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- Bruno Dias Affonso
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1 ix LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1 - Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) e suas diferentes causas no Brasil em FIGURA 2 - Biosíntese de óxido nítrico (NO) FIGURA 3 - Intracelular cross talk entre a sinalização da óxido nítrico sintase endotelial (enos) e a ativação do receptor do fator de crescimento vascular endotelial tipo 2 (VEGFR2/ Flk-1/ KDR) pelo VEGF e suas principais funções FIGURA 4 - Visão esquemática dos mecanismos intracelulares mediados pela família Bcl-2 ( linfoma de células B 2 ), uma família de proteínas indutoras e repressoras de morte por apoptose FIGURA 5 - Visão esquemática das vias de sinalização de VEGF/VEGFR2 que promovem sobrevida celular e angiogênese FIGURA 6 - Participação das CPE na reconstrução e formação de vasos sanguíneos FIGURA 7 - Mecanismos de homing e diferenciação de CPE FIGURA 8 - Efeito do treinamento físico aeróbio sobre as CPE FIGURA 9 - Balanço entre o reparo e o dano vascular. Fatores de risco cardiovascular causam doenças cardiovasculares mediante prejuízo na bioatividade das CPE FIGURA 10- Aparato de treinamento físico de natação para ratos FIGURA 11- Sistema em esteira rolante para avaliação do esforço físico máximo FIGURA 12- Extração do tecido muscular esquelético. (A) Retirada do músculo sóleo. (B) Corte transversal com lâmina nova sobre base rígida. (C) Massa de montagem à base de tissue tek sobre a placa onde
2 x foi identificada a amostra. (D) O tecido sobre a massa de montagem que serviu como apoio para a permanência na posição correta pré congelamento FIGURA 13- Congelamento e cortes do tecido. (A) Isopentano refrigerado em nitrogênio líquido. Quando o isopentano fica com a base congelada é o ponto ótimo para imersão do tecido. (B) Tecido é introduzido no isopentano durante 10 segundos (C) e posteriormente transferido para tubo de 50 ml contendo nitrogênio líquido. (D) Conservação em nitrogênio líquido a aproximadamente -196ºC (E) Criostato Mícron HM505E FIGURA 14- Análise microscópica do corte histológico do músculo em diferentes phs: 10.3 (A) e 4.3 (B) de um rato controle FIGURA 15- Análise microscópica da capilarização no músculo sóleo em rato controle, ph As setas indicam os capilares FIGURA 16- Processo de extração e cultivo das células mononucleadas (CMN) da medula óssea (MO) e sangue periférico (SP) FIGURA 17- Imagens representativas da marcação das CMN com anticorpos fluorescentes para Lectina-FITC (verde), Di-acLDL (vermelho) e a dupla marcação para identificação das CPE FIGURA 18- Imagens representativas de FACS da marcação das CMN com anticorpos fluorescentes para CD34+PE, Flk1+FITC e a dupla marcação (CD34+/Flk1+) para quantificação das CPE FIGURA 19- Imagens representativas do ensaio funcional das CPE na formação de tubos como capilares sobre matrigel capturadas pelo microscópio invertido com amplificação de 200x (A) e 400x (B) FIGURA 20- Caracterização fenotípica de SHR. Pressão Arterial Sistólica (PAS), Média (PAM) e Diastólica (PAD) (A); razão capilar por fibra no músculo sóleo (B); área de secção transversa do sóleo (C); proporção de tipos de fibra no sóleo (D); tolerância à realização de esforços físicos (E) e consumo máximo de oxigênio (F) em ratos WKY e SHR... 59
3 xi FIGURA 21- Caracterização das CPE em SHR. Número das CPE na medula óssea (MO) através da dupla marcação para Di-acLDL e Lectina- FITC (A), senescência celular associada a β- galactosidase (SAβ-Gal) na MO (B), ensaio funcional de unidade formadora de colônia na MO (C), formação de tubos como capilares sobre matrigel na MO (D), porcentagem de CMN positivas para CD34+/Flk1+ no sangue periférico (SP) (E) e ensaio funcional de unidades formadoras de colônia no SP (F) em WKY e SHR FIGURA 22- Massa corporal e gordura reto peritoneal FIGURA 23- Parâmetros Hemodinâmicos. Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD), Pressão Arterial Média (PAM) e Freqüência Cardíaca (FC) de repouso Pré TF (A) e Pós TF (B) de ratos WKY e SHR submetidos ao protocolo experimental FIGURA 24- Teste de esforço físico máximo. Velocidade (A), Tempo (B) e Distância Percorrida (C) Pré e Pós TF FIGURA 25- Consumo de oxigênio pico pré e pós TF FIGURA 26- Atividade da enzima citrato sintase no músculo sóleo representada em valores de nmol. min -1. mg de proteína FIGURA 27- Caracterização histoquímica do sóleo pela reação ATPase miosínica. Razão capilar por fibra (A), área de secção transversa das fibras musculares do tipo I, II e intermediárias (B), distribuição dos tipos de fibra (C) e imagens representativas dos cortes histológicos de secções transversas do músculo (D) FIGURA 28- Efeito do TF aeróbio sobre o número de CPE da medula óssea na HA. Fotos representativas da fluorescência para Di-acLDL e Lectina-FITC e as células duplamente positivas identificando as CPE (A). Análise quantitativa das CPE (B) FIGURA 29- Efeito do TF aeróbio sobre a senescência das CPE da medula óssea na HA. A senescência foi avaliada pela atividade da β- galactosidase (SA- β-gal) (A). Fotos representativas do ensaio de SA- β-gal de cada grupo estudado. As setas indicam as células
4 xii senescentes marcadas em azul (B) FIGURA 30- Efeito do TF aeróbio sobre as unidades formadoras de colônia das CPE da medula óssea na HA. A função das CPE foi avaliada pela capacidade de formação de unidade formadora de colônia (A). Foto representativa do 2º dia do plaqueamento das CPE e ao 7º dia já contendo a colônia de células, além das fotos da formação de colônias de cada grupo estudado. As setas indicam as colônias (B) FIGURA 31- Efeito do TF aeróbio sobre a formação de tubos como capilares das CPE da medula óssea na HA. Fotos representativas do ensaio funcional das CPE pela análise qualitativa da capacidade de formação de tubo como capilar sobre matrigel FIGURA 32- Efeito do TF aeróbio sobre o número de CPE do sangue periférico na HA. Porcentagem de CMN CD34+/Flk1+ do sangue periférico analisadas por citometria de fluxo (A). Correlação entre o VO 2 e os níveis de CMN CD34+/Flk1+ (B). Correlação entre a razão capilar por fibra muscular esquelética e os níveis de CMN CD34+/Flk1+ (C) FIGURA 33- Efeito do TF aeróbio sobre as unidades formadoras de colônia das CPE do sangue periférico na HA. A função das CPE foi avaliada pela capacidade de formação de unidade formadora de colônia (A). Correlação entre o VO 2 e as unidades formadoras de colônia (B). Correlação entre a razão capilar por fibra muscular esquelética e as unidades formadoras de colônia (C) FIGURA 34- Efeito do TF aeróbio sobre os níveis de VEGF circulante na HA FIGURA 35- Efeito do TF aeróbio sobre os fatores angiogênicos e mobilizadores de CPE na HA. Blots representativos de VEGF, VEGFR1, VEGFR2, enos, inos e GAPDH de WKY, WKY-T, SHR, SHR-T (A). Níveis protéicos de VEGF, VEGFR1, VEGFR2, enos e inos no músculo sóleo analisados por western blot, respectivamente (B-F). As bandas alvo foram normalizadas pela
5 xiii proteína GAPDH muscular esquelética FIGURA 36- Efeito do TF aeróbio sobre as proteínas regulatórias da apoptose no músculo esquelético na HA. Blots representativos de Bcl-2, Bcl-x, Bad, p-bad ser112 e GAPDH de WKY, WKY-T, SHR, SHR-T (A). Níveis protéicos de Bcl-2, Bcl-x, Bad e p-bad ser112 no músculo sóleo analisados por western blot, respectivamente (B-F). As bandas alvo foram normalizadas pela proteína GAPDH muscular esquelética FIGURA 37- Mecanismo hipotetizado de sinalização de sobrevivência celular e angiogênese mediado pela interação VEGF-VEGFR2: prejuízo na HA e correção pós TF FIGURA 38- Regeneração da microcirculação muscular esquelética induzida pelo TF após lesão vascular pela HA. A) A HA lesa o endotélio e, como conseqüência, causa apoptose e descamação de células endoteliais, contribuindo para a rarefação microvascular. B) O processo regenerativo endotelial mediado pelo TF pode ocorrer por duas vias: pela proliferação e migração de células endoteliais maduras localizadas na vizinhança da célula endotelial lesada por meio de liberação de fatores de crescimento vascular (VEGF e NO) e pela migração de CPE da medula óssea na parede vascular, liberando também fatores angiogênicos, ou pela incorporação direta das CPE circulantes no endotélio
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