Imunofenotipagem nas Doenças Hematológicas: Pré analítico Nydia Strachman Bacal

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2 Imunofenotipagem nas Doenças Hematológicas: Pré analítico Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica

3 Fase pré - analítica Recepção e cadastro - Nome do Exame Indicação do exame papel do patologista clínico Identificação do paciente Coleta material preferencial / alternativo Anticoagulante Volume mínimo Transporte temperatura da amostra Estabilidade da amostra Rejeição

4 Recepção/Cadastro - Nome do Exame

5 CD34, Diversos, Citometria de Fluxo CD34 - Contagem de Células Stem Cell, diversos Contagem de Células Stem Cell - CD34, diversos Contagem de Células CD34+, Diversos CD34, Cordão Umbilical CD34, Medula Óssea CD34, Produto de Aferese Imunofenotigem CD34, Cordão Umbilical Imunofenotigem CD34, Medula Óssea Imunofenotigem CD34, Produto de Aferese Quantificação de Células Tronco - CD34, Medula Óssea Quantificação de Células Tronco - CD34, Produto de Aferese Células Progenitoras Hematopoiéticas CD34, Medula Óssea Células Progenitoras Hematopoiéticas CD34, Produto de Aferese Células Progenitoras Hematopoiéticas CD34, Outros Materiais Citometria de fluxo para CD34, Diversos Células CD34 por Citometria de Fluxo, Diversos

6 Indicação do exame papel do patologista clínico Sangue Periférico Pancitopenia, HPN Anemias: AHAI, Detecçãode hemorragia fetomaterna Plaquetopenias: Imunológica, Disfunção plaquetária (Trombastenia de Glansman, S. Bernard Soulier ) Linfócitos: Linfocitose (reacional x maligna e B,T, NK) Linfocitos atípicos ou anômalos Quantificação de subpopulações linfocitárias em imunodeficiência congênita e adquirida, transplantes hematológicos e órgãos sólidos Cross-Match, HLA B27 (espondilite anquilosante) Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 70B:39-44(2005)

7 Indicação do exame papel do patologista clínico Sangue Periférico Monocitose: LMMoC e LA Plasmocitose Células imaturas / anômalas Quantificação de células progenitoras (CD34+) Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 70B:39-44(2005)

8 Indicação do exame papel do patologista clínico Medula Óssea Diagnóstico (D.), Classificação (C.), Prognóstico (P.) Monitoramento (M.) : Leucemias agudas (C.P.M.) Doenças Linfoproliferativas Crônicas (D.C.P.M.) Gamopatia monoclonal de Significado Indeterminado (D.P.M.) Mielodisplasia (D.C.P.M.) Doenças Mieloproliferativas Crônicas (M.P.) Doença Residual Mínima Detecção de infiltração neoplásica por células não hematopoéticas Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 70B:39-44(2005)

9 Identificação do paciente Procedência de Imunofenotipagens em Doenças Oncohematológicas HospitaI Israelita Albert Einstein HIAE: 40,1% Laboratórios Externos: 59,9% Dados Setor de Citometria de Fluxo HIAE Agosto/2011 Informações pré analíticas Nome, Idade, Sexo, história clínica, exame físico, H.D. Serviço e médico solicitantes Resultados de Hg, DHL, Mielograma, Citoquímicas, citogenética e A.P. Resultados anteriores de imunofenotipagem se forem realizados em outros serviços. Tratamentos realizados, G-CSF Qt, Rt, anti-cd20,... Submetido a TMO, tipo de TMO Data do TMO

10 Coleta S.P. / M.O. preferencial: Edta- k 3, podendo coletar em heparina sódica/lítica Enviar laminas não coradas preferencialmente sem anticoagulante / coradas Volume S.P. 3 tubos com 3ml M.O. 2 tubos com 2 ml Obs.: no caso de coleta de citogenética não misturar os 2 tipos de anticoagulantes NÃO REFRIGERAR temperatura de 18 a 22 C Estabilidade: Coleta em Edta- k 3 : 24 horas. Chegar em nosso serviço no máximo em 18 horas da coleta CLSI vol.27nº11 H43-A Vol.18 Nº

11 Coleta Amostras inadequadas HEMODILUÍDAS PRESENÇA DE COÁGULO BAIXA VIABILIDADE QUANTIDADE DE AMOSTRA INSUFICIENTE BAIXA CELULARIDADE

12 Coleta Biópsia de Ganglio / Baço - Enviar em gase embebida em solução fisiológica 0,9%, o mais rápido possível - Enviar em meio de cultura ex.: RPMI Aspiração com agulha fina - Enviar em meio de cultura ex.: RPMI Liquor - 25 ml em tubo estéril encaminhar no máximo em 3 horas da coleta / meio de cultura ex.: transfix CLSI vol.27nº11 H43-A Vol.18 Nº

