Questionário - Proficiência Clínica

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1 Tema QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS CD34+ POR CITOMETRIA DE FLUXO Elaborador Dr Igor Couto da Cruz, Biomédico, Mestre em Ciências Morfológicas da UFRJ, responsável pela área de citometria de fluxo do Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho- UFRJ, Gestor Corporativo da área de citometria de fluxo do Laboratório Diagnósticos da América Questão 1 O anticorpo CD34 identifica uma glicofosfoproteína monomérica transmembranica de aproximadamente 110 KDa O CD34 foi classificado no terceiro Human Leukocyte Differentiation Antigens Workshop em março de 1987, onde se definiu as reatividades que este anticorpo apresenta Sendo estas: 1 Stem cell, progenitores hematopoiéticos comissionados, Stem cell endotelial, Stem cell mesenquimal medular 2 Stem cell hematopoiética, progenitores mielóide, plaquetas, Stem cell endotelial 3 Stem cell hematopoiética, progenitores hematopoiéticos comissionados, célula endotelial de pequenos vasos 4 Stem cell hematopoiética, progenitores linfóides, Stem cell endotelial, Stem cell mesenquimal Questão 2 O epitopo reconhecido pelo CD34 foi categorizado em 3 classes, dependendo de sua sensibilidade às enzimas neuraminidase e a glicoprotease Dessa forma, como foram denominadas as classes? 1 Classe I : reconhece o epitopo sensível as duas enzimas, Classe II : reconhece o epitopo sensível somente a glicoprotease, Classe III : reconhece o epitopo insensível as duas enzimas 2 Classe I : reconhece o epitopo insensível as duas enzimas, Classe II : reconhece o epitopo sensível somente a neuraminidase, Classe III : reconhece o epitopo sensível as duas enzimas 3 Classe I : reconhece o epitopo insensível as duas enzimas, Classe II : reconhece o epitopo sensível somente a neuraminidase, Classe III : reconhece o epitopo sensível a glicoprotease 4 Classe I : reconhece o epitopo sensível as duas enzimas, Classe II : reconhece o epitopo sensível somente a glicoprotease, Classe III : reconhece o epitopo sensível a neuraminidase quando incubado a 20ºC Questão 3 As características estruturais citadas na questão 2, também tem impacto na especificidade da reação Assim, uma das classes não apresenta bons resultados para uso em amostras clínicas por apresentar dependência ao ácido siálico e conseqüente inabilidade para detectar todas as glicoformas do CD34 Qual é esta classe e quais seus clones mais comuns: 1 Classe I, Clones: MD342, B-G25, B-H21, My10, ICH3, Immu133, 14G3, ICO Classe II, Clones: QBEnd10, 43A1, MD343, MD342, 4A1, 9044, Classe III, Clones: TUK3, 1152, 8G12, CD34-9F2, 581, 553, 563, Birma-K3, BF23, 6A6, 7E10, 4H11 4 Classe I, Clones :128, BI3C5, Immu409, B-G25, B-H21, My10, ICH3, Immu133, 14G3, ICO-115 Questão 4 Os histogramas abaixo são da analise de um aspirado de medula óssea com marcação de CD45-FITC e CD34-PE Identifique as principais populações seguindo respectivamente as cores verde, azul e vermelha 1 (Linfócitos), (stem cell hematopoiética), (precursores eritróides); 2 (Linfócitos T), (precursores eritróides, plaquetas, debris), (stem cell hematopoiética); 3 (Linfócitos), (stem cell hematopoiética), (precursores eritróides, plaquetas, debris); 4 (Linfócitos), (stem cell), (plaquetas) Página 1 de 6

