controladores do equilíbrio de cálcio em animais sadios. Normalmente, em animais adultos o teor de cálcio absorvido na dieta se iguala a quantidade de cálcio perdido na urina e nas fezes. A absorção intestinal de cálcio depende da condição fisiológica do intestino. Influenciam este processo o ph luminal, presença de outros componentes na dieta, integridade das vilosidades ou presença de doença do intestino delgado e grau de estimulação dos enterócitos pelo calcitriol (DIBARTOLA, 2006). O cálcio é pouco absorvido pelo tubo intestinal devido à relativa insolubilidade de muitos de seus sais, bem como em função da absorção deficiente de cátions bivalentes. Quando em excesso, o cálcio tende a formar compostos de fosfato de cálcio quase insolúveis, que não são absorvidos, passam pelo intestino e são excretados nas fezes (GUYTON; HALL, 1996). Cerca de nove décimos da ingestão diária de cálcio são excretados nas fezes, enquanto o décimo restante é eliminado na urina. A quantidade de cálcio excretada na urina é rigidamente controlada por complexa interação entre numerosos hormônios, volume extracelular, equilíbrio ácido-básico e concentração urinária e plasmática de vários íons (GUYTON; HALL, 1996). O cálcio não ligado à proteína é filtrado pelos glomérulos, sendo amplamente reabsorvido nos rins. Em animais sadios isso resulta na recuperação de mais de 98% do cálcio filtrado. A reabsorção do cálcio é muito seletiva, dependendo da concentração dos íons cálcio no sangue. Quando ela é baixa, essa reabsorção é muito grande, de modo que quase não ocorre perda de cálcio na urina.

23 11 Por outro lado, mesmo pequeno aumento da concentração de íons cálcio acima do normal eleva acentuadamente a sua excreção urinária (GUYTON; HALL, 1996). Estudos sugerem que alterações na relação Ca:P, com aumentos de fósforo na dieta, não afetam significativamente a absorção de cálcio em gatos adultos (PASTOOR et al., 1994). Fósforo O conteúdo médio de fósforo nas rações comerciais destinadas a animais de estimação representa cerca de 1% da matéria seca. Cães e gatos consomem 0,5 a 3 gramas de fósforo por dia, dependendo do peso corporal e das necessidades energéticas (DIBARTOLA, 2006). A fonte do fósforo da dieta influencia acentuadamente a absorção e excreção de fósforo em gatos. Quando fornecidos sais de fosfato monobásico e dibásico verifica-se maior absorção gastrintestinal de fósforo, maior excreção urinária do mineral e maior grau de hiperfosfatemia pós-prandial. Entretanto, menor concentração plasmática de fósforo é verificada quando frango, carne e farinha de peixe são utilizados como fonte do mineral na dieta (FINCO et al., 1989). O fosfato orgânico ingerido é hidrolisado no trato gastrintestinal, liberando fosfato inorgânico para absorção. A absorção aparente intestinal de fosfato, isto é, a diferença entre o fosfato ingerido e a eliminação fecal do mineral corresponde a cerca de 60 a 70 % do total ingerido. Há relação direta entre a ingestão de fósforo e sua absorção. Em animais com equilíbrio de fósforo zero, a excreção urinária de fosfato equivale à absorção intestinal de fosfato (DIBARTOLA, 2006). A absorção intestinal de fosfato envolve dois mecanismos. O principal deles é a difusão passiva, principalmente por meio da via paracelular. O transporte ativo na mucosa é mediado por um carreador saturável dependente do sódio. Ambos os mecanismos de transporte atuam no duodeno, embora a difusão ocorra particularmente no jejuno e íleo em meio alcalino (CUNNINGHAM, 1999). Em um estudo, PASTOOR et al. (1994) demonstraram aumento na absorção aparente de fósforo de 66 para 77% quando a concentração de fósforo na dieta aumentou e a relação Ca:P diminuiu. Em outro estudo, KIENZLE (1998) encontrou que a relação Ca:P teve impacto maior que a concentração dietética de fósforo sobre a porcentagem de absorção aparente de fósforo.

24 12 O rim controla a reabsorção tubular de fosfato para manter um equilíbrio zero. Normalmente, 80 a 90% da carga de fosfato filtrada é reabsorvida pelos túbulos renais. O fosfato atravessa a membrana das células do túbulo renal proximal por meio de cotransportadores de sódio-fosfato, presentes na borda em escova da membrana. A ingestão de dieta com alto teor de fósforo reduz a reabsorção no túbulo proximal. Por outro lado, a ingestão de baixo teor de fósforo na dieta pode resultar em reabsorção quase total de fosfato no túbulo proximal (CUNNINGHAM, 1999). Os efeitos do equilíbrio ácido-básico no transporte de fosfato no túbulo proximal são complexos. A acidose metabólica aguda não influencia na reabsorção de fosfato no túbulo renal. Contudo, a acidose metabólica crônica resulta em menor transporte do íon no túbulo proximal, efeito possivelmente mediado por glicocorticoides (DIBARTOLA, 2006). Magnésio A concentração de magnésio da dieta tornou-se tópico de interesse nos anos 1970 e 1980 como fator potencial de risco de urólitos de estruvita e obstrução da uretra (LEWIS et al., 1978). Atualmente, após novas pesquisas a respeito da doença e dos mecanismos de formação de urólitos em gatos, que resultaram em melhor compreensão dos reais mecanismos envolvidos, não mais se considera que a concentração de magnésio na dieta seja fator de risco isolado na formação de urólitos em gatos (WAGNER et al, 2006). O ph e a SSR da urina são reconhecidos hoje como fatores mais importantes. O principal local de absorção do magnésio parece ser o íleo, mas o jejuno e o cólon também contribuem substancialmente para sua absorção. A absorção ocorre por via paracelular passiva não saturável e via transcelular ativa saturável. A porcentagem de magnésio absorvido pelos mecanismos transcelular e paracelular depende principalmente da concentração desse íon na dieta. Elevado consumo de magnésio propicia maior gradiente de concentração e muito provavelmente a absorção do elemento nesta situação envolva a via paracelular, com pequena quantidade absorvida através das células, ocorrendo o inverso quando o consumo do mineral é baixo (DIBARTOLA, 2006). A absorção aparente de magnésio é negativamente afetada pelo aumento das concentrações dietéticas de Ca, P e Mg (PASTOOR et al., 1994).

25 13 Sódio O sódio é o cátion mais abundante do líquido extracelular. Cerca de 70% do sódio no organismo é livre e osmoticamente ativo, sendo permeável às membranas celulares. Possui forte relação e afinidade com a água corporal. A osmolalidade do líquido extracelular e a concentração de sódio são reguladas por ajustes no balanço hídrico. Osmoreceptores no hipotálamo constituem o ramo (sensores) para a regulação do balanço hídrico. A liberação de vasopressina, hormônio antidiurético, é estimulada quando os osmoreceptores se contraem em resposta a hiperosmolalidade e é inibida quando eles dilatam-se em resposta a hiposmolalidade. A vasopressina (responsável pela saída de água) e a sede (responsável pela entrada de água) constituem o ramo eferente para a regulação do balanço hídrico. YU e MORRIS (1999) reportaram que a absorção aparente do sódio ingerido é próxima a 75% em gatos em crescimento e próxima a 100% em gatos adultos. Demonstraram, ainda, que a excreção fecal do sódio não se altera e é independente da concentração de sódio na dieta. Cloro O cloro constitui aproximadamente dois terços dos ânions no plasma, e também é o ânion filtrado em maior abundância pelo glomérulo e reabsorvido nos túbulos renais. O cloro é importante não só por manter a osmolalidade, mas também por participar ativamente do equilíbrio ácido-basico. Cerca de 80% do sódio filtrado é reabsorvido acompanhado pelo cloro. O transporte do cloro nos túbulos coletores corticais é intimamente relacionado ao sódio e transporte de fluidos, associado com a regulação do equilíbrio ácido-basico (SCHILD; GREEN, 1988). Em estudo com gatos adultos, a absorção aparente intestinal de cloro aumentou de 90 para 96% quando gatos consumiram dieta com 5 ou 16g de cloro por quilograma de matéria seca (CHING et al., 1989).

26 14 Potássio O controle interno da concentração de potássio é mantido pelo equilíbrio entre excreção (particularmente na urina) e ingestão (na dieta). No animal sadio, o potássio ingerido é virtualmente todo absorvido no estômago e intestino delgado. O transporte de potássio no intestino delgado é passivo, enquanto que no cólon ocorre transporte ativo (que responde à aldosterona). A secreção de potássio no cólon pode ter importante participação na homeostase extra-renal de potássio em algumas doenças (por exemplo, na insuficiência renal crônica). O potássio oriundo da dieta e da destruição celular é removido do corpo principalmente pelos rins e, em quantidade muito menor, pelo trato gastrintestinal. Em homeostase, 90 a 95% do potássio ingerido é excretado na urina e os 5 a 10% remanescentes excretados nas fezes. O rim é o principal regulador do equilíbrio de potássio. O potássio é filtrado nos glomérulos, sendo cerca de 70% da carga filtrada reabsorvida osmoticamente com água e sódio nos túbulos proximais e 10 a 20% absorvido no ramo ascendente da alça de Henle (DIBARTOLA, 2006). Alta ingestão de sódio está associada ao aumento da excreção urinária de potássio, como resultado da maior secreção de potássio no túbulo conector e no ducto coletor cortical. Alta ingestão de potássio está associada ao aumento na excreção urinária do mesmo em decorrência da maior secreção no túbulo conector, no ducto coletor cortical e no ducto coletor medular externo. A acidose metabólica aguda diminui a excreção urinária de potássio. Já a acidose metabólica crônica pode aumentar a excreção urinária de potássio (DIBARTOLA, 2006). Em circunstâncias normais, a absorção de potássio da dieta nos gatos parece ser bem alta. Em estudos com gatos adultos sob condições normais de alimentação a absorção aparente do potássio ingerido foi de 90% a 95%, ou mais, sugerindo perto de 100% de absorção verdadeira (CHING et al., 1989; DOWN et al., 1990). Enxofre O enxofre é considerado essencial por fazer parte de inúmeros compostos presentes no organismo animal. Dentre esses compostos destacam-se a metionina, cistina, cisteína, homocisteína, cistationina, taurina, biotina, ácido lipóico, coenzima A,

27 15 glutationa e sulfato de condroitina (YAMKA et al., 2006). A absorção do enxofre se dá no intestino delgado, especialmente no íleo. A sua administração deve ser constante, pois o animal tem pouca habilidade para armazená-lo. Já foi demonstrado em ensaios com ratos que 41 a 64% do sulfato inorgânico da dieta são eliminados pela urina em prazo não superior a oito horas. Na nutrição de cães e gatos, a maior importância do enxofre é como um componente da metionina, cistina e taurina. A necessidade de enxofre é suprida pela ingestão dos aminoácidos sulfurados. O sulfato acidifica diretamente os fluidos biológicos por formar ácido sulfúrico e pode alterar o balanço ácido-básico, se adicionado em altas concentrações na dieta (BLOCK, 1984). Equilíbrio acido-básico A concentração do ion H+ nos fluidos corporais precisa ser mantida constante para que mudanças prejudiciais na função de enzimas e estrutura celular não ocorram. A faixa de concentração de H+ compatível com a vida é de 16 a 160 neq/l. O conceito de ph foi introduzido para permitir identificação de forma mais simples destas mudanças, devido a ampla faixa de H+ encontrada nos sistemas químicos. Assim, o termo ph é definido como o logaritmo negativo na base 10 da concentração do íon hidrogênio, expresso em nano equivalentes por litro (DIBARTOLA, 2012). O ph do líquido extracelular é uma das variáveis mais rigorosamente reguladas do organismo. Os limites vitais da variação do ph para mamíferos estão geralmente entre 7,0 e 7,8. No sangue arterial, a faixa normal de ph varia entre 7,36 e 7,44, com ph médio de 7,4. Em condições normais, os ácidos ou bases são adicionados continuamente aos líquidos corporais, seja por ingestão ou como resultado de sua produção no metabolismo celular (GONZALEZ; SILVA, 1999). A regulação da homeostase requer que o número de cátions seja igual ao número de ânions (GUYTON; HALL, 2002). Para combater distúrbios neste equilíbrio, o organismo utilizase de três mecanismos principais: tamponamento químico, ajuste respiratório da concentração sanguínea de dióxido de carbono e excreção de íons hidrogênio e bicarbonato pelos rins. O excesso de bases do sangue é a quantidade de ácidos e bases fortes necessários para manter 1L de sangue em ph 7,40 à 37ºC, enquanto a pco2 é

28 16 mantida constante à 40 mmhg (ASTRUP et al., 1961). O excesso de bases é mudado apenas por ácidos não voláteis ou fixos, sendo assim considerado reflexo de distúrbios metabólicos do sistema ácido-base. Em geral, valor negativo de EB indica acidose metabólica, enquanto valores positivos indicam alcalose metabólica. Os termos acidose e alcalose referem-se a processos fisiopatológicos que causam acumulo de ácidos e base no corpo. Os termos acidemia e alcalemia referem-se, especificamente, ao ph do líquido extracelular. Na acidemia o ph do liquido extracelular é menor do que o normal, e a concentração de H+ é maior do que o fisiológico. Na alcalemia o ph do liquido extracelular é maior do que o normal e a concentração de H+ é menor do que fisiológico. Uma forma de se acessar o metabolismo intermediário é por meio da hemogasometria (DIBARTOLA, 2012). Variações na absorção aparente e excreção renal de minerais, promovidas pelo consumo de fibra podem se refletir no equilíbrio ácido-básico dos gatos. Além disso, a absorção de produtos da fermentação da fibra, como ácidos graxos de cadeia curta e ácido lático podem introduzir carga de H+ no meio extracelular, promovendo necessária resposta fisiológica para reequilíbrio metabólico. Este aspecto potencial do consumo de fibras também não foi ainda estudado em gatos. REFERÊNCIAS ASTRUP, P. New approach to acid-base metabolism. Clinical Chemistry, v.7, p.1, BARTGES J. W.; KIRK C. Nutritional management of Lower urinary tract disease. In Fascetti, A.J. and Delaney, S. J. (Ed.). Applied Veterinary Clinical Nutrition. 1ed. Davis, California, cap 16, p.269, BEHNAM, J. T.; WILLIAMS, E. L.; BRINK, S.; RUMSBY, G.; DANPURE, C. J. Reconstruction of human hepatocyte glyoxylate metabolic pathways in stably

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36 24 CAPITULO 2- BEET PULP EFFECTS ON WATER AND MACROELEMENTS BALANCE, ACID-BASE EQUILIBRIUM, AND URINE PARAMETERS OF CATS FED KIBBLE DIETS Artigo científico apresentado nas normas do Journal of Animal Science

37 25 1 Running head: Beet pulp, metabolism and urine traits of cats Beet pulp effects on water and macroelements balance, acid-base equilibrium, and urine parameters of cats fed kibble diets B. A. Loureiro, R. S. Pedreira, F. S. Mendonca, M. Monti, A. Vitta, A. C. Carciofi Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP Univ Estadual Paulista, Jaboticabal, SP , Brazil Part of the results were presented at the 18 th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition, Utrecht, Netherlands, September The authors acknowledge the financial support of Guabi PetCare and CNPq for scholarship. 2 Corresponding author:aulus.carciofi@gmail.com

38 ABSTRACT Fibers are used in specific formulations for cats by to reduce food energy content, to control some metabolic conditions and to promote gut health. Fiber reduces nutrient digestibility, increases intestinal microbial fermentation, induces greater fecal excretion and fecal moisture content resulting in higher water excretion via feces. This can promote a production of low volume and concentrated urine, which may predispose stone formation in cats. To perform this study 18 adult cats and three diets were used: BP0, a control diet without adding fiber; PB8 with 8% added beet pulp and PB16, with 16% added beet pulp. After 15 days of adaptation, food and water consumption were monitored, and feces and urine were collected for 8 consecutive days. During this period were determined water and mineral balance, urine density, ph and volume and samples were collected to determine the urine concentration of calcium, phosphorus, chloride, sodium, potassium, magnesium, sulfur, uric acid, citrate and oxalate, for calculation of relative supersaturation for calcium oxalate (RSS CaOx). Food retention time in the digestive tract, fecal fermentation end-products and acid-base status also were determined. The results were evaluated by polynomial contrasts (P < 0.05). In response to fiber intake, cats presented decreased nutrient digestibility and increased fecal excretion of water (P < 0.05) without altering water intake, with consequent reduction in urine production (P < 0.05). Urine traits and SSR CaOx were similar among treatments. Mineral balance was influenced by fiber consumption, altering retentions of Ca, K, Mg and S (P < 0.05). The cats had showed a linear increase in production of short chain fatty acids and linear reduction of fecal ph (P < 0.05). The food retention time was lower in PB16 diet (P < 0.05). Cats presented in the post prandial period linear decrease in blood ph, bicarbonate and base excess blood after inclusion of fiber (P < 0.05). Absorption of fermentation components of microbial degradation and increased fecal

39 excretion of Na and bicarbonate may explain the changes in intermediary metabolism of cats promoted by fiber intake Keywords: blood ph, digestibility, fiber, calcium oxalate, propionate, urine supersaturation INTRODUCTION Cats are adapted to low water consumption and less sensitive than dogs to changes in water balance and thirst (Anderson, 1982; NRC, 2006). When fed dry diets, they do not compensate water intake in comparison with cats fed wet foods, doing the water balance through the production of less and more concentrate urine (Jackson and Tovey, 1997; Carciofi et al., 2005). These condition has been incriminated to predispose cats to urolithiasis, but this is not really stablished (Holme, 1977; Allen; Kruger, 2000). Fibers have been used to dilute energy content (Vasconcellos, et al., 2009), ameliorate endocrine disturbances (Nelson, et al., 2000), and promote intestinal healthy through volatile fatty acids production (Fischer, et al., 2013). Fiber sources with soluble and fermentable components, such as beet pulp, can promote higher fecal excretion and fecal moisture, resulting in increased water excretion via feces (Prola et al., 2009; Fischer et al., 2013). This functional effect was insufficiently explored for cats; it is possible that the increase water excretion via feces is not compensated by drinking more, resulting in reduced water excretion via urine, less solute dilution and higher urine saturation. Besides their trophic effects on intestinal mucosa (Bueno et al., 2000a), the short-chain fatty acids derived from fiber fermentation are readily absorbed and used in the energy metabolism of the cat, influencing post-prandial gluconeogenesis and amino acid catabolism (Verbrugghe et al., 2009). However, few information are available about the effects of these

40 absorbed organic acids on the intermediary metabolism. This way, the present study evaluated the effects of beet pulp addition to kibble diets on nutrient digestibility, water and mineral balances, acid-base metabolism and urine traits and relative supersaturation for calcium oxalate in cats MATERIAL AND METHODS All experimental procedures were approved by the Ethics Committee of Animal Use of the Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP Univ Estadual Paulista, Jaboticabal, Brazil (Protocol 3567/15) Animals and experimental design Eighteen mixed-breed cats, with 8.0 ± 1.9 years old, 4.8 ± 1.1 kg of body weight, and an average body condition score of 5.1 ± 0.8 (Laflamme, 1997) were used. All cats were neutered and their health status accessed prior the beginning of the study. The animals were kept under the same environmental conditions and belonged to the Laboratory of Research on Nutrition and Nutritional Diseases of Dogs and Cats, Jaboticabal, SP, Brazil. The study followed a completely randomized design with three diets and six cats per diet. The experiment lasted 31 days, distributed as follow: the adaptation to diets occurred from days 1 to 15; water and food consumption were registered and feces and urine were totally collected from days 16 to 24 in order to assess water balance, macroelements balance and digestibility; fresh feces collection for the measurement of fermentation products was performed from days 26 to 29; on days 30 to 31 blood samples were collected to performe venous blood gas analysis. During the experiment cats were restricted to individual stainless steel metabolic cages (0.80 m x 0.80 m x 1.0 m), from 1600 h to 0800 h (16 consecutive hours), when their

41 experimental foods and water were available. From 0800 h to 1600 h (eight consecutive hours) the cats were kept in a collective cattery (50 m 2 ) for exercise and socialization, they had access to water but not to food. During the feces and urine collection periods, cats were fully restricted to their metabolism cages. Throughout the study a 12 h dark: 12 h light cycle was maintained. The daily amount of food was individually calculated according to the energy requirements of cats, as 100 Kcal of metabolizable energy (ME) per kg 0.67 per day. Food ME was estimated from their chemical composition, according to Nutrient Requirement of Dogs and Cats (NRC, 2006). Water was available ad libitum. The amount of food and water offered at each feeding, as well as the amount of remaining food and water was daily recorded, in order to calculate food and water intake. A blank was used to calculate water intake: a water sample was left in the environment, out of the cats reach, and the percentage of loss by evaporation was determined and later subtracted from the water leftovers Experimental diets Three diets were formulated according to the nutritional recommendations of the European Pet Food Industry Federation (Fediaf, 2008) for adult cats: a control diet, without addition of beet pulp (BP0); a diet with 8% addition of beep pulp (BP8); a diet with 16% addition of beet pulp (BP16). Beet pulp was added in substitution to maize, and adjustments on poultry fat and maize gluten meal were done in order to produce diets with similar fat and crude protein contents (Table 1). 111

42 Table 1. Ingredient formula, analyzed chemical compositions, and starch gelatinization of extruded diets for cats with increasing inclusions of beet pulp Item Diets 1 BP0 BP8 BP16 Ingredient composition of the experimental diets (%) Maize Poultry by-product meal Corn gluten meal Beet pulp Poultry fat Paltant enhancer Common Salt Potassium chloride Choline chloride Vitamin and Mineral Supplement Fish oil Mold inhibitor Antioxidant Taurine DL-Methionine L-Lysine HCL Chemical composition of the diets (%) Moisture (DM-basis) Crude Protein Fat Starch Dietary Fiber Ash Ca P K Mg Na Cl S Starch gelatinization degree (%)

43 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 Liquid palatant, SPF do Brasil, Descalvado, Brazil. 3 Provided per kg of diet: vitamin A, 22,000 IU; vitamin D, 2,200 IU; vitamin E, 90 IU; vitamin B1, 3 mg/kg; vitamin B2, 7 mg/kg; pantothenic acid, 22 mg/kg; niacin, 14 mg/kg; vitamin B6, 4 mg/kg; folic acid 0.3 mg/kg; vitamin B12, 33 µg/kg, zinc 140 mg/kg; iron, 80 mg/kg; copper 9,5 mg/kg; iodine 1,5 mg/kg; selenium, 0,25 mg/kg. 4 Mold Zap: Ammonium dipropionate, acetic acid, sorbic acid and benzoic acid Alltech do Brasil Agroindustrial Ltda, Curitiba, PR, Brazil. 5 Banox: BHA, BHT, propyl gallate and calcium carbonate Alltech do Brasil Agroindustrial Ltda, Curitiba, PR, Brazil To evaluate urine production and characteristics, and macroelements balance, possible factors of influence not related to fiber consumption was reduced as much as possible. Diets were formulated to present similar base excess (BE) and to induce similar intakes of macroelements. This was necessary because of the influence of food BE on urine ph and renal excretion of oxalate and citrate (Jeremias et al., 2013). To achieve on this, before diet formulation ingredients are purchased, stored, sampled and analyzed for moisture, crude protein, acid-hydrolyzed fat, starch, Na, K, Ca, Mg, Cl, P and S concentrations. Based on these results the food formulation were adjusted to obtain similar macroelement composition, and to promote an urine ph close to 6.5, based on the equation proposed by Jeremias et al. (2013). All diets were mixed and ground in a hammer mill (Sistema Tigre de Mistura e Moagem, Tigre, Sao Paulo, Brazil) fitted with a 0.8 mm screen sieve size, and extruded under similar processing conditions in a single-screw extruder (MEX 250, Manzoni, Campinas, Brasil). The

44 manufacturing process was controlled by adjusting kibble density between 350 and 370 g/l (asis basis) every 20 min to ensure consistent cooking and kibble quality (size and expansion). Extruder pre-conditioning temperature was kept above 95 C by direct steam injection. Water, and steam additions were adjusted according to each diet formulation. Extruder screw speed and feed rate were kept constant. The temperature of the dough under extrusion varied from 126 C to 131 C. After extrusion the kibbles were dried in a forced air dryer at 105 C and coated with fats and palatant enhancer. To access the extrusion quality, the degree of gelatinization of the starch was determined by the amyloglucosidase method (Sá et al., 2013) Total tract apparent digestibility and metabolizable energy of the experimental diets The coefficients of total tract apparent digestibility of nutrients and food ME were calculated according to the quantitative collection of feces and urine protocol. On the first day of feces and urine collection (day 16), all feces and urine were removed from the cages and discarded before 0730 h, and total fecal and urine output were collected from this point for the next eight days. Feces were collected twice per day, weighed and frozen ( 15 C). Urine was collected at least three times a day in plastic bottles with added 100mg of thymol (Sinthy, LabSinthy, Diadema, São Paulo, Brazil) as a preservative, and stored at 4 o C. Prior to analysis, feces were dried in a forced-air oven (Fanem, São Paulo, Brasil) at 55 ºC for 72 h. Dried fecal samples and diets were ground in a cutting mill (Mod MA-350, Marconi, Piracicaba, Brazil) fitted with a 1 mm screen sieve, and analyzed for DM by oven-drying the sample (method ) and conversion to ash by muffle furnace incineration (method ). Crude protein (CP) was analyzed by the Kjeldahl method (method ), and acid-hydrolyzed fat was assessed using a Soxhlet apparatus (method ) according to the Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1995). Organic matter (OM) was calculated as DM minus

45 ash. Determination of the total dietary fiber (TDF) was carried out according to Prosky et al. (1992), and the total amount of starch was analyzed according to the guidelines set out by Miller (1959) and Hendrix (1993). The gross energy content of diets, urine and fecal matter were determined by bomb calorimeter (model 1261, Parr Instrument Company, Moline, IL, USA). All of the samples were analyzed in duplicate and repeated when the variation was greater than 5%. Fecal samples were scored according to the following system: 0 = watery liquid that can be poured; 1 = soft, unformed; 2 = soft, malformed stool assumes shape of container; 3 = soft, formed, moist softer stool that retains shape; 4 = well-formed and consistent stool, which does not adhere to the floor; and 5 = hard, dry pellets small, hard mass Water and macroelement balance The water balance was calculated using the intake and excretion data. The following parameters were computed: water intake from food; drinking water; metabolic water; total water intake (the sum of water intake from food, drinking water, and metabolic water); fecal water excretion; urinary excretion; insensible losses (the difference between total water intake and the sum of fecal water excretion and urine excretion); total water excretion (the sum of insensible losses, fecal water excretion and urine excretion). The metabolic water was estimated by multiplying the amount of digestible protein, carbohydrates and fat consumed by 0.396, and 1.071, respectively (Buffington and Chew, 1999). Data from food intake, fecal excretion, and urine excretion were used to compute the macroelement balance of each cat. The food, fecal, and urine concentration of Ca, P, Mg, K, Na, Cl, and S were analyzed, and for each element was calculated: intake; fecal excretion; renal excretion; apparent absorption (intake minus fecal excretion); retention (intake minus fecal and renal excretion).

46 The macroelements were analyzed on food and feces after nitric-perchloric digestion, with the exception of Cl, obtained by digestion of the samples by the dry process. Calcium, potassium, magnesium, chloride and sodium were measured by flame atomic absorption spectrophotometry (GBC-932 AA, Scientific Equipment PTY LTD, Melbourne, Australia). Phosphorus was measured with a spectrophotometer (Ultrospec , Pharmacia Biotech, Cambridge, England) using the vanadate-molybdate method, and sulfur content measured with the turbidimetric method as described by the Association of Official Analytical Chemists (1995) Urine traits, oxalate renal excretion, and urine relative supersaturation for calcium oxalate For each 24 h period, the urine was pooled to every cat, filtered and the volume, density with a refractometer (Atago, CO T2-NE, Japan), and ph with a ph meter (Digimed DM20 Digicrom Analítica Limitada, São Paulo, Brazil) were measured. The 24h urine was then separated into two aliquots for storage. To one sample was added 1 ml of 6N HCl for each 50mL of urine (acidified urine), that was immediately frozen (-20 C). The other sample was frozen only with Thymol as a preservative (non-acidified urine). The acidified urine samples were used to analyze calcium, phosphorus, oxalate and magnesium, and in the non-acidified sample were measured sodium, potassium, chloride, sulfur, citrate, and uric acid. Commercial kits were used to determine calcium, phosphorus, magnesium, uric acid, and chloride (respectively Ref. 90; Ref. 12; Ref. 50; Ref. 96; Ref. 140; Ref. 49; Ref. 104; Labquest, Labtest Diagnóstica S.A, Lagoa Santa, Brazil), using a spectrophotometer (Labquest, Labtest Diagnóstica S.A, Lagoa Santa, Brazil). Sodium and potassium concentrations were obtained by ion-selective electrodes (Roche Diagnostics, 9180, Indianapolis, USA). Sulfur was measured by the turbidimetric method (AOAC, 1995) after sample digestion with nitro-perchloric solution, in

47 a spectrophotometer (model B442, Micronal, São Paulo, SP, Brazil). The citrate in the urine was measured by an enzymatic method using citrate lyase (Citrate, Biovision, South Milpitas Boulevard, Milpitas, CA, USA). The oxalate was analyzed by enzymatic and colorimetric determination of oxalic acid (OXALATE Enzymatic Assay kit, Libios, Bully, France). Based on the results, the index of relative supersaturation for calcium oxalate (RSSCaOx) in the urine was calculated using the EQUIL-93 software (Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, USA) Blood gas analysis To assess the acid-base balance of the intermediary metabolism of cats, venous blood gas analysis was performed. Venous blood was collected from animals at 1600 h (before the exposition to food) and at 0800 h, or16h hours after animals were exposed to the diets. A blood sample of approximately 0.5 ml was taken from the medial saphenous vein by direct puncture, without compression. Before blood collection heparin was drawn into the syringe to coat the interior of the barrel, and excess air was expelled, living the dead space of the syringe filled with heparin. The blood was analyzed immediately afterwards for ph, sodium, potassium, chlorine, partial pressure of carbon dioxide, bicarbonate, base excess, and osmolality (Omini C Blood Gas Analyzer, Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) Fermentation end-products and fecal ph Fresh fecal samples were collected immediately after elimination from days 26 to 28 to measure short and branched-chain fatty acids (SCFA and BCFA). Each day, approximately 10 g of feces were mixed with 30 ml of a 16% (v/v) formic acid solution, precipitated at 4 C for 72 h, and the supernatant centrifuged (5804R, Eppendorf, Hamburgo, Brazil) three times at

48 ,500 G at 15 C for 15 min. The SCFA and BCFA were analyzed in the composed supernatant of the three days of extraction, by gas chromatography (model 9001, Finnigan, San Jose, USA) according to Erwin et al. (1961) using a glass column 2 m in length and 3.17 mm in width, covered with 80/120 Carbopack B-DA/4% Carbowax 20M. Nitrogen was the carrier gas with a flow rate of 25 ml/min. The working temperatures were 220 C at injection, 210 C in the column, and 250 C in the flame ionization detector. Fecal ph was determined by mixing 10 ml of distilled water with 5 g of fresh feces (v/w) and measuring the result with a ph meter (DM20, Digicrom Analítica Ltda, São Paulo, Brazil) Statistical analysis Data were analyzed in a completely randomized design, and submitted to analysis of variance utilizing the general linear model procedure of the Statistical Analysis System software (Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The experimental unit was considered one cat. When significant differences were detected in ANOVA s F test, polynomial contrasts were used to evaluate the effect of the inclusion levels of beet pulp. All data were found to comply with the assumptions of the analysis of variance procedures. Values of P < 0.05 were considered significant RESULTS Diets were similar in crude protein and fat contents, but their total dietary fiber content increased according to each proposed formulation. Starch gelatinization was high and similar between diets (Table 1). All foods were accepted and consumed by cats, and no episodes of diarrhea, vomiting or soft stools occurred. Cats presented a quadratic response for DM and ME

49 intake (Table 2), eating less in the BP8 diet (P < 0.05). However, the body weight of the animals remained constant throughout the experiment (P > 0.05)

50 Table 2. Body weight, food intake, apparent total tract digestibility, and metabolizable energy content of experimental diets for cats with increasing additions of beet pulp Item Body weight (kg) Diets 1 SEM 2 Contrasts 3 P values BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Initial ns 4 ns Final ns ns Food intake (g or kcal kg (BW 0.67 ) -1 day -1 ; mean of 31 days of study) Dry matter ns Metabolizable energy ns Nutrient intake during the digestibility study (g cat -1 day -1 ) Dry matter ns Crude protein ns Acid-hydrolyzed fat ns ns Total Dietary Fiber < ns Starch < ns Apparent total tract digestibility (%) Dry matter < < ns Organic matter < < ns Crude protein ns Acid-hydrolyzed fat ns ns Total Dietary Fiber < < ns Starch ns ns Gross energy < < ns Food ME (kcal/g as-fed basis) Fecal traits and production (g cat -1 day -1 ) < < ns Output (DM-basis) ns Output (As-is basis) <0.001 <0.001 ns Dry matter (%) <0.001 <0.001 ns Score ns ns 1 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet.

51 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05) During the digestibility trial cats also presented reduced intake of the PB8 diet, with lower DM and CP intake for this food (P < 0.05). The consumption of starch and TDF decreased or increased linearly, respectively, according to fiber addition (P < 0.001). The apparent digestibility of DM, OM, CP and gross energy, and food ME content reduced linearly with beet pulp addition (P < 0.001). The TDF digestibility, on the other hand increase after beet pulp inclusion (P < 0.001). Starch and fat presented similar digestibilities among diets. Fecal production increased, and fecal DM decreased linearly after beet pulp inclusion (P < 0.001). Fecal score remained unchanged by treatments (P = 0.389). Regarding the water balance, cats presented a quadratic response of total water intake (P = 0.002), with lower total water consumption for the PB8 diet (Table 3). Due the lower DM intake of the PB8 diet, cats also consumed less water from food and metabolic water for this treatment (P < 0.01). Drinking water intake was similar among diets. As beet pulp addition induced an increase in fecal production, the route of water excretion changed: fecal water excretion increased and urine excretion reduced linearly after beet pulp inclusion (P < 0.001). 284

52 Table 3. Water balance of cats fed experimental diets with increasing additions of beet pulp Item Intake (ml kg (BW 0.67 ) -1 day -1 ) Diets 1 Contrasts 3 SEM 2 P value BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Total water intake ns Water from food Ns < Drinking water Ns ns Metabolic water Ns Excretion (ml kg (BW 0.67 ) -1 day -1 ) Fecal water <0.001 <0.001 ns Urine excretion ns Insensible losses Ns ns 1 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 3 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05) Despite the linear reduction on urine volume (P = 0.023), urine density, ph and RSSCaOx did not change by beet pulp consumption (Table 4). The concentrations of oxalate, citrate, macroelements and uric acid were also similar among diets. Cats presented high individual variation on the daily macroelements balance. Due the lower DM intake of the BP8 diet, for all macroelements a quadratic effect on intake was verified, with lower consumption of the BP8 food (P <0.01), as presented on Tables 5 and 6. The fecal excretion of Ca, and P followed the same pattern, with lower fecal excretion on cats fed the PB8 food (P < 0.01). For K, Na, Mg, Cl, and S, however, beet pulp consumption resulted in increased fecal excretion (P <0.01), more remarkable for Na, K, and Cl for the PB16 food (P < 0.001).

53 Table 4. Urine traits and composition of cats fed experimental diets with increasing additions of beet pulp Item Urine traits Diets 1 Contrasts 3 SEM 2 P values BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic ph ns 4 ns Density (g/l) ns ns Volume (ml cat -1 day -1 ) ns RSSCaOx ns ns Concentration on urine (mg/dl) Oxalate ns ns Citrate ns ns Na ns ns K ns ns Cl ns ns Ca ns ns P ns ns Mg ns ns S ns ns Uric acid ns ns 1 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 3 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05). 5 RSSCaOx = relative supersaturation of the urine for calcium oxalate

54 Table 5. Calcium, phosphorus and potassium intake, fecal and renal excretion, apparent absorption and retention on cats fed diets with increasing additions of beet pulp Item Diets 1 SEM 2 Contrasts 3 P values BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Calcium Intake ns Fecal excretion ns <0.001 Renal excretion ns Ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns 0,001 Retention (mg kg -1 day -1 ) < (% intake) Phosphorus Intake ns Fecal excretion ns < Renal excretion ns Ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns Ns (% intake) ns Retention (mg kg -1 day -1 ) ns Ns (% intake) ns Ns Potassium Intake , ns < Fecal excretion <0.001 <0.001 < Renal excretion ns ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) (% intake) <0.001 <0.001 ns Retention (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 3 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05).

55 Table 6. Magnesium, sodium, chloride and sulfur intake, fecal and renal excretion, apparent absorption and retention on cats fed diets with increasing additions of beet pulp Item Diets 1 Contrasts 3 SEM 2 P values BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Magnesium, Intake ns Fecal excretion Renal excretion ns ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns Retention (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns Sodium Intake ns Fecal excretion <0.001 <0.001 < Renal excretion <0.001 ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) <0.001 <0.001 ns Retention (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns ns Chloride Intake < Fecal excretion <0.001 < Renal excretion ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) <0.001 <0.001 ns Retention (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) <0.008 ns Sulfur Intake ns Fecal excretion < <0.001 Renal excretion ns Absorption (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) <0.001 ns <0.001 Retention (mg kg -1 day -1 ) ns (% intake) ns ns

56 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 3 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05) The renal excretion of Na, Cl, and S decrease linearly with beet pulp inclusion (P < 0.04), meanwhile the renal excretion of Ca, P, Mg, and K was unchanged by diets. The animals presented negative values for Ca absorption and retention, with higher values for the BP8 diet (P < 0.001), suggesting higher absorption and retention when lower amount is ingested. Phosphorus apparent absorption, as a percentage of intake varied between 30% to 40%, and was lower for the PB16 food (P = 0.008). Apparent absorption of K (% of intake) was very high, but reduced linearly by beep pulp inclusion (P < 0.001). Beep pulp addition resulted in linear reductions of Mg apparent absorption and retention by cats (P < 0.01), reaching negative retention for the BP16 diet. Sodium apparent absorption was linearly reduced by beet pulp inclusion (P < 0.006), although Na retention (% of intake) remained similar between treatments in consequence of a lower renal excretion. The apparent absorption of Cl was also very high (% on intake), and reduced linearly by fiber consumption (P < 0.001). However, cats presented strongly negative values for Cl retention. Animals presented a quadratic response on S apparent absorption (P < 0.01), that followed the intake of this macroelement. With the exception of butyric acid that showed a trend of reduction (P = 0.079), acetate and propionate fecal concentration increased linearly in response to beet pulp inclusion (P < 0.001), as presented on Table 7. On the other hand, the BCFA isobutyrate, isovalerate, and

57 valerate decreased linearly with fiber inclusion (P < 0.001), as well as the ph of the feces of the cats (P = 0.009) Table 7. Volatile fatty acid (VFA; mmol/g of fecal DM), and fecal ph of cats fed experimental diets with increasing additions of beet pulp Item Diets 1 Contrasts 3 SEM 2 P Values BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Fecal ph ns 4 Acetic acid <0.001 <0.001 ns Propionic acid <0.001 ns Butyric acid Ns ns Isobutyric acid <0.001 <0.001 ns Isovaleric acid <0.001 <0.001 ns Valeric acid <0.001 ns Total VFA ns 1 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 2 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 3 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 4 not significant (P > 0.05) The consumption of diets supplemented with beet pulp induced on the post-prandial period a linear reduction on venous blood ph (P = 0.011), bicarbonate concentration (P =0.002), and blood base excess (P = 0.002). On the other hand, no alterations were verified for cats on the fasted state (Table 8). For cats fed the PB16 food, on the post-prandial period blood ph, and bicarbonate reached the lower normal limit for the cat, and the base excess value was below the physiologic limit, indication mild acidosis (Dibartola, 2006).

58 Table 8. Venous blood gas analysis of cats in the fasted state and 16h after exposition to experimental diets with increasing additions of beet pulp Item Time 1 Diets 2 Contrasts 4 SEM 3 P values sampling BP0 BP8 BP16 Linear Quadratic Blood ph 1600h ns 5 ns 0800h ns PCO 2 (mmhg) 1600h ns ns 0800h ns ns HCO 3 - (mmol/l) 1600h ns ns 0800h ns Na + (mmol/l) 1600h ns ns 0800h ns ns k + (mmol/l) 1600h ns ns 0800h ns ns Ca 2+ (mmol/l) 1600h ns ns 0800h ns ns Cl - (mmol/l) 1600h ns ns Base excess (mmol/l) 0800h ns ns 1600h ns ns 0800h ns Anion gap 1600h ns ns 0800h ns ns 1 Time sampling: 1600h fasted state; 0800h 16h after exposition to the experimental food 2 BP0: control diet, without beet pulp; BP8: diet with 8% of beet pulp addition; BP16: diet with 16% of beet pulp addition. 3 SEM = standard error of the mean, n=6 cats per diet. 4 Linear and quadratic effect of beet pulp addition. 5 not significant (P > 0.05).

59 DISCUSSION The analyzed chemical composition of the diets used in the study met the nutritional requirement of adult cats (Fediaf, 2008). Diets used in the study had high starch gelatinization values, suggesting satisfactory cooking (de-oliveira et al., 2008). The base excess formulation of the dietsmaccording to Jeremias et al. (2013) was effective in to keeping similar urine ph of the cats during the study, which ranged from 6.43 ± 0.17 to 6.60 ± 0.21, despite variation in mineral balance and urine volume. This range of ph is in accordance with what is considered adequate (6.2 to 6.8) to prevent formation of both struvite and calcium oxalate uroliths (Allen and Kruger, 2000). The quadratic effect on DM and ME consumption was not expected. Despite of the differences in DM and energy consumption, the animals were able to keep their body weight. The control group had energy requirement for weight maintenance equivalent to 80% of NRC energy requirement for adult cats, whereas cats of BP8 and BP16 groups had energy requirements equivalent to 60 and 70%, respectively. Studies suggest that equation published in NRC (2006) super-estimates energy requirement for maintenance of adult cats, and also highlight individual variation of energy requirement, depending on gender, neutering, age and body weight (Berminghamet al., 2010; Kienzle et al., 2006). It is possible that animals selected to compose the groups for the present study had different energy requirement for body weight maintenance, or the period of experiment was too short to verified significant changes in body weight. It is also important to note that all cats were spent part of the experimental period in metabolism cages, or at least 16h per day, without opportunity to exercise, requiring less energy. Similarly, another study with cats showed different metabolizable energy consumption of dry kibble diets (0% fiber, 10 and 20% sugarcane fiber and 10% cellulose) with different caloric

60 density (Loureiro et al. 2016). In the other hand, Prola et al. (2006) showed a reduction in energy intake by cats fed a moist food with 24% cellulose. Although, the quadratic response of energy consumption makes difficult to attribute this restriction as an effect of the fiber added in the diets. The reduction on apparent nutrient digestibility and metabolizable energy of cat diets high in fibers was expected and has been observed previously (Loureiro et al. 2016; Fischer et al., 2012; Prola et al., 2009; Fekete et al., 2004). The impact on apparent fat digestibility was not significant, still in accordance with previous studies (Fischer et al., 2012; Prola et al., 2009; Fekete et al., 2004). The additions of more digestible fiber, as fermentable fibers, can result in less interference on the apparent digestibility of fat (Fischer et al. 2012). Total water consumption depends both on water in the diet and water voluntarily consumed by drinking. Increased dry matter intake can promote drinking, increased renal solute load and increased urine volume (O Connor and Potts, 1988). All diets presented similar moisture and promoted similar drinking water consumption by caged cats, however, it was observed linear reduction on urine volume with beet pulp inclusion into the diets. Consumption of beet pulp promoted lower volume urine in the cats, as a consequence of increased fecal water excretion, related to fiber consumption. High fecal water excretion was already demonstrated in cats fed cellulose diets (Prola et al., 2009). In the present study, during digestion, drinking water was less absorbed when associated with beet pulp in the gut, and more excreted in the feces, evidenced by linear reduction of fecal dry matter and increased fecal bulk. Some dietary fibers can present high water-holding capability, carrying part of water linked, increasing fecal moisture (Prola et al., 2009). Cats may not increase drinking enough to maintain total water intake when consuming a diet low in water. Cats receiving dry food diets may ingest insufficient water, contributing factor

61 in the development of lower urinary tract disease in cats (Dibartola, 2012). It is believed that a low ratio of total water intake to dry matter in the diet predisposes a cat to lower urinary tract disease. Diets with a ratio of total water to dry matter intake greater than 3 have been suggested as an aid in the prevention of lower urinary tract disease (Holme, 1977). In the present study the ratio of total water to dry matter intake increased with fiber inclusion (control = 2.34; BP8 = 2.61; BP16 = 2.75), showing that considerations about fecal water losses can be also important for interpretation of urine volume, especially for diets high in fermentable fibers, as beet pulp. The metabolic water is an important input in the total water intake. The amount of metabolic water found in the water balance followed the quadratic response of dry matter and nutrients consumption by the cats, and when observed the amount of metabolic water in percentage of total water intake (19, 19 and 15%, for Control, BP8 and BP16, respectively) it is possible to suggest that is related to the apparent digestibility of the diets. The urinary concentration of oxalate, Ca, P, K, Mg, Na, Cl, S and uric acid were similar to found in previous studies ( Jeremias, 2013; Zentek et al. 2014). Citrate concentration was low in comparison to the mentioned studies, possibly due to methodological and analytical differences. It was interesting that despite differences in minerals intake and minerals fecal excretion during the experiment, cat s urinary mineral excretion was driven to promote similar urine composition and traits. Although the amount in percentage of diet composition and Ca consumption were adequate for adult cats, animals presented negative absorption and retention of the mineral. It is possible that cat s Ca absorption at the period of collection was very low, becoming negative because of Ca from body fluids of digestion excreted in the feces. Differences in P consumption attributed to quadratic consumption of DM were equalized with higher absorption and lower renal excretion in the cats fed BP8 diet with lower dry matter intake, finishing in similar P

62 retention. Similar effect was observed for Mg, with exception for Mg balance, where Mg retention was higher in BP8 group. Magnesium is poorly absorbed by gastrointestinal tract (Dibartola, 2006), and fecal Ca, Mg and P excretion depend strongly on the intake of these minerals (Zentek, 1987; Kienzle, 1989) as observed in the mineral balance of the present study. In contrast, in the diets enriched with beet pulp fiber, fecal excretion of Na, K and Cl seemed to be more related to fecal water excretion. The K absorption was very high, in accordance with literature (Ching et al., 1989; Down et al., 1990). Sodium has high association with H2O molecules and is responsible to regulate the volume of extracellular fluid. The ion Cl and K, are always obedient to follow Na in water regulation (Dibartola, 2012). As considerable amount of these minerals were not absorbed in the gut because of increased fecal bulk and water retention in the bulk due high microbial fermentation, the minerals once absorbed were less excreted by kidneys producing lower volume of urine, keeping the volume of extracellular fluid. This data are in good agreement with previous investigations in cats (Prola et al. 2009; Kienzle, 1989). Sodium and K were exponentially correlated to fecal water (r 2 =0.81 and r 2 =0.36, respectively) in cats fed diets with different cellulose lengths (Prola et al. 2009). The changes verified in intermediary metabolism seemed to be promoted by beet pulp consumption and are related to the changes in water and mineral balance, and production of fermentative compounds in the intestine. Some hypotheses are raised to explain the metabolic acidosis verified in the study is based on microbial fermentation of the fiber in the gastrointestinal tract. Cats consuming fermentable fiber had increased microbial activity, demonstrated by increased production of volatile fatty acids and reduction of fecal ph. Absorption of organic acids produced during microbial degradation, as lactate, may also explain the increased consumption of bicarbonate as a attempt to keep eletroneutrality of extracellular fluid and the reduction of blood ph. Furthermore, the electrolyte flux in the colon is altered by

63 the presence of SCFA. A study suggests that for the cat, colonic SCFA absorption appears to be a passive and active event, the second dependent of sodium secretion (sodium being the major facilitator of active transport) (Bueno et al. 2000b). This assumption seems to be in agreement with the present study, where was found higher fecal excretion of Na. The lower absorption of Na found, also may have affected the plasmatic concentration of bicarbonate, as verified in post-prandial blood gas analysis. Sodium is filtered by glomeruli and reabsorbed by the renal tubules, and during this process reabsorption of water and sodium with bicarbonate also occurs, allowing bicarbonate recycling. The most abundant anions responsible to keep electro-neutrality of extracellular fluid are Cl and bicarbonate. Thus, is possible that less Na and bicarbonate being absorbed and less Na being filtrated decreased the chance of bicarbonate re-synthesis, decreasing the concentration of this cation in extracellular fluid. The lack of bicarbonate could be another responsible factor of reduction in blood ph. In conclusion, the use of beet pulp in extruded diets for cats had important effects in water and mineral balance, implying in reduction on the volume of produced urine, although these changes not led to increase in the chance to form calcium oxalate uroliths. The consumption of beet pulp also promoted alterations in intermediary metabolism, but its effect is not very clear. These alterations must be explored as well as the effect in long term of feeding REFERENCES Allen, T. A. And Kruger, J. M Enfermedad Felina De Las Vias Urinarias. In: Hand, M. S., Thatcher, C. D., Remillard, R. L., Roudebush, P. (Ed). Nutrición clinica en pequeños animales. Panamericana, Bogotá. p Anderson, R. S Water balance in the dog and cat. J. Small Anim. Pract. 23:

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65 Dibartola, S. P Fluid, electrolyte, and acid-base disorders in small animal practice. 4ed, Elsevier Saunders. Down, S. W., Fettman, M. J., Smith, K. R., Hamar, D. W., Nagode, L. A., Refsal, K. R., Wilke, W. L Effects of dietary acidification and potassium depletion on acid-base balance, mineral metabolism and renal function in adult cats. J. Nutr Erwin, W. S., G. J. Marco, and E. M. Mery Volatile fatty acids analyses of blood an rumen fluid by gas chromatography. J. Dairy Sci. 44: doi: /jds.s (61) Fediaf, Nutritional Guidelines for complete and complementary pet food for cats and dogs, European Pet Food Industry Federation. Brussels, Belgium. Fekete, S. G., I. Hullár, E. Andrásofszky, and F. Kelemen Effect of different fibre types on the digestibility of nutrients in cats. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 88: Hendrix, D. L Rapid extration and analysis of nonstructural carbohydrates in plant tissues. Crop Sci. Madison. 25: Holme, D. W Research into the feline urological syndrome. In: Proceedings of the Kal Kan Symposium for Treatment of Dog and Cat Diseases. Columbus, OH: Kal Kan Foods; p. 40. Jackson, O. F., Tovey, J. D Water balance studies in domestic cats. Feline pract. 7: Jeremias, J. T., Nogueira, S.P. ; Brunetto, M.A. ; Pereira, G.T. ; Loureiro, B.A. ; Ferreira, C.S. ; Gomes, M.O.S. ; Carciofi, A.C Predictive formulas for food base excess and urine ph estimations of cats. Anim. Feed Sci. Technol. 182: doi: /j.anifeedsci

66 Kienzle, E., Edtstadtler-Pietsch, G., Rudnick, R Retrospective study on the energy requirements of adult colony cats. J Nutr. 136:1973S-1975S. Laflamme D. P Development and validation of a body condition score system for Cats; A clinical tool. Feline Practice. 25: Loureiro, B. A.; Sakomura, N. K.; Vasconcellos, R. S.; Sembenelli, G.; Gomes, M. O. S.; Monti, M.; Malheiros, E. B.; Kawauchi, I. M.; Carciofi, A. C. Insoluble fibers, satiety and food intake in cats fed kibble diets J. Anim. Physiol. Anim. Nutr.. IN PRESS. Miller, G. L Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: Nelson, R. W., J. C. Scott-moncrieff, and E. C. Feldman Effect of dietary insoluble fiber on control of glycemia in cats with naturally acquired diabetes mellitus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 216: NRC Nutrient requirements of dogs and cats. Natl. Acad. Press, Washington, DC. O Connor, W. J., and Potts, D. J Kidneys and drinking in dogs. In: Michell AR, editor. Renal disease in dogs and cats: comparative and clinical aspects.oxford: Blackwell Scientific. p. 30. Prola, L., Dobenecker, B., Kienzle, E Interaction between dietary cellulose content and food intake in cats. J. Nutr. 136: Prola, L., B. Dobenecker, P. P. Mussa, and E. Kienzle Influence of cellulose fibre length on faecal quality, mineral excretion and nutrient digestibility in cat. J. Anim Physiol. Anim Nutr. 94: doi: /j x Prosky, L., N. G. Asp, T. F. Schweizer, J. W. Devries, and I. Furda Determination of insoluble and soluble dietary fiber in foods and food products: Colaborative Study. J. AOAC. Int.. 75:360 7