13 Liquor Coleta Execução depende do número de células e da viabilidade celular Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, punção de nódulos Execução depende do número de células e viabilidade celular da É possível utilizar estabilizantes, ex: Transfix CLSI vol.27nº11 H43-A Vol.18 Nº

14 Produtos de aférese ACD (ácido cítrico dextrose) Estabilidade: até 12 h à 4 C número de células / refrigeração Pré e pós congelamento mais rápido possivel viabilidade celular Sangue de cordão umbilical Volume de amostra e hemólise (Tampão de lise: cloreto de amonea) Viabilidade celular 7-AAD ( 7- Aminoactinomicina) PI (Iodeto de Propidium) CLSI vol.27nº11 H43-A Vol.18 Nº

15 Asseguramento da Qualidade Rotinas Operacionais: Procedimentos de padronização e calibração Garantir alinhamento e focalização de todas as lentes, em ambos os caminhos, da fonte de luz excitadora e dos detectores de sinal de dispersão e fluorescência Garantir a detecção adequada do sinal de fluorescência (padrão fluorescente por fluorocromo através de beads ou células fixadas) Controlar soluções e reagentes Estabelecer critérios na escolha de painéis de anticorpos monoclonais Registrar, monitorar, estabelecer limites aceitáveis e ações corretivas CLSI vol.27nº11 H43-A Vol.18 Nº

16 CITOMETRIA DE FLUXO x ANATOMIA PATOLÓGICA 10 ANOS NA INVESTIGAÇÃO DE DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS EM ADENOMEGALIAS E NÓDULOS 157 amostras de biópsias ou punções aspirativas de gânglios ou nódulos em 142 pacientes durante o período de 1999 a homens / 67 mulheres Idade mediana de 55 anos (4 a 92 anos) 119 pacientes - biopsias, 16 pacientes PAAF, 7 pacientes - PAAF seguidos de biopsia Diagnósticos concordantes em 115 pacientes (81%) Revista einstein. Vol 9 nº2 Junho 2011

17 Relação dos pacientes segundo o diagnóstico anatomopatológico e tipos de coleta do material Diagnóstico AP Nº Pacientes (%) Pacientes Nº PAAF Nº PAAF + Biopsia Nº Biopsia LNH-B 73 51, Reacional 26 18, LNH-T 7 4, Prolif. Atípica 5 3, Inflam. Granulomatosa 5 3, Não Hematológica 5 3, Sarcoma Granulocítico 2 1, Timoma 2 1, Bifenotípica 1 0, Plasmocitoma 1 0, LH 15 10, Total Revista einstein. Vol 9 nº2 Junho 2011

18 Concordância de Diagnósticos (%) Percentagem de Diagnósticos Concordantes entre AP e ICF 100,0 90,0 80,0 70,0 86,3 100,0 71,4 80,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 6,7 0,0 LNH-B: Linfoma Não Hodgkin B (n=73); Reacional: Hiperplasia linfóide reacional (n=26); LNH-T: Linfoma Não Hodgkin T (n=7); Prolif. Atípica: Proliferação linfóide atípica (n=5); Inflam. Granulomatosa: Inflamações crônicas granulomatosas (n=5); Não Hematológica: inclui carcinomas, adenocarcinomas e melanoma (n=5); Bifenotípica: Leucemia bifenotípica (n=1); LH: Linfoma de Hodgkin (n=15). Sarcoma Granulocítico (n=2); Timoma (n=2); Plasmocitoma (n=1). Diagnóstico A.P. Diagnóstico AP Revista einstein. Vol 9 nº2 Junho 2011

19 Diagnósticos discordantes Linfoma de HodgKin 14 pacientes Linfoma de Células B rico em células T e Histiócitos 2 pacientes Linfoma Difuso de Grandes Células B 6 pacientes Linfoma Linfoblástico / Leucemia Linfoblástica de Células B Precursoras 1 paciente Linfoma Não Hodgkin de células B da zona Marginal (MALT) comprometimento focal do gânglio 1 paciente Revista einstein. Vol 9 nº2 Junho 2011

20 O cálculo dos testes da Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo em relação ao estudo Anatomopatológico (gold stardard) Sensibilidade: 0,77 Especificidade: 0,97 Valor Preditivo Positivo (VPP): 0,77 Valor Preditivo Negativo (VPN): 1,00 Revista einstein. Vol 9 nº2 Junho 2011

21 OBRIGADA PELA ATENÇÃO! Nydia S. Bacal Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE Ana Carolina Apelle João Carlos de C. Guerra Rodolfo Patussi Correia Ruth Hissae Kanayama Sonia Tsukasa Nozawa Welbert de Oliveira Pereira