2 Questão 5 Diversos protocolos para quantificação de células CD34 foram desenvolvidos Sempre com o objetivo de aumentar a sensibilidade e a especificidade Dos protocolos citados abaixo, qual associou o CD45 ao CD34 de forma a valorizar a intensidade de fluorescência do CD45 para detecção de células blásticas? 1 Mulhouse; 2 Sihon; 3 NCCLS; 4 ISHAGE Questão 6 Para o desenvolvimento de um protocolo por citometria de fluxo capaz de detectar células tronco hematopoiéticas em aspirado de medula, sangue periférico e etc, foi necessário definir biologicamente suas características físicas e imunofenotípicas Sabendo disto, quais as características básicas para o reconhecimento destas células: 1 Mononuclear, CD34+, CD45+ fraca intensidade, glicoforina A +; 2 Granular, CD34+, CD45+ fraca intensidade, Glicoforina A +; 3 Mononuclear, CD34+, CD45+ fraca intensidade, glicoforina A -; 4 Mononuclear, CD34 -, CD45+ fraca intensidade, glicoforina A - Questão 7 Identifique nas estratégias de gate os tipos de protocolos utilizados para quantificação de células CD34+: 1 A- ISHAGE, B- Sihon, C- Milan-Mulhouse; 2 A- Milan-Mulhouse, B- ISHAGE, C- Sihon; 3 A- Sihon, B- ISHAGE, C- Milan-Mulhouse; 4 A- Milan-Mulhouse, B- ProCount, C- Sihon Página 2 de 6

3 Questão 8 Baseado no protocolo ISHAGE identifique quais erros estão presentes na estratégia de GATES abaixo: 1 Plot 1, falta o R2 Plot 2, correto Plot 3, o R5 está errado e falta o R2 Plot 4, falta o R3 Plot 5, correto Plot 6, correto 2 Plot 1, correto Plot 2, correto Plot 3, o R5 está errado e falta o R2 Plot 4, falta o R3 Plot 5, correto Plot 6, correto 3 Plot 1, correto Plot 2, o R2 está errado e falta o R3 Plot 3, o R5 está errado e falta o R2 Plot 4, falta o R3 Plot 5, correto Plot 6, correto 4 Plot 1, correto Plot 2, correto Plot 3, correto Plot 4, correto Plot 5, correto Plot 6, correto Questão 9 Com o objetivo de excluir células mortas e em apoptose, além de avaliar a qualidade da amostra estudada, foi acrescentado à técnica um corante supravital de DNA Este procedimento evita a inclusão estatística de células não viáveis que se coram inespecificamente podendo superestimar a contagem de células CD34+ Das opções abaixo, qual a que melhor se enquadra ao protocolo ISHAGE? 1 7AAD; 2 Iodeto de propidium; 3 LDS751; 4 DRAQ5 Página 3 de 6

4 Questão 10 Que avanço ocorreu nos protocolos de quantificação de células CD34 que propiciou a exclusão do erro intrinseco proveniente dos contadores hematológicos, eliminou a inclusão de eritroblastos no total de leucócitos que ocorre em alguns contadores hematológicos e reduziu a manipulação da amostra? 1 O uso de particulas de látex (beads); 2 O uso de Pipetagem reversa; 3 O uso de homogeinizador orbital; 4 O uso de iodito de propidium Questão 11 Nas últimas duas décadas, tem se observado um importante movimento científico com objetivo de definir as funções, propriedades e aplicações das células tronco Neste movimento, surgiu a Terapia Celular, área de biologia celular e engenharia tecidual, que surge como um novo recurso da medicina para a recuperação de tecidos lesados nas mais diversas patologias Atualmente, inúmeros protocolos clínicos, usando células tronco das mais diversas origens teciduais, estão em andamento, e suas definições científicas em breve estarão disponíveis Assim, podemos afirmar que, a definição de célula tronco hematopoiética é: 1 São células com a habilidade de se diferenciar em células especializadas dentro e fora da medula em resposta a uma sinalização apropriada Estas células estão localizadas em nichos na medula óssea em estreito envolvimento com o estroma medular apenas na infância; 2 São células pluripotentes com a habilidade de se diferenciar em células especializadas dentro da medula em resposta a processos infecciosos Estas células estão localizadas em nichos na medula óssea em estreito envolvimento com o estroma medular somente no adulto; 3 São células multipotentes com a habilidade de se auto-renovar e se diferenciar em células especializadas em resposta a uma sinalização apropriada Estas células estão localizadas em nichos na medula óssea em estreito envolvimento com o estroma medular; 4 Todas as respostas acima Questão 12 No protocolo ISHAGE há a instrução de adquirir no citômetro mais de eventos, sendo, com no mínimo de 100 células CD34+ Esta recomendação tem o objetivo de obter um coeficiente de variação máximo de: 1 1%; 2 5%; 3 10%; 4 2% Questão 13 Quais as aplicações clínicas da quantificação de células CD34+? Escolha as opções corretas: a) Determinar a quantidade de células CD34+ em sangue periférico de doador ou paciente (transplante alogênico ou autólogo) estimulados com fatores de crescimento hematopoiético avaliando se houve mobilização periférica suficiente para a realização do transplante b) Determinar a quantidade de células CD34+ em produtos de aférese ou de aspiração de medula óssea que posteriormente serão infundidos no paciente receptor c) Determinar a quantidade de células CD34+ em sangue de cordão umbilical antes e após congelamento d) Determinar a quantidade de células CD34+ nas células mesenquimais humanas em cultura antes de ensaios de diferenciação celular 1 A, B e C; 2 A, B e D; 3 B, C e D; 4 A, B, C e D Página 4 de 6