67 Sá, F. C., Vasconcellos, R. S., Brunetto, M. A., Roberti Filho, F. O., Gomes, M. O. S., Carciofi, A.C Enzyme use in kibble diets formulated with wheat bran for dogs: effects on processing and digestibility. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 97: doi: /jpn Vasconcellos, R. S., N. C. Borges, K. N. V. Gonçalves, J. C. Canola, F. J. A. De Paula, E. B Malheiros, M. A. Brunetto and A. C. Carciofi Protein intake during weight loss influences the energy required for weight loss and maintenance in cats. J. Nutr. 139: doi: /jn Verbrugghe, A., Hesta, M., Gommeren, K., Daminet, S., Wuyts, B., Buyse, J., Janssens, G. P. J Oligofructose and inulin modulate glucose and amino acid metabolism through propionate production in normal-weight and obese cats. Br J Nutr. 105: doi: /S

68 55 CAPITULO 3 - DIETS CONTAINING BEET PULP FIBER DO NOT PREVENT HAIRBALL FORMATION IN CATS Artigo científico apresentado nas normas do Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition

69 56 1 Running Title: Beet pulp and hairball 2 3 Beet pulp intake and hairball fecal excretion in mixed-breed shorthaired cats* 4 5 B. A. Loureiro, M. Monti, R. S. Pedreira, A. Vitta, T. C. Putarov, A. C. Carciofi Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP - Univ Estadual Paulista, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, Jaboticabal, SP , Brazil * Part of the results were presented at the 19 th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition, Toulouse, France, September Correspondence Dr. A. C. Carciofi, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, , Jaboticabal, SP Brazil. Tel: ; Fax: ; aulus.carciofi@gmail.com 23

70 57 24 Summary Hairball formation could induce vomiting and intestinal obstruction in predisposed cats. Some insoluble fibers as sugarcane fiber and cellulose can prevent hairballs formation. The aim of this study was to evaluate the effect of beet pulp consumption, a moderate soluble and fermentable fiber source, on fecal trichobezoars excretion in adult short-hair cats fed kibble diets. Eighteen mixed-breed short-hair cats and 3 extruded diets with two levels of beet pulp were used. A basal diet was balanced for cat maintenance and unfolded as follows: BPO control diet, without added fiber (8.8% dietary fiber); BP8-8% inclusion of beet pulp (17.5% dietary fiber); BP16-16% inclusion of beet pulp (23.8% dietary fiber). The cats were fed during 31 days and feces quantitatively collected during 3 periods of 3 days each (from days 3-5; 15-17; 26-28). Food retention time was determined in the last 3 days of study. The trichobezoars were separated from feces, collected, dried, and washed in ether for complete removal of all fecal material. The results were submitted to repeated-measure analysis of variance and means evaluated by polynomial contrast (P<0.05). Despite changes in gastrointestinal transit time, beet pulp inclusion did not reduce trichobezoar formation and fecal excretion by shorthaired cats (P>0.05) Keywords gastrointestinal transit time, feline, fermentable fiber, trichobezoar 44

71 58 45 Introduction Grooming behavior is part of the feline daily hygiene, and consequently cats swallowed high amounts of hair. Usually this ingested hair is eliminated on feces, however large quantities can accumulate in the digestive tract forming trichobezoars (or hairballs). Hairballs may induce vomiting and can cause digestive problems (Weber et al., 2015; Beynen et al., 2011), mainly for cats predisposed to intestinal obstruction. Some insoluble fibers as sugarcane fiber and cellulose prevent hairballs formation (Weber et al., 2015; Loureiro et al., 2014; Beynen et al., 2011), possibly due to their influence on gastric motility and dynamic of intestinal peristalsis. This insoluble fibers, however, do not contribute to short-chain fatty acid production and related intestinal health benefits (Fischer et al., 2012). Moderate soluble and fermentable fibers, such as beet pulp, promote short-chain fatty acid formation and are capable of altering gastrointestinal transit time (Fahey et al., 1990), but seems to be less effective to prevent hairball formation. To better define this, the present study evaluated the effect of beet pulp on gastrointestinal transit time and trichobezoars fecal excretion on cats fed kibble diets Materials and methods Animals and experimental design All experimental procedures were approved by the Ethics and Animal Welfare Committee of the Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP - Univ Estadual Paulista, Jaboticabal, Brazil (Protocol 3567/15). Eighteen mixed-breed shorthaired cats, with 8.0 ± 1.9 years old, 4.8 ± 1.1 kg of body weight, and mean body condition score of 5.1 ± 0.8 (Laflamme,

72 ) were used. The animals were kept under similar conditions and belonged to the Laboratory of Research on Nutrition and Nutritional Diseases of Dogs and Cats, Jaboticabal, Brazil. The study followed a completely randomized design with three diets and six cats per diet. The experiment lasted 31 days, feces collection for hairball quantification was performed during three periods of three days each: from day 3 to 5; day 15 to 17; day 26 to 28. In the last three days (day 29 to 31) the gastrointestinal transit time of the cats was determined. During adaptation, from 1600 h to 0800 h the cats were restricted to individual stainless steel metabolic cages (0.80 m x 0.80 m x 1.0 m), when their experimental foods and water were available. From 0800 h to 1600 h the cats were kept in a collective cattery of 50 m 2 for exercise and socialization, where they had access to water but not to food. During the fecal collection periods, cats were restrained all times to their cages. The daily amount of food was defined according to the energy maintenance requirements of cats, calculated as 418 kj of metabolizable energy (ME) per kg 0.67 per day. Food ME was estimated from their chemical composition, according to NRC (2006). Offered and refused food was daily weighted, and the consumption recorded Diets Three diets were formulated according to the nutritional recommendations of the European Pet Food Industry Federation (Fediaf, 2011) for adult cats: control diet (BP0) without added beet pulp (34.8% of crude protein; 12.6% of fat; 8.8% of dietary fiber); inclusion of 8% of beet pulp (BP8 -

73 % of crude protein; 13.9% of fat; 17.5% of dietary fiber); inclusion of 16% of beet pulp (PB % of crude protein; 13.3% of fat; 23.8% of dietary fiber). The diets were based on maize (26% to 42%), poultry by-product meal (33%), maize gluten meal (11.9% to 12.4%), poultry fat (7.4 to 7.8%), and minor ingredients (palatant enhancer, salt, potassium chloride, choline chloride, vitamin and mineral supplement, fish oil, mold inhibitor, antioxidant, taurine, DL- Methionine, L-Lysine). The inclusion of beet pulp was in replacement of maize. Minor adjustments in maize gluten meal and poultry fat led to formulations with similar amounts of crude protein and fat. All diets were mixed and ground in a hammer mill (Sistema Tigre de Mistura e Moagem, Tigre, Sao Paulo, Brazil) fitted with a 0.8 mm screen before being extruded and kibbled under similar processing conditions in a single-screw extruder (MEX 250, Manzoni, Campinas, Brazil). Electron micrographs (Scanning Electron Microscope JSM 5410, Jeol Ltda, Akishima, Japan) of the beet pulp used in the experiment were taken to measure the fiber particle size. The beet pulp used was originally pelleted and the ingredient was ground in a hammer mill with the same sieve screen size used for diet preparation (0.8 mm). In order to obtain the ingredient height and length, 15 particles of fiber were measured stablishing the mean and the standard error values Trichobezoar quantification in cat feces The fecal hairball excretion was determined according to Loureiro et al. (2014). During the collection periods, all fecal material was collected from the cages at least two times a day, weighed, pooled by cat and frozen ( 20 C).

74 Prior to analysis, feces were thawed and a 2 g sample were removed to analyze dry matter content. The remaining fecal material was gently washed with tap water over a sieve with 0.8 mm screen size until all fecal material was removed and only hair remained. The remaining trichobezoars were collected and dried in a forced air oven at 55 C for 24 h (320-SE, FANEM, São Paulo, Brasil), and then washed in a 1:1 (v/v) solution of ethylic diethyl ether and petroleum diethyl ether until all foreign materials were removed from the sample. The isolated trichobezoars were classified according to size in small (<1 cm), medium (1.1 2 cm) or large (>2.1 cm), counted and weighed Gastrointestinal transit time Gastrointestinal transit time was evaluated according Burrows et al. (1982). On days 29, 30, and 31 the cats were fed at 1600 h and immediately after the first act of food intake were orally dosed with gelatin capsules containing 12 radiopaque markers (Sitzmarks, Konsyl Pharmaceuticals Inc., Fort Worth, Texas USA). The markers were 4.5 mm in diameter and densities of 1.25 g/ml. On each day a different marker format was utilized, allowing three consecutive observations. The time of the marker administration was registered, and the cages were observed at 2-h intervals until the last marker was recovered in the feces. All feces were collected, weighed and the time of sampling recorded. When the exact time of elimination was not observed, the mean time between samplings was considered for diet comparison. All feces were radiographed and the markers counted. The gastrointestinal transit time was computed as the time interval (in hours) between the food intake and capsule administration and the time of the feces production containing the last marker recovered. The gastrointestinal transit