5 Questão 14 Quais são os procedimentos diário de controle de qualidade para se realizar a quantificação de células CD34+? Escolha as opções corretas a) Monitorar o coeficiente de variação de cada fotomultiplicador através do pico de cada fluorescência b) Verificar a compensação entre cores c) Utilizar controles celulares comercias CD34+ d) Manter os anticorpos monoclonais refrigerados e protegidos da luz e) Utilizar pipetagem reversa 1 A, B, C e E; 2 A, B, C, D e E; 3 A, C, D e E; 4 B, C e D Questão 15 No procedimento técnico do Protocolo ISHAGE, qual é o método utilizado? 1 Sangue lavado+monoclonais / lise / lavagem; 2 Sangue lavado+monoclonais / lise / sem lavagem ; 3 Sangue+Monoclonais / lise / lavagem; 4 Sangue+Monoclonais / lise / sem lavagem Página 5 de 6

6 Referências Bibliográficas: Boletim 9275 Beckman Coulter Cell Analysis 2003 Catherine M Kolf, Elizabeth Cho and Rocky S Tuan Review, Mesenchymal stromal cells, Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation Arthritis Research & Therapy 9:204,2007 D Barnett, G Janossy, A Lubenko, E Matutes, A Newland & JT Reilly Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells Clin Lab Haem, 21, ,1999 F LANZA, L HEALY, DR SUTHERLAND Structural and functional features of the CD34 antigen: an update Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents- Review February 1, 2001 Flow Cytometry and Sorting, Myron R Melamed, Tore Lindino, Mortimer L Mendelsohh Secund edition Wiley-Liss Flow Cytometry Clinical Applications Marion G Macey Blackwell Scientific Geir E Tjrannfjord, Rita Steen, Stein A Evensen, Erik Thorsby, and Torstein Egeland Characterization of CD34' Peripheral Blood Cells From Healthy Adults Mobilized by Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor The American Society of Hematology 1994 Hematology-Basic Principles and Practice Ronald Hoffman Fourth edition Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow:Reference Patterns for Age-Related Changes and Disease-Induced Shifts EG van Lochem,* VHJ van der Velden, HK Wind, JG te Marvelde, NAC Westerdaal, and JJM van Dongen Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 60B:1-13 (2004) Jiwang Zhang, Chao Niu, Ling Ye, Haiyang Huang, Xi He, Wei-Gang Tong, Jason Ross, Jeff Haug, Teri Johnson, Jian Q Feng, Stephen Harris, Leanne M Wiedemann, Yuji Mishina & Linheng Li Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size Nature 425, October 2003 JW GRATAMA, D R SUTHERLAND, M KEENEY, S PAPA Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents January 24, 2001 M KEENEY, W BROWN, J GRATAMA, S PAPA, F LANZA, DR SUTHERLAND Appendix 1: Autostandardization and compensation for CD34 analysis (Beckman-Coulter XL Flow Cytometer - System II Software) J Biol Regul Homeost Agents 17: Nydia S Bacal, Joao CC Gerra, Euripedes Ferreira, Sonia T Nozawama Ruth H Kanayama Daniel Di Pietro, Jacyr Pasternack, Nelson Hamerschack, Luis GM Rosenfeld Quantificação de células CD34+ em sangue, produto de aférese e cordão umbilical : estudo comparativo de tres diferentes metodologias Revist Bras Hematolhemotet,23(2): Pratical Flow Cytometry Howard M Shapiro Fourth Edition Wiley-Liss Xu Wu, Sheng Ding, Qiang Ding, Nathanael S Gray, and Peter G Schultz Small Molecules that Induce Cardiomyogenesis in Embryonic Stem Cells Jacs communications October 8, 2003 Página 6 de 6