75 time was the average for the three days of observation. In addition, the marker recovery rate was computed, and to validate the observation a minimum recovery rate of 90% of the markers was established (Loureiro et al., 2016) Statistical analysis Data were analyzed as a completely randomized design, with three diets and six cats per diet, using the General Linear Model procedures of the Statistical Analysis Systems statistical software package version 9.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA). The experimental unit was one cat. Repeated measures analysis of variance (ANOVA) with two inter-animal factors (diet and period) and one intra-animal factor (day of sampling) was the statistical method used to evaluate the effects of diet and time on trichobezoars. When the ANOVA F test results were statistically significant, pair-wise means comparisons were made using Tukey s test. If the diet*time interaction was not significant, the mean of the three periods of evaluation was used to compare the diet effects, and the results were submitted to polynomial contrasts to evaluate the inclusion levels of beet pulp. Data of food intake and gastrointestinal transit time were submitted to analysis of variance, when differences were found on the F tests, results were also submitted to polynomial contrasts. Values of P<0.05 were considered significant, and values of P<0.1 as trend. All data were found to comply with the assumptions of ANOVA models

76 Results The electronic scanning microscopy indicated heterogeneous particles size of the grind beet pulp, with average length and height of 653±187 µm and 346±127 µm, respectively (Figure 1). All diets had good acceptance by the cats, with no episodes of refusals, vomiting or diarrhea. A quadratic effect of beet pulp addition was verified for food consumption (Table 1), with lower intake for the PB8 diet. Feces production increased linearly with beet pulp inclusion (P<0.001), doubling in amount for the PB16 in comparison with the PB0 diet. The gastrointestinal transit time presented a quadratic reduction, with lower values for the PB16 diet (P<0.008). Regarding the hairball fecal excretion, there was no interaction between diet and time for any studied parameter (P>0.05), therefore the observations of the three feces collection periods were combined for analysis. The excretion of trichobezoars in cat feces was similar among foods, both when evaluated in milligrams or number of hairballs per cat per day (P>0.05). The number of tricobezoars per 100g of feces produced tended to be lower for the PB16 food (P=0.063) Discussion In the present study, beet pulp inclusion in dry cat diets did not reduce trichobezoar excretion nor reduced the size of the trichobezoars on feces after 26 days of feeding. The tendency of reduction in trichobezoars numbers per 100 g of feces seems to be an effect of the total amount of feces produced daily, that was higher for cats fed the PB16 food. The cats fed BP8

77 consumed less DM and produced lower amount of feces, thus explaining the numerical increase on hairballs per 100g of feces. The method used in the present study allow identifying direct effects of fibers on hairball excretion via feces, hairballs are easily separate from fecal material during washing, individualized, measured, and weighted. Other methods proposed only studied the amount of hair on feces (Weber, et al., 2015), and not allow to study directly the trichobezoars formation The present findings are in contrast from those reported by Loureiro et al. (2014), after insoluble non-fermentable fiber addition to diets. Those authors found a linear reduction on hairballs number and size in the feces of cats fed diets supplemented with sugarcane fiber. The methodology used by those authors was the same of the present study, and maybe the differences on results could be attributed to differences on the influence of these two fiber sources on gastrointestinal peristalsis. The preventive effect of the fibers on hairball formation has been attributed to alterations on gastric motility and intestinal peristalsis dynamics (Loureiro et al., 2014; Krugner-Higby et al., 1996), and even beep pulp supplementation increasing the gastrointestinal transit time, differences on fiber chemical composition, particle size, soluble to insoluble dietary fiber ratio, and microbial degradation on the gut may not promote reduction of hair entanglement. Purified cellulose, another source of insoluble and non-fermentable fiber was effective in reduce clinical hairball symptoms (Beynen, et al., 2011) and induce higher hair excretion on feces of longhaired cats (Weber, et al., 2015). Thus, is possible that the physicochemical attributes of the fiber are important for their effect on hairballs.

78 Healthy problems related to hairball formation in the gastrointestinal tract include coughing, retching and vomiting, very undesirable by cat owners (Beynen et al., 2011). This condition has been little studied, as well as the potential effect of the dietary intervention to ameliorate the problem (Weber et al., 2015; Loureiro et al., 2014; Dann et al., 2004). It is expected that the hair ingested during grooming be eliminate by vomiting or in the feces, as it structure is hardly digested. It elimination by vomiting is perceived by the owner as a health concern, but in fact it health implication is not completely studied at the moment. On the gastrointestinal tract the swallowed hair can entangled forming trichobezoars. It is believed that a reduction on trichobezoars number or size facilitate they fecal excretion, and reduce the chance of coughing, retching, vomiting or intestinal obstruction. To verify this assumption, however, long-term studies in cats with recurrent hairball problems are necessary. The shedding season seems to be an important factor which influences fecal hair excretion (Hendrix et al., 1998). Coat type is also an issue, long hair cats appear to be more prone to hairball problems and excrete more hair in the feces (Weber, et al. 2015). Unfortunately, none of these factors could be considered during the conduction of the present study, and are limitations to be considered Conclusion Beet pulp addition to extruded diets increase fecal output and reduce gastrointestinal transit time, but do not reduce the number or the size of hairballs eliminated via feces of shorthaired cats.

79 Acknowledgments The authors would like to thank the financial support of Guabi PetCare (Campinas, Brazil) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CnPq) for the first author scholarship References Beynen, A.C.; Middelkoop, J.; Saris, D.H.J., 2011: Clinical signs of hairballs in cats fed a diet enriched with cellulose. American Journal of Animal and Veterinary Sciences 6, Burrows, C.F.; Kronfeld, D.S.; Banta, C.A.; Merritt, A.M., 1982: Effects of fiber on digestibility and transit time in dogs. Journal of Nutrition 112, Dann, J. R.; Adler, M. A.; Duffy, K. L., et al., A potential nutritional prophylactic for the reduction of feline hairball symptoms. Journal of Nutrition , 2124S 2125S Fahey, G.C.; Merchen, N.R.; Corbin, J.E.; Hamilton, A.K.; Serbe, K.A.; Hirakawa, D.A.,1990: Dietary fiber for dogs: II. Iso-total dietary fiber (TDF) additions of divergent fiber sources to dog diets and their effects on nutrient intake, digestibility, metabolizable energy and digesta mean retention time. Journal of animal science, Fediaf, 2011: Nutritional Guidelines for complete and complementary pet food for cats and dogs, European Pet Food Industry Federation. Brussels, Belgium.

80 Fischer, M.M.; Kessler, A.M.; Sá, L.R.M.; Vasconcellos, R.S.; Roberti Filho, F.O.; Nogueira, S.P.; Oliveira, M.C.C.; Carciofi, A.C., 2012: Fiber fermentability effects on energy and macronutrient digestibility, fecal parameters, postprandial metabolite responses, and colon histology of overweight cats. Journal of Animal Science 90, Hendriks W.H., Tartellin M.F. & Moughan P.J., Seasonal hair loss in adult domestic cats (Felis catus). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition 79, Krugner-Higby, L.; Wolden-Hanson, T.; Gendron, A.; & Atkinson, R. L.,1996: High prevalence of gastric trichobezoars (hair balls) in Wistar-Kyoto rats fed a semi-purified diet. Laboratory animal science, Laflamme, D.P., 1997: Development and validation of a body condition score system for cats: a clinical tool. Feline Practice 25, Loureiro, B.A.; Sembenelli, G.; Maria, A.P.J.; Vasconcellos, R.S.; Sa, F.C.; Sakomura, N.K.; Carciofi, A.C., 2014: Sugarcane fibre may prevents hairball formation in cats. Journal of Nutritional Sciences 3, e Loureiro, B. A.; Sakomura, N. K.; Vasconcellos, R. S.; Sembenelli, G.; Gomes, M. O. S.; Monti, M.; Malheiros, E. B.; Kawauchi, I. M.; Carciofi, A. C., 2016: Insoluble fibers, satiety and food intake in cats fed kibble diets. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. IN PRESS NRC, National Research Council 2006: Nutrient Requirements of Dogs and Cats. National Academy Press, Washington, DC, USA.

81 Weber, M., Sams, L., Feugier, A., Michel, S. and Biourge, V., 2015: Influence of the dietary fibre levels on faecal hair excretion after 14 days in short and long-haired domestic cats. Veterinary Medicine and Scienc, 1,

82 Table 1 Food intake, fecal production, gastrointestinal retention time, and trichobezoars on feces of cats fed kibble diets with increasing additions of beet pulp Item Diets* Contrasts S.E.M P value BP0 BP8 BP16 Linear Quadr Food Intake (g DM/cat/day) ns ** Feces production g/cat/day (As-is basis) <0.001 <0.001 ns g/cat/day (DM basis) ns Gastrointestinal retention time (h) ns Trichobezoars mg/cat/day ns ns mg/g of feces DM ns ns Number total /100g of fresh feces ns Number small/cat/day ns ns Number medium/cat/day ns ns Number large/cat/day ns ns Number total/cat/day ns ns * PB0: control diet, without beet pulp; PB8: supplemented with 8% of beet pulp; PB16: supplemented with 16% of beet pulp S.E.M. = standard error of the mean (n = 6 cats per treatment) Linear or quadratic effects of beet pulp addition Results are the mean of the three feces collection periods ** Not significant (P>0.05).

83 55 Figure 1. a1) Scanning electron micrograph of a grind sample of the beet pulp used in the experiment, increase of 200x. a2) Scanning electron micrograph of a grind sample of the beet pulp used in the experiment, increase of 35x. b1) Picture of a large, medium and small trichobezoar collected from a cat